Name: 光化学誘起後方虚血性視神経障害のラットモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: 学ぶ光化学誘導による後方虚血性視神経障害のラットモデル構築法。網膜神経節細胞への影響を評価し、神経保護と軸索再生の新規治療法開発に活用可能な信頼性の高い動物モデルを提供します。

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私たちは、ビデオ編集のための畜産用Eleutヘルナンデス、顕微鏡の専門知識のためのゲイブGaidosh、およびKhueトランとZhenyang趙にお世話になっています。国立眼研究所によって資金を供給されたこの研究は、UMにUCSDとEY014801にJLGとP30の助成金EY022589にR01-EY022129を付与。米国心臓協会、ジェームズとエスター王財団、復旦大学大学院の博士課程の学生交流プログラム基金（第2010033）、及び失明防止社への調査から無制限の助成金

すべての動物の手順は、カリフォルニア州サンディエゴ、マイアミ機関動物のケアと使用委員会（IACUC）の大学によって承認され、眼科およびVisual研究における動物の使用に関するARVO声明に従って行われました。すべての試薬及び外科的処置に使用される器具は、無菌です。 1.手術のためにラットを麻酔し、準備します<ol><li>手順の前に、ラットを体重に応じて、ケタミン（60mgの/ kg）およびキシラジン（8mg / kg）の腹腔内注射で麻酔します。麻酔の適切な深さはつま先のピンチ刺激に対する否定応答によって決定されるべきです。 </li><li>麻酔をかけた後、窒息を防止し、手術中に角膜の乾燥を防ぐために、両眼に軟膏を潤滑適用するために前方に舌を引っ張ります。 </li><li>バリカンを使用して、手術部位を剃り、面積10％ - イオジン洗剤溶液、70％エタノールで3回拭きます。 </li><li>ドレープトン無菌のフィールド内の彼は動物。滅菌手袋と手術器具は、生存手術中に使用されています。動物間のホットビーズ滅菌器を使用して、機器の先端を再滅菌します。 </li></ol> 2.外科的アプローチ<ol><li> パイオン誘導 <ol><li> 大腿静脈カテーテル法 <ol><li>手術部位を準備し、清掃してください。バリカンを使用して、右太ももの内側を剃る、10％ - イオジン洗剤溶液、70％エタノールでエリアを3回ずつを拭きます。 </li><li>チューブを準備します。 70％エタノールで滅菌ポリエチレンチューブの長さ40センチメートル（PE 10）を切断します。 （20 mg / kg体重の用量をもたらす、1μL/ mg）を生理食塩水でチューブをフラッシュし、2％のエリスロシンB色素の予め測定された溶液を含む1 mlの注射器に接続します。 600μL/分の速度に設定し、フットスイッチ制御注入ポンプにシリンジをマウントします。 </li><li> 15番ブレードを使用して、ある小さな水平切開を作ります右腿の付け根。カットし、内側の膜を広げ、滅菌綿棒でエリアを清掃してください。 </li><li>大腿静脈の枝が表示されるまで、鉗子で筋肉を区切ります。シースは、動脈、静脈や神経を囲んでいます。 Vannas春のはさみと三角形のくさびのベースの近く（2-4 mmは通常十分である）つまみ、鉗子（ファインチップデュモン鉗子）と上方このシースを引っ張って、小さな切開をカット。必要に応じてカットを展開します。 </li><li>静脈の方向に鈍いマイクロ手術用フック平行な静脈と動脈を分離します。繊細な膜と静脈枝を傷つけないように注意してください。そして、そっと静脈を持ち上げ、下にある結合組織から分離。 </li><li>ニードルレスナイロン縫合糸を入手して、大腿静脈の横に置きます。マイクロ手術用フックを使用して、静脈を上げ、先端領域の下の先の細いピンセットを渡します。縫合糸の一方の端をつかみ、下にそれを引っ張ります静脈。しっかり遠位静脈を結紮。近位静脈の下で同様の方法で、第2の縫合糸をパスし、緩い結び目を作ります。 </li><li> Vannasスプリングはさみで遠位結紮に近い静脈の小さなカットを行います。先の細いピンセットで、必要に応じて穴を展開します。一部の血液は、カットを通って漏れることがあります。冷たい、滅菌BSSおよび滅菌綿棒で手術領域を清掃してください。 </li><li>カットの縁に静脈壁を持ち、針ホルダを用いて調製し、生理食塩水で洗い流しチューブを容器にカテーテルを挿入。静脈とチューブの周りの近位結び目を締めます。次に、遠位縫合糸にそれを結びつけることによって、チューブを固定します。 </li><li> 1ミリリットルが適切である&lt;、生理食塩水を注入するために、フットスイッチを押すことにより、カテーテル法の品質を確認してください。チューブが遮られていないと漏れを持っていないことを確認します。一時的カテーテル法と組織を保護するために縫合糸で切開を閉じます。 </li></ol></li><li> 視神経の暴露 <ol><li> PreparE 10％ - イオジン洗剤溶液、70％エタノールで左目の上に各3回の事前坊主頭の領域を拭いて手術部位。 </li><li>第15ブレードで目の後ろの皮膚2〜3ミリメートルに沿って切開してください。ピンチと鋸歯状の鉗子で結合組織を持ち上げて、Vannasスプリングハサミで小さな切開を行います。この小さな切開は、一般的に長さが約5mmであるが、訓練中の外科医のための大きい露出を提供するために長くすることができます。血管を破壊しないように注意しながら、ぶっきらぼうに眼窩骨の優れたリムに沿って結合組織を通って解剖を続行します。綿棒で手術領域を清掃してください。 </li><li>優れた直筋が表示されるまで結膜を通って下方解剖。ピンチと筋肉を通して解剖。筋肉が軌道内に深くから解放されます。今、周囲の組織を視覚化を容易にするために目の後退及び仰角を助けるために利用することができます。 </li><li>再横方向と下方向に皮膚や結合組織のフラップを管、縫合や止血剤のある場所に保持します。これは、視神経を囲む脂肪含有シースを明らかにするために前進し、外側に目を回転します。 </li><li>慎重に鋭いピンセットを挿入し、シースの周囲の結合組織を分離するために視神経に平行に展開します。鉗子の鋭い先端で視神経を触れないでください。 </li><li>視神経と周囲の鞘の5ミリメートルの長さが表示されるようになるはずです。シース表面の微小血管のネットワークは、視神経を取り囲みます。これらは、レーザー照射時に対象とされます。 </li></ol></li><li> エリスロシンBおよびレーザー照射の静脈内注射 <ol><li>緑色レーザ光から身を遮蔽するためにレーザ照射装置を操作しながら、常にオレンジ色の保護眼鏡を着用してください。 、レーザーをオンにし、シャッターを開いて、ピークと平均ポウを調整必要に応じてレーザーのRS。シャッターを閉じます。 </li><li>レーザ照射装置にラットを置きます。適切なビーム配置を確実にするために、弱い照準ビームは、空間的に閉じたシャッタ羽根に穿設さ100μmの直径の穴を介してレーザをフィルタリングすることによって生成されます。先端の細いピンセットで視神経を再公開すると、3ミリメートルと視神経頭の後ろの4ミリメートルの間で眼窩内視神経に照準ビームを配置します。 </li><li>輸液ポンプの活性化を介して2％のエリスロシンBの溶液を注入します。外科医が視神経の表面を湿らせるため、BSSの小滴を追加しながら、数秒間循環することがあります。 </li><li>照準ビームの位置を確認し、照射を開始するために、フットスイッチをクリックします。顕微鏡の光路に追加されたオレンジ色の安全フィルタは、すぐに1秒の遅延後にシャッターの開口部に続くトリガされます。 </li><li> 9用の視神経を照射135mWのピーク電力および15％のデューティサイクルで250 Hzで回転するビームチョッパーによって生成18mWの平均電力と0秒（これは、熱の影響を最小限に抑えます）。安全フィルタを通して明るいオレンジ色として可視黄色蛍光は、視神経の上面から出射されるビームは対称的に、神経を照射することを保証するのに十分であることになります。 </li><li>照射後、オレンジ色の安全フィルタが自動的に開きます。微小出血がある場合には観察することができます。 </li><li>余分な眼筋の牽引力を軽減し、中立位置に目を戻します。結節縫合で切開を閉じます。その後、カテーテルを撤回し、漏出を防ぐためにしっかりと大腿静脈を縛ります。結節縫合で閉じます。両方の切開に抗生物質軟膏を適用します。網膜中心静脈と動脈の血管の完全性を検証するために眼底を確認してください。 </li></ol></li></ol></li><li> 逆行性標識法。網膜神経節細胞（RGC）の注：RGCの生存を評価するために、フルオロゴールド（FG）との逆行性標識はパイ中間子の一週間前に完了する必要があります。この方法は、Joveのプロトコル 819 13に詳細に記載されています。 <ol><li>簡単に言えば：ケタミン（60 mgの/ kg）およびキシラジン（8mg / kg）で動物を麻酔し、頭を剃ります。 </li><li>外科的切開部位をスクラブし、頭蓋骨を露出するように、ヘッド全体に正中切開を行います。 </li><li>頭蓋骨（φ2×2 mm）の両方の矢状方向および横縫合から0.5ミリメートルを通じて両国間の穴を開けます。 </li><li>慎重に真空ポンプを用いて上丘（SC）の背側表面にある脳のコンテンツを吸引。その後、SCの表面に4％のFGに浸したゲルフォームの小片を配置します。 </li><li>縫合糸で切開を閉じて、標準的な術後のケアを用いて動物の世話。 </li></ol></li><li> 術後ケアと安楽死 <ol><li>動物が回復するまでは手術後、再循環温水​​パッドの上に別々の清潔なケージに動物を配置します。 </li><li>術後鎮痛薬（ブプレノルフィン塩酸は、0.01ミリグラム/ kg）を、不快感を最小限にするために3日間連続して1日2回投与されるべきです。 </li><li>ラットを個別に保持し、彼らは胸骨横臥を維持し、十分な意識を取り戻すことができるようになるまで観察されるはずです。 </li><li>回復と健康の徴候は手術後、または抜糸と最新のいずれか早い方の手術部位の十分な治癒までに少なくとも5日間毎日監視されています。 </li><li>調査の関心に応じて、手術後に科学的に適切な時点で、4％PFAで灌流によって動物を安楽死させます。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wang, Y., Brown, D. P. Jr, Duan, Y., Kong, W., Watson, B. D., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+rodent+model+of+posterior+ischemic+optic+neuropathy.%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">A novel rodent model of posterior ischemic optic neuropathy.</a> JAMA Ophthalmology. 131, 194-204 (2013).</li>
