マウスにおける顔面神経軸索切断：傷害に運動ニューロン応答を研究するためのモデル

本手順の目的は、末梢神経損傷を研究するために顔面神経を露出させることです。顔面神経は脳幹の橋に由来し、茎乳突孔を通じて頭蓋骨から出た後、主要な分枝に分かれます。

神経を露出させた後、茎乳突孔からの出口で神経を自切します。顔面神経を特定するには、2つの主要な指標が役立ちます。1つ目は外耳道であり、これは薄い膜でつながれた真珠白色の軟骨板で構成されています。

もう一つは顎二腹筋前腹で、これは神経および茎乳突孔からの神経出口の上に位置しています。顔面神経を損傷させた後、研究者は運動ニューロンの死や遺伝子発現などの複数の要因を研究することができます。顔面神経損傷モデルは、最もよく特性が解明されている末梢神経損傷モデルの一つです。

この手法の利点は、簡便であり再現性が高く、その後の顔面麻痺が生命維持機能に影響を与えないことです。さらに、神経系は非常に高い対称性を有しているため、非損傷側を実験のペア内部対照として利用することが可能です。本手順を通じて無菌操作を維持するため、すべての器具をオートクレーブで滅菌し、操作の合間に器具を滅菌するためのガラスビーズ滅菌器を用意しておいてください。

吸収パッドを加熱パッドの上に置き、顕微鏡を設置し、ノーズコーンを視野の端に合わせるように固定して、手術台を準備します。マウスを麻酔した後、足指を挟むなどの刺激に対して身体的な反応がないことを確認してください。その後、ガスフローを麻酔チャンバーからノーズコーンに切り替え、オフタラミック軟膏を塗布します。

マウスを左側を下にして手術用パッドの上に置き、その下に加熱パッドを配置します。動物の呼吸を継続的に観察し、麻酔を維持するために必要に応じてイソフルランの流量を調整します。次に、手術部位を露出させるため、右耳をノーズコーンにテープで固定します。

耳の後方を走行する後耳静脈を確認します。次に、被毛を 70%ethanol で濡らし、当該部位を剃毛します。被毛を除去した後、ヨード剤と 70%ethanol を交互に 3 回使用して皮膚を洗浄し、部位を十分に清浄にします。

手術を進めます。口の部分が横を向き、耳静脈が水平に走るように配置してください。これにより、顔面神経の同定が非常に容易になります。

最初の切開位置を決定するために、耳から耳突起の後方領域まで後耳静脈を丁寧に追跡します。次に、教育目的のため、スプリングシザーを使用して、突起から2〜3 mm後方に4 mmの切開を加えます。この切開口を広げて、下層の解剖学的構造を露出させます。

次に、皮下脂肪と筋膜を鈍的に剥離します。血管や筋肉は、ハサミで容易に損傷する可能性があるため注意してください。出血が起こった場合は、

滅菌綿棒で少なくとも30秒間圧迫してください。かなりの体液喪失があった場合は、25または27ゲージの針を用いて、最大0.5 mLの生理食塩水を腹腔内に注入します。次に、主要な指標を用いて顔面神経を確認します。

副神経は顔面神経よりも浅層に位置し、頭蓋骨の側頭部から走行しているのが確認できます。僧帽筋を神経支配させるには、軟骨性の外耳道を特定します。外耳道は真珠のような白色で、顔面神経の吻側に観察されます。

顔面神経は外耳道の側方に回り込んでいます。次に、顔面神経の上方かつ側方に位置する顎二腹筋前腹を特定します。この構造の下を剥離し、顔面神経を露出させます。

それは、下層の筋膜に付着した白色の固い構造物です。顔面神経の主要な分枝を特定してください。それらを背側へ辿り、茎乳突孔からの起始点を確認してください。

微細ピンセットで術野を広げ、バネ式剪刀の先端を用いて顔面神経の走行に沿って剥離します。ピンセットで乳様突起の骨部を確認してください。次に、顔面神経幹を特定し、神経を圧砕します。

精密ピンセットを用いて、一定の圧力をかけながら30秒間圧縮します。これにより、すべての軸索が切断されます。次に、垂直な角度からさらに30秒間、同様に圧縮を繰り返します。

実験間で圧力を一定に保ってください。関連する解剖学的指標が特定されましたので、より精緻な手術手技を実演します。より小さな切開を行い、耳の付け根から耳突起の後方領域まで後耳介静脈を追跡し、突起から2〜3 mm後方で4 mmの切開を加えます。

次に、副神経、外耳道、および顎二腹筋前腹という3つの指標を用いて、皮下脂肪と筋膜を切開します。顔面神経を露出させてください。顔面神経を茎乳突孔に向かって遡り、顔面神経幹に到達させます。神経を細いピンセットでそっと固定し、ハサミで切断します。

神経に過度な牽引をかけないようにしてください。さもなければ、脳幹から引き抜かれる可能性があります。次に、神経断端を離すか、神経の一部を切除して、再結合が起こらないようにします。最後に、神経を慎重に検査し、完全に切断されていることを確認してください。

摘出後、すべての脂肪と筋肉をほぼ元の位置に戻します。次に、7.5 mmの皮膚縫合用クリップまたはシアノアクリレート系接着剤を用いて創傷を閉じます。必要に応じてこの時に鎮痛剤を投与し、麻酔を停止させ、敷材のない空のケージにマウスを戻します。

動物の回復を待つ間、顔面麻痺の兆候がないか確認します。ひげが麻痺している場合、ひげが頬の方へ向いて角度がつき、鼻が歪んで見え、エアパフに対する目の瞬き反応が消失します。次に、動物が雌である場合は、別の雌と同居させてください。

ただし、眼瞼閉鎖機能が回復するまでマウスを単独飼育し、角膜合併症を予防するために視床下部軟膏を毎日塗布してください。同時に、手術部位が完治するまで、感染症やその他の合併症の兆候がないかマウスを観察します。8週齢で顔面神経切断を施した野生型動物において、眼球摘出後の運動ニューロン消失の程度は、マウスの年齢および遺伝的背景によって大きく異なります。

視神経切断後28日で、運動ニューロンの約86%が生存しています。筋萎縮性側索硬化症のSOD1マウスモデル、および免疫不全の組み換え活性化遺伝子2（RAG2）ノックアウトマウスのレーザーキャプチャーにおいて、有意に多い細胞消失が観察されました。

顔面神経核から試料を単離するために、マイクロダイセクションを用いた。顔面神経核全体を回収することが可能である。あるいは、各亜核を個別に回収することもできる。

この手法は非常に高い精度を有しています。運動ニューロンを個別に回収することが可能であり、残りのニューロピル（神経 neuropil）も回収して後で解析に利用できます。腹内側核（破線で表示）および腹外側核（実線で表示）の亜核サンプルにおける遺伝子発現を調べるために定量PCRを用い、神経再生反応に関連する4つの遺伝子の発現を測定しました。

これらの亜核の間でいくつかの相違が認められました。Gap 43の発現において、亜核間で最大の差異が示されました。この手法を習得すれば、手術はわずか数分で完了させることができます。

動物を正しく配置し、適切な箇所を切開し、解剖学的指標を用いて顔面神経を特定することが重要です。頭頸部は迷いやすいため、もし位置が分からなくなった場合は、軟骨性の外耳道を特定し、そこから後方へ辿ることで顔面神経を見つけることができます。