Tetracistronicミニゲノムを含むウイルス様粒子とバイオセーフティレベル2の条件の下ではエボラウイルスのライフサイクルのモデル化

本実験の全体的な目的は、バイオセーフティレベル2の条件下で、強毒性であるエボラウイルスのライフサイクルをモデル化することです。これは、エボラウイルス粒子と同じタンパク質組成を持ちながら、ウイルスゲノムの代わりにミニゲノムを保持するウイルス様粒子を作製することで達成されます。ミニゲノムとは、ウイルスゲノムの小型版であり、ウイルスの遺伝子が除去され、代わりにルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子が組み込まれたものです。

重要な点として、本実験で使用されるミニゲノムには、ウイルス蛋白であるVP40、GP-1、GP-2、およびVP24をコードする複数のウイルス遺伝子が依然として含まれています。ウイルス様粒子は、プロデューサー細胞と呼ばれる293T細胞において、ミニゲノムを、RNP蛋白とも呼ばれるウイルス蛋白（NP、VP35、VP30、L）と共に発現させることで作製されます。

その後、ミニゲノムはウイルス蛋白質によって複製され、mRNAへと転写されます。これらのmRNAは、ルシフェラーゼリポーターおよび追加のウイルス蛋白質であるVP40、GP-one two、VP24をコードしています。これら3つの蛋白質が共存することで、ウイルス様粒子の産生が導かれます。これらは、内部のヌクレオカプシドがゲノム複製および転写を行う能力を持つため、転写複製能を有するウイルス様粒子（TRVLP）と呼ばれます。TRVLPはエボラウイルス糖蛋白質GP-one twoを保持しているため、標的細胞に感染させることが可能です。

これらの標的細胞には、np、VP35、VP30、およびLの発現プラスミドがあらかじめ導入されています。これらのRNPタンパク質が共同して、TRVLP内部で標的細胞に導入されたミニゲノムを認識します。その後、ミニゲノムが複製および転写され、レポーター活性が生じるとともに、新たなTRVLPが産生されます。この産生されたTRVLPを用いて、再び新しい標的細胞に感染させることが可能です。

重要な点として、ミニゲノムは自身の複製に必要な遺伝情報を保持していません。したがって、TRVLPsは4つのRNPタンパク質を発現していない細胞に感染して増殖することはできません。この特性により、本システムはバイオセーフティーレベル2の条件下で安全に使用することが可能です。

この手法の主な利点は、バイオセーフティーレベル2の条件下で、ゲノム複製、ウイルス遺伝子産物の発現、ウイルス粒子の産生、および複数回の注入因子サイクルにわたる標的細胞への感染を含む、ウイルスライフサイクル全体をモデル化できることです。これにより、生きたエボラウイルスを扱う際に必要となる最大封じ込め施設（BSL-4等）を使用せずに、この研究を行うことが可能になります。本手法は、細胞因子のRNA介在性ノックダウンやそれらの因子の過剰発現などの他の手法と組み合わせることで、ウイルス生物学におけるこれらの因子の役割を研究することができます。また、ウイルス遺伝子に突然変異を導入することで、ウイルス生物学におけるこれらのウイルス遺伝子および遺伝子産物の役割を研究することも可能です。

コンフルエンシーが80～90%に達した293T細胞から培地を除去し、PBSで2回洗浄した後、トリプシン2 mLを添加して細胞を剥離させます。細胞が丸くなるまで待ちます。

次に、フラスコを軽く叩いて細胞を剥離させ、10% FBSを含む培地を8 mL加えて細胞に加えます。自動細胞計数器を用いて細胞数を計測し、細胞密度を2 × 10⁵ cells/mLに希釈して、6ウェルプレートの各ウェルに2 mLずつ播種します。細胞を5% CO2濃度の37 °C加湿インキュベーターに戻します。24時間後、TRVLPの産生に必要なプラスミドを細胞にトランスフェクションします。BSC内にて、フィルターチップを用いてDNAをチューブにピペッティングします。陰性対照として、1つのウェルではウイルスポリメラーゼLをコードするプラスミドを除外し、代わりにGFPをコードするプラスミドをトランスフェクションして、トランスフェクション効率を可視化します。その後、DNAにOpti-MEMを1ウェルあたり100 µL加えます。チューブをボルテックスし、スピンダウンします。