<li>Rucker, J. C., Biousse, V., Newman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+optic+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ischemic optic neuropathies.</a> Curr Opin Neurol. 17, 27-35 (2004).</li>
<li>Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+ischaemic+optic+neuropathy%3A+clinical+features%2C+pathogenesis%2C+and+management.%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Posterior ischaemic optic neuropathy: clinical features, pathogenesis, and management.</a> Eye (Lond). 18, 1188-1206 (2004).</li>
<li>Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-Individual+Variation+in+Blood-Supply+of+the+Optic-Nerve+Head.%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Inter-Individual Variation in Blood-Supply of the Optic-Nerve Head.</a> Doc Ophthalmol. 59, 217-246 (1985).</li>
<li>Jacobson, D. M., Vierkant, R. A., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonarteritic+anterior+ischemic+optic+neuropathy+-+A+case-control+study+of+potential+risk+factors.%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol-Chic%22%5BJournal%5D)">Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy - A case-control study of potential risk factors.</a> Arch Ophthalmol-Chic. 115, 1403-1407 (1997).</li>
<li>Kosmorsky, G., Straga, J., Knight, C., Dagirmanjian, A., Davis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+transcranial+Doppler+in+nonarteritic+ischemic+optic+neuropathy.%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The role of transcranial Doppler in nonarteritic ischemic optic neuropathy.</a> Am J Ophthalmol. 126, 288-290 (1998).</li>
<li>Hayreh, S. S., Zimmerman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-arteritic+anterior+ischemic+optic+neuropathy%3A+role+of+systemic+corticosteroid+therapy.%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+archive+for+clinical+and+experimental+ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy: role of systemic corticosteroid therapy.</a> Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology. 246, 1029-1046 (2008).</li>
<li>Prado, R., Dietrich, W. D., Watson, B. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+Induced+Graded+Spinal-Cord+Infarction+-+Behavioral%2C+Electrophysiological%2C+and+Morphological+Correlates.%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Photochemically Induced Graded Spinal-Cord Infarction - Behavioral, Electrophysiological, and Morphological Correlates.</a> J Neurosurg. 67, 745-753 (1987).</li>
<li>Dietrich, W. D., Busto, R., Watson, B. D., Scheinberg, P., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+cerebral+infarction.+II.+Edema+and+blood-brain+barrier+disruption.%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced cerebral infarction. II. Edema and blood-brain barrier disruption.</a> Acta Neuropathologica. 72, 326-334 (1987).</li>
<li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis.%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).</li>
<li>Watson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+photochemically+induced+brain+ischemia+and+stroke.%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebrovascular+Disease+-+Pathophysiology%2C+Diagnosis+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Animal models of photochemically induced brain ischemia and stroke.</a> Cerebrovascular Disease - Pathophysiology, Diagnosis and Treatment. , 52-73 (1998).</li>
<li>Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+spinal+cord+injury+in+the+rat.%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced spinal cord injury in the rat.</a> Brain Research. 367, 296-300 (1986).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+by+application+of+fluoro-gold+on+the+surface+of+superior+colliculus.%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、ラットモデルでPIONを誘導する方法について詳しく説明します。プロトコルの最も重要な部分は、視神経の露出と照射であり、鋭い細い鉗子や伸張による損傷を避けながら、神経をできるだけ長く露出させることです。ラットでは、眼動脈は視神経乳頭から≤1 mmの視神経に入ります。したがって、視神経乳頭から3〜4 mm離れた視神経への照射は、網膜内側に供給する動脈ではなく、神経に栄養を供給する毛細血管の虚血をもたらすだけです。網膜中心動脈と静脈の血管の完全性を確認するには、眼底検査が必要です。練習すれば、完全な外科手術は30分で完了できます。また、レーザー照射のパラメータを設定すると、このモデルは細胞死の時間経過を再現できます。 
ピーク強度と照射時間は虚血性損傷の重症度の 2 つの決定要因であるため、これらのパラメーターを変更して、さまざまな研究目的に合わせて損傷の程度を調整できます。 
この技術は、PIONの最初で現在利用可能な唯一の動物モデルとして、PIONの病因と分子変化を研究するための新しいプラットフォームを提供し、この疾患...

