Name: マラリア蚊。送信のためのマルチ検出分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぶMALDI-TOFベースのSNPジェノタイピングプラットフォームを用いて、マラリア媒介蚊の種同定、殺虫剤耐性、寄生虫感染を同時検出する方法。この技術はマラリア制御と予防戦略の改善に貢献します。

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私たちは、博士に感謝。タンザニアから蚊の標本を提供するためのグラスゴー大学のUCデービス博士カタリーナKreppelでアンソニー·コーネルとローラ·ノリス。私たちは、ザンビアから蚊のサンプルを共有するための公衆衛生のジョンズホプキンススクールさんスミタ·ダス博士ダグラスノリスに感謝。我々はまた、アッセイデザインのトレーニングのために獣医遺伝学研究所の李氏V.ミロンに感謝。この作品はR01AI 078183とR21AI062929を付与国立衛生研究所によってサポートされていました。

1. PCR増幅<ol><li> 1.5ミリリットルのマイクロチューブに（補足表S1を参照してください）​​すべてのPCRプライマーを混ぜる。各SNPは、2つのプライマー（順方向および逆方向）を有している。各PCRプライマーのストック濃度を100μmに保たれていることを確認します。 （補足表S2を参照してください）​​ベンチでのピペッティング誤差と時間を削減するために500〜1,000の反応のための十分なプライマーミックスを作成します。必要に応じて、-20℃でチューブや店舗あたり100〜200の反応のためのアリコートを準備します。 </li><li>製造業者のプロトコル（表1）で説明したようにPCRカクテルを準備します。 96の反応のためのボリュームは、20パーセントのオーバーハングが含まれています。渦2000×gで30秒間のPCRカクテル軽く遠心を含むチューブ。 </li><li>非スカート96ウェルプレートの各ウェルにPCRカクテルの3μLを分注する。リピーターピペットは、このプロセスのための時間を節約することができる。 </li><li>各ウェルに蚊の適切なゲノムDNAの2を添加する。 注記：メートルからゲノムDNAを得る工程<html> osquito組織（頭部/胸部、腹部または全身）は、他の文献29-32に記載されている。感染蚊（頭部/胸部におけるマラリア原虫 ）から血液（腹部）でマラリア原虫を持つものを区別するための適切なDNA抽出プロトコルを選択します。私たちは、一般的に蚊のボディパーツ（頭部/胸部または腹部）から抽出したDNAを使用するため、DNA濃度は0.05-2ng /μLごとに異なります。トータルDNA入力が製造者の推奨（5-10ng / rxnの）未満であるが、ここでは一般的に堅固なSNPは、全ゲノム増幅なしでDNAサンプルの98％か​​ら呼び出し得る。 </li><li>プレートをシール、穏やかに混合またはボルテックスし、370×gで1分間遠心する。 </li><li> PCR増幅を行うために、以下のサーモサイクラープロトコルを使用して：（1）94℃で2分間、（2）94℃30秒間、（3）56℃で30秒間、（4）72℃で1分間（5）繰り返し工程（2） - （4）45サイクルについて、（6）1分、4℃保持72℃。 </li></ol>_title &quot;&gt; 2。SAPトリートメント<ol><li> 96ウェルプレート中のSAP酵素溶液を調製した（表2参照）。プレート内の96サンプルを処理する。 96の反応のためのボリュームは、20パーセントのオーバーハングが含まれています。 </li><li>ボルテックス軽くSAP酵素溶液のチューブと2000 X gで30秒間遠心する。各ウェルに、SAP酵素溶液2μlを分注する。ここでも、リピーターピペットは、このプロセスのための時間を節約することができます。 </li><li>プレートをシール、穏やかに混合またはボルテックスし、370×gで1分間遠心する。 （1）37℃で40分間酵素を失活させ、5分間（2）85℃、（3）4℃の保持：次のようにプレートをインキュベートする。このステップが完了すると、続行する前に-20℃でプレートを保存する。 2週間内に格納されているプレートを処理します。 </li></ol> 3. SNP拡張<ol><li>サンプルプレートは、SAP処理後に凍結している場合、それは続行する前に室温に解凍することを可能にする。 </li><li>エクステンションプライマーミックス（補足表S2）を準備します。各SNPは1エクステを持ってnsionプライマー。 500μMの各伸長プライマーのストック濃度にしてください。必要に応じて、-20℃でチューブや店舗あたり100〜200の反応のためのアリコート。 </li><li> 96反応容量が20％のオーバーハングを含み、表3に記載されているように拡張ミックスを調製する。 </li><li>ボルテックス軽く延長カクテルのチューブと2000×gで30秒間遠心する。各ウェルに延長カクテル2μLを分注する。ここでも、リピーターピペットは、このプロセスのための時間を節約することができます。 </li><li>プレートをシール、穏やかに混合またはボルテックスし、370×gで1分間遠心する。 図1に示すように、プレート熱サイクル。この時点で、質量分析に進むか、または2週間Cまで-20℃でプレートを格納する。 </li></ol>質量分析を最適化するため4.エアコンSNP拡張製品<ol><li>サンプルプレートは、SNPの拡張後に冷凍される場合は、続行する前に室温に解凍することを可能にする。 </li><li>そのコンタから樹脂の15mgのを転送細長いスプーンを使用したディンプルプレートにINER。ディンプルプレートのウェル内に樹脂を広めるためにスクレーパーを使用してください。樹脂を広めるためにディンプルプレート間で左右にスクレーパーをスイープ。樹脂は、各ウェルに存在していることを確認します。 </li><li>スクレーパーを使用してディンプルプレートから余分な樹脂をこすり。樹脂は、少なくとも20分間、ディンプル板に放置。樹脂せながらディンプル板に立って、サンプルプレートの各ウェルにHPLC等級の水41μlを添加する。 </li><li>静かにディンプルプレートに、サンプルプレート逆さまに置きます。ディンプルプレートのウェルを有するサンプルプレートのウェルを整列ディンプルプレートの小さな丸みを帯びた後、に対してサンプルプレートのリセットを確認してください。 </li><li>樹脂は、サンプルプレートのウェルにディンプル板から外れるようにして裏返して優しく、一緒にサンプルプレートとディンプル板を保持する。樹脂がサンプルプレートに出て落ちるようにディンプルプレートをタップします。ディ内のすべての樹脂を確認してくださいmpleプレートは試料プレートのウェルに抜け落ちる。 30秒間3200×gでプレートを遠心。 </li><li> RTで5分間回転器上のサンプルプレートを回転させます。回転子は、サンプルプレートの長軸約360°回転しなければならない。 </li><li> 5分間3200×gでサンプルプレートを遠心します。このステップの後、次のステップに進む前に、最大2週間まで-20℃でのサンプルプレートを保存する。 </li></ol> 5. MALDI-TOF質量分析<ol><li>製造業者の指示に従ってなどSpectroCHIPとしてバイオアレイ上にエアコンのSNP伸長産物を転送します。我々は、このステップのためMASSARRAYナノディスペンサーを使用しています。 </li><li>転送が完了した後、アッセイプレートをアッセイデータベースに設定される方法を定義する。各プレートは、特定のアッセイデザイン（補足表S3）にリンクする一意の識別子を有するように、アッセイプレートに名前を付けます。 </li><li>アッセイプレートを定義した後、質量分析計を用いてスペクトルを取得する。 </li></ol><ol><li>そのようなタイパーアナライザやTyperViewer（シーケノム）などのリアルタイムPCR解析データ解釈ソフトウェアを使用してデータ分析を実行。サンプルレイアウトを含む.xml形式のデータを、各ウェルについての質量スペクトログラム、名を含むマーカー情報、対応するSNPの各バリアント、およびそれぞれの反応に関連するすべてのエラーや警告のメッセージのマスを取得します。得られる質量スペクトル写真については、図2を参照してください。 </li><li>検出閾値（対雑音比の大きさまたは信号）と、各遺伝子型に対して許可耐性/分散を設定することにより、SNP遺伝子型クラスタリング解析を行う。 図3は、04707-KDR位例2 SNP遺伝子型クラスターを示す。 </li><li>表計算プログラムに生じたSNPの遺伝子型コールをエクスポートします。 </li></ol>