次に、希釈したDNAに7.5 µLのtransIT LT-oneトランスフェクション試薬を加えます。チューブを緩やかにボルテックスし、室温で15分間インキュベートします。15分後、ピペッティングによってトランスフェクション混合液を穏やかに混ぜ合わせ、6ウェルプレートの各ウェルに100 µLずつ滴下するように加えます。

細胞にトランスフェクション複合物を添加した後、プレートを前後左右に揺らしてください。プレートを回転させるとトランスフェクションが不均一になるため、旋回させないでください。その後、細胞をインキュベーターに戻します。トランスフェクションの24時間後、細胞から上清を除去します。次に、5% FBS含有培地 4 mLを細胞に添加し、インキュベーターに戻します。

プロデューサー細胞のトランスフェクションから24時間後に、既述の方法で293T細胞を継代します。継代から24時間後、エボラウイルスRNPタンパク質をコードするプラスミドおよびエボラウイルスの接着因子として機能するTim-1をトランスフェクションします。プロデューサー細胞のトランスフェクションから72時間後かつターゲット細胞のトランスフェクションから24時間後に、プロデューサー細胞から上清を回収し、15 mLチューブにピペットで移します。

上清を回収した後、残っている液体を取り除き、250 µLのglow lysis bufferを細胞に加えて、室温で10分以上インキュベートします。その後、本ビデオのステップ3に従ってルシフェラーゼ活性を測定します。その間に、生産細胞から得られた上清を室温、800 gで5分間遠心分離します。

次に、標的細胞から培地を除去し、P-0細胞から得られた清澄化上清を3 mL、標的細胞に加えます。この操作を1ウェルずつ行います。完了後、標的細胞をインキュベーターに戻します。感染から24時間後。

標的細胞から上澄みを除去します。次に、5% FBS含有培地を4 mL加え、細胞をインキュベーターに戻します。プロデューサー細胞または標的細胞におけるレポーター活性を測定するため、プロデューサー細胞の場合はトランスフェクションの72時間後、標的細胞の場合は感染の72時間後に細胞を回収します。

そのためには、細胞から上清を除去し、250 microlitersのglow lysis bufferを細胞に加え、室温で少なくとも10分間インキュベートします。必要に応じて、この上清を新しい標的細胞の感染に使用できます。その場合は、上清を回収し、本ビデオのステップ2に記載されている方法で標的細胞に感染させてください。

その間に、ルシフェラーゼアッセイバッファーを1ウェルあたり 40 µL 解凍し、バッファーに100分の1容量のルシフェラーゼ基質を加えます。調製したルシフェラーゼ試薬をボルテックスし、次へ進む前に室温に達していることを確認してください。次に、試薬 40 µL を白色不透明の 96 ウェルプレートにピペッティングします。クロストークによる問題を避けるため、サンプルウェルの間に1ウェルの空きを設けることが推奨されます。10分間のインキュベーション終了後、ピペッティングによって細胞を溶解バッファーで洗浄し、細胞溶解液をチューブに移します。溶解液を室温、10,000 g で3分間遠心分離します。その後、溶解液 40 µL をルシフェラーゼ試薬が入った 96 ウェルプレートにピペッティングします。サンプルを室温で10分間インキュベートします。10分後、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性を測定します。発光測定の積分時間は 1 s としてください。Modulus マイクロプレートルミノメーターを用いた場合、ポジティブコントロールの典型的な発光信号は 1 × 10⁶ から 1 × 10⁷ 程度であり、一方でネガティブコントロールの信号は少なくとも 2〜3 ログ低くなるはずです。その後の継代において、ポジティブコントロールのレポーター活性は安定して維持される一方、ネガティブコントロールのレポーター活性はバックグラウンドレベルまで低下します。

このビデオを視聴することで、エボラウイルスの複製および転写能を持つウイルス様粒子を作製し、それらを用いて標的細胞に感染させ、産生細胞および標的細胞におけるレポーター活性を測定できるようになります。

重要な点として、この手法はRNA介在性の細胞因子ノックダウンなどの他の技術と組み合わせることが可能であり、ウイルス生物学におけるこれらの因子の役割を研究することができます。また、この手法で用いるウイルス成分に突然変異を導入することで、エボラウイルスのライフサイクルにおけるこれらの成分の役割を研究することも可能です。さらなる実験の詳細および具体的な試薬については、このビデオに付随する論文をご参照ください。