50歳以上の患者では、虚血性視神経症（ION）は、急性視神経2の最も一般的なタイプです。条件は、特定の影響を受けた血液供給および臨床プレゼンテーションのソースに応じて2つのサブタイプの一つとして提示することができます：前方（AION）または後部（パイオン）3。 AIONの病因とコースが広く4-7研究されてきたが、パイ中間子が不十分、その低い有病率、変数プレゼンテーション、不明確な診断基準と動物モデルの不足のために理解し続けています。また、何の治療が効果的に防止またはAIONやパイオンから失明を逆転することが証明されていません。したがって、パイ中間子の再現性と信頼性の高い動物モデルは、in vivoでの疾患プロセスを研究し、神経保護および軸索再生のための新しい治療法をテストするために非常に価値があります。 光化学vasogその結果微小血管系への虚血性損傷を誘発しましたENIC浮腫および血栓症を効果的に地域の組織虚血8-12を作成します 。血管循環系に注入した後、感光性色素エリスロシンBは、標的血管のレーザー照射による活性化の際に反応性一重項酸素分子を生成します。一重項酸素は、直接血小板の接着/凝集を刺激し、血栓形成を閉塞性につながる、血管内皮をperoxidizes。虚血性損傷は、近隣地域に広がり、さらにによる血管原性浮腫に微小血管の圧縮によって悪化します。このプロトコルの全体的な目標は、光化学パイ中間子による被害をミラーリングするために球後視神経に虚血を誘導することです。 我々の知る限り、これは後部視神経1における虚血性傷害の最初のモデルです。物理的な外傷を回避しながら、このモデルは虚血を生成するように、後部の虚血性視神経症の生理学的プロセスは、より良い模倣と検討されています。また、このモデルでは、視神経障害および他のCNS虚血性疾患の候補治療薬のスクリーニングのための新たなプラットフォームを提供しています。ここで、ラットパイオンモデルにおける大腿静脈カテーテル、視神経曝露、エリスロシンBの静脈内注射とレーザー照射のための詳細な手順を説明します。