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<li>Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+islands+of+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae.</a> PLoS Biol. 3, e285(2005).</li>
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<li>Holt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298, 129-149 (2002).</li>
<li>Lawniczak, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+divergence+between+incipient+Anopheles+gambiae+species+revealed+by+whole+genome+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences.</a> Science. 330, 512-514 (2010).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

飛行時間（MALDI-TOF）質量分析法33-37 - PCR増幅、エビアルカリホスファターゼ（SAP）反応、SNP拡張、伸長産物の調節、およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化：MDAは、5つの主要なステップから構成されている。最初のPCR増幅工程は、十分な鋳型DNAがSNP伸長工程で使用できるように各SNPに隣接するDNAを増幅する。 SAPの反応は以下のSNP伸長工程を妨害する可能性が使用されていないdNTPを中和する。 SNP拡張は、SNP遺伝子座と質量修飾ターミネーターヌクレオチドごとに単一の伸長プライマーを伴う。 3 &#39;末端修飾ヌクレオチドは、伸長プライマーに組み込まれることから、その後のヌクレオチドを​​防ぐ。このように、単一塩基の質量は、対応するSNPの遺伝子型を示している。 このアプローチの成功を確保する上で最も重要なステップは、標的生物に存在する多型の良いデータセットをしているS。私たちは、種の同定（N&gt; 900）10,12,38-40及びKDR（N&gt; 1,000）1...

ハマダラカarabiensis、ハマダラカcoluzziiとハマダラカは、アフリカ1におけるマラリア伝送に関与する主要なベクトルです。これら3種は2形態学的に区別できないとだけ分子アッセイ3-9で区別することができます。また、日常的疫学的および集団遺伝学研究を支援するために行われ、多くの下流のアッセイが存在する。これらには、（1）分化アイランド10-12のための遺伝子型決定アッセイを、 パラ遺伝子のアミノ酸コドン位置番目 1014で非同義SNPを認識する（2）遺伝子型決定アッセイ（ ノックダウン抵抗 、又はkdrの 、SNP）13を含む-18、（3）寄生虫の検出PCR 19-23、及び（4）蚊の中腸24,25にホスト固有のDNAをスクリーニングする。 私たちは、の目標を持つ単一の多重反応にすべてのこれらのアッセイを組み合わせたマルチ検出アッセイ（MDA）を開発アフリカのマラリアベクトルの疫学的に重要な特性をalyzing。 MDAアッセイは、（1）種を検出するための複数のマーカー（A.のarabiensis、A.のハマダラカ、A.のcoluzzii、または3つの他の（なし））kdrの SNPの中で示される、（2）殺虫剤抵抗性（L1014F とL1014S両方）を含む二つの主要なマラリア原虫の、（3）存在下、熱帯熱マラリア原虫およびP.三日熱マラリア原虫 、一鳥類六哺乳類宿主から（4）血液源。 伝統的に、これらのアッセイは、別個のポリメラーゼ連鎖反応を行った。すべてのこれらのアッセイは、従来のPCRプラットフォームを使用して行われている場合には、8-10 PCR反応アッセイを実施し、ゲル電気泳動工程を伴う必要があります。ここで紹介するMDA法は全体で約5時間かかりますしながら、文書化の結果への準備から、個々のPCR反応は、4-5時間かかります。これだけで人件費の90％の節約と等価である。 MDAはここで紹介する5ドルの費用すべての33のSNPの遺伝子型を決定するためにサンプルあたり。これはサンプルあたり約1.50ドルのコスト、これシングルアガロースゲルベースアッセイよりもかなり安価である。 MDAがカバーするすべての特性を検出するアッセイは、サンプルあたり$ 12〜15の費用で8-10別々のアガロースゲルに基づくアッセイの最小値を必要とするであろう。また、MDAは大幅に各寄生虫またはホストソースを検出するための少なくとも3つのマーカーを利用することにより、偽陽性または陰性のを発生させる可能性を低減します。 我々が利用プラットフォームはマラリアベクトルに限定されるものではなく、医学、獣医学、および基本的な生物学26-28など、多種多様な用途で使用することができる。深い関連研究または集団遺伝学サンプル（数百程度）を多数同時に複数のマーカーのための費用対効果のアッセイスクリーニングが必要含む研究。 2つ以上の別々のPCRアッセイを利用するほとんどの研究は、低コストで迅速な結果を得るために、MDAを実装することができます。 </p&gt;