<table><tbody><tr><td>532nm Nd:YAGレーザー&nbsp;</td><td>Laserglow</td><td>LRS-532-KM-200-3</td><td></td></tr><tr><td>ビームチョッパー</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メカニカルシャッターと対応するシャッタードライブタイマー</td><td>Vincent Associates</td><td>SD-10</td><td></td></tr><tr><td>焦点距離 25cm 球面レンズ</td><td>CVI/Melles-Griot</td><td>01 LPX 293</td><td>平凸BK7 ガラスレンズ HEBBARTM 反射防止コーティング</td></tr><tr><td>エリスロシン B&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>190449</td><td></td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome,LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Cardinal Health</td><td>CAH1203421</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ (PE10)</td><td>BD Intramedic</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>No. 10 Blade</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>F.S.T.</td><td>91150-20</td><td>デュモン #5 錆びない非磁性</td></tr><tr><td>歯鉗子</td><td>F.S.T.</td><td>11153-10</td><td>ドイツステンレス</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>F.S.T.</td><td>18025-10&nbsp;</td><td>ドイツステンレス</td></tr><tr><td>バンナススプリングハサミ</td><td>F.S.T.</td><td>2-220&nbsp;</td><td>JJECK ステンレス</td></tr><tr><td>ポリグラクチン縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>J488G</td><td>7-0 縫</td></tr><tr><td>合止血剤</td><td>F.S.T.</td><td>12075-12&nbsp;</td><td>ドイツステンレス</td></tr></tbody></table>