<table><tbody><tr><td>MassARRAY Analyzer Compact</td><td>Sequenom</td><td>MT9</td><td>MALDI-TOF質量分析は、核酸を分析するためのゲノムアプリケーション向けです。</td></tr><tr><td>MassARRAY Nanodispenser</td><td>Sequenom</td><td>RS1000</td><td>完成したiPLEX反応生成物を、SAP</td></tr><tr><td>キットを含むiPLEXアッセイに使用する</td>SpectroCHIP<td>iPLEX Gold Genotyping Reagent Set</td><td>Sequenom</td><td>10158</td> Reagents</tr>に移します。</tbody></table>

マラリア蚊。送信のためのマルチ検出分析

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

ハマダラカ種複合体は、アフリカの蚊を送信する主要なマラリアが含まれています。これらの種は、そのような医学的に重要であるので、いくつかの特徴は、典型的には、疫学的研究を支援するために、分子アッセイを使用して特徴づけられる。これらの特性は、種の同定、殺虫剤抵抗、寄生虫感染状況、およびホストの好みが含まれています。 ハマダラカ複合体の集団は、形態学的に区別できないので、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、伝統的に種を識別するために使用される。種が分かると、いくつかの下流のアッセイは、日常的にさらなる特性を解明するために行われる。例えば、パラ遺伝子におけるKDRとしても知られている突然変異は、DDTおよびピレスロイド殺虫剤に対する耐性を付与する。さらに、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）またはマラリア原虫DNAの検出PCRアッセイは、蚊の組織に存在する寄生虫を検出するために使用される。最後に、combinatioPCRおよび制限酵素消化物のnは、ホスト固有のDNAのための蚊吸血をスクリーニングすることによって、ホスト·プ（動物の血液対例えば 、ヒト）を解明するために使用することができる。私たちは、一度に96または384のサンプルについて、単一の多重反応ジェノタイピング33SNPsに上記アッセイの全てを兼ね備えたマルチ検出アッセイ（MDA）を開発した。 MDAは、種、 プラスモディウム検出、およびホスト血液を識別するための複数のマーカーが含まれているので、偽陽性または陰性の発生の可能性が大幅に形質ごとに1つのマーカーを含む、前のアッセイから減少する。この堅牢でシンプルなアッセイは、コスト効率と既存のアッセイの時間の割合は、これらの重要な蚊の特性を検出することができます。

種の同定： サンプルは3種の一つではない場合は、次の5個のSNPは、一緒に、3個のSNP（01073から213、04679から157と10313の3種（A.のarabiensis、AをcoluzziiとA.ハマダラカ ）（ 表4）。識別する-052）を増幅することができない。 殺虫剤抵抗性を推測するためのKDR遺伝子型： パラ電位依存性ナトリウムチャネルの1014 番目のコドンは、KDRに対応している。 1014 番目のコドンの第 2 および第 3ベース上の2つのSNPは、3つの可能なアミノ酸を決定する。遺伝子型の可能な組み合わせを表5に記載されています。このSNPはアフリカのマラリアベクトルの3種のために...

マラリアを媒介する蚊は、分子技術を用いてのみ検出できる疫学的に重要な特性を多数持っています。MALDI-TOFベースのSNPジェノタイピングプラットフォームを利用して、マラリアベクターの複数の主要な形質(種、殺虫剤耐性、寄生虫感染、宿主選択)を同時に検出するためのアッセイを開発しました。

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

a-multi-detection-assay-for-malaria-transmitting-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

遺伝子がマラリアのための潜在的に耐火として識別されると、それは蚊の中マラリア原虫の感染症の予防にその役割を評価する必要があります。このプロトコルは、蚊のマラリア原虫の感染の程度をアッセイする方法を示します。生殖母体の文化、膜の給餌蚊ヒト血液、及び蚊の中腸におけるウイルス力価を測定することを準備するための技術が実証されています。...

蚊と感染症の表現型決定における熱帯熱マラリア原虫の感染症のためのプロトコル

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝学的交配は蚊に2つの遺伝的に異なる寄生虫を供給することによって実行されます。組換え子孫は、蚊が感染したマウスを噛まないようにできるようにした後、マウスの血液からクローン化されています。このビデオでは、遺伝的交雑を生成する方法を示しています。...

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル

このビデオは、メスの蚊に対する新しい作用機序を持つ試験化合物の死亡率と繁殖力を評価するための給血アッセイを示しています。この技術は、新しいクラスの殺虫剤をスクリーニングして、蚊の耐性集団を殺し、病気の蔓延を制御するのに役立ちます。...

蚊の摂食アッセイ:成虫の雌の蚊の死亡率と繁殖力に対する試験化合物の影響を評価する方法

高解像度融解分析は、不均一な集団中の単一塩基多型を区別する能力を提供するが、変異対立遺伝子の増幅偏りは、試料内の比較的低い割合で存在する対立遺伝子を検出する能力を高めることができます。このプロトコルは、高分解能融解分析の感度を向上させる改良が記載されています。...

マラリアに一塩基多型のジェノタイピングを溶融高解像度の感度を上げる方法

ヒトマラリア寄生虫に対するげっ歯類マラリア寄生虫のライフサイクルと生物学の顕著な類似性により、げっ歯類マラリアモデルはマラリア研究に欠かせないものとなっています。ここでは、野生型およびトランスジェニックげっ歯類マラリア種の表現型分析に用いられる最も重要な技術のいくつかを標準化した。...

げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階

現在では、複雑なサンプル準備と高価な計測器が必要し、低リソース環境では使用しにくいジカ、チクングニア ウイルスおよびデング...

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

提示されたプロトコルは、封じ込めの設定で、ジカのような特定のウイルスに対する Aedes aegypti...

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

このプロトコルは、gRNA誘導Cas9切断およびDNA修復後の標的部位における非相同性端結合(NHEJ)事象の同定および定量化に関する分析を含む、DNA抽出からデジタル液滴PCR(ddPCR)の実験的セットアップまでのステップを提供する。この方法の他の用途としては、多型検出や遺伝子編集バリアント検証などの用途が挙げられる。...

遺伝子組み換えアノフェリン蚊集団におけるインデル変異を検出するデジタル液滴PCR

このプロトコルは、蚊の唾液腺スポロゾイトを検出するためのサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイについて説明しています。この方法は、容易に入手できるモノクローナル抗体を使用して、 熱帯熱マラリア原虫 または...

酵素結合免疫吸着アッセイを用いたハマダラカ蚊におけるマラリア原虫スポロゾイトの検出

標準的な膜供給アッセイ(SMFA)は、潜在的な抗マラリア化合物の評価と同定のためのゴールドスタンダードと見なされています。この人工給餌システムは、熱帯 熱...

ハマダラカ媒介動物における熱帯熱マラリア原虫感染の検出のための標準的な膜摂食アッセイ

マルチプレックス蛍光免疫測定法は、血清学的検査の基準になりつつあります。ただし、それらのアプリケーションは、複雑さと時間のかかるビーズ分析種カップリングプロセスによって制限されます。このレポートは、結果を得るまでの時間を大幅に短縮しながら、標準的な方法に匹敵する、半自動で再現性のあるマルチプレックスマイクロスフィアビーズカップリングプロトコルを提示します。...

アルボウイルスに対する抗体応答の検出のためのマルチプレックス血清学的アッセイ

学ぶMALDI-TOFベースのSNPジェノタイピングプラットフォームを用いて、マラリア媒介蚊の種同定、殺虫剤耐性、寄生虫感染を同時検出する方法。この技術はマラリア制御と予防戦略の改善に貢献します。

マラリア蚊。送信のためのマルチ検出分析

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