光化学誘起後方虚血性視神経障害のラットモデル

Rat Model of Photochemically-Induced Posterior Ischemic Optic Neuropathy

後方虚血性視神経症（パイ中間子）は、臨床診療における視覚壊滅的な疾患です。しかし、その病因と自然史はあまり理解残っていました。最近、我々は、パイ中間子の信頼性、再現可能な動物モデルを開発し、このモデル1のいくつかの神経栄養因子の治療効果を試験しました。このビデオの目的は、後部虚血性視神経障害の我々の光化学的誘発モデルを実証するために、および網膜神経節細胞の逆行性標識して、その効果を評価することです。後部視神経、光増感色素、エリスロシンBの外科的露出の後に、静脈内に注入されたレーザ光は、視神経の表面上に集束されます。血小板血栓症および浮腫性圧縮によって媒介微小血管閉塞を促すエリスロシンBと照射損傷時のレーザ血管内皮の光化学的相互作用、。結果として虚血性傷害は緩やかなもののpronouncをもたらしますリモート、損傷誘導と臨床的に関連する結果 - 軸索入力の喪失に起因して、網膜神経節細胞の枯死を編。したがって、このモデルは、パイ中間子の病態生理学的経路を研究するための新規のプラットフォームを提供し、さらに、視神経症、ならびに他のCNSの虚血性疾患の治療アプローチを試験するために最適化することができます。

この技術によって誘導された結果として虚血性傷害は、虚血性軸索損傷後の網膜神経節細胞の緩やかなものの顕著な死をもたらします。これは、ヒトの疾患において観察されるものと同様の臨床的に関連性の結果です。 FG逆行性標識はパイオン後のRGC生存を定量するために使用されます。同じ方法を成功したモデルの作成 ​​を検証するだけでなく、異なる治療法の効果を評価するために使用される。 図1は、制御から網膜フラットマウントでFG陽性細胞（ 図1A）の代表的な共焦点画像を、偽処理（レーザーを示していますのみ/なしエリスロシンB、 図1B）、および2週間後パイオン処理された（ 図1C）動物。対照動物と比較して、より少ないFG陽性細胞は2週間パイオン誘導後の動物に存在します。コントロールおよび偽処理（レーザーのみ/なしエリスロシンB）動物でのRGCの数との間に有意差は観察されません。ティsがパイオン誘導性のRGC損失はなく、単独のレーザからの熱エネルギーを、エリスロシンB及びレーザー照射の組合せによって誘発されることを示してい...

このプロトコルの目的は、光化学ラットにおける後部視神経に虚血損傷を誘導することです。このモデルは、後部の虚血性視神経症の病態生理学の研究、およびこれと他の視神経障害のためだけでなく、他のCNSの虚血性疾患の治療的アプローチに重要です。

Posterior Ischemic optic neuropathy (PION) is a sight-devastating disease in clinical practice. However, its pathogenesis and natural history ...

このビデオの目的は、光化学的に誘発された後方虚血性視神経症モデルを提示し、50歳以上の患者における網膜神経節細胞の逆行性変性への影響を評価することです。虚血性視神経症は、急性視神経症の中で最も頻度の高いタイプです。この病態は、影響を受ける特定の血流供給源および臨床像に基づき、前方虚血性視神経症または後方虚血性視神経症の2つのサブタイプとして現れます。前方虚血性視神経症の病態については広く研究されてきましたが、後方虚血性視神経症はその有病率の低さ、多様な呈示、および不十分な診断基準のため、ほとんど解明されていません。さらに、前方または後方虚血性視神経症による視力喪失を効果的に予防または回復させることが証明された治療法は存在しません。したがって、後方虚血性視神経症の再現性と信頼性の高い動物モデルは、生体内で疾患プロセスを研究し、神経保護および軸索再生のための新しい治療法を試験する上で非常に価値があります。微小血管への光化学的に誘発された虚血性損傷は、血管性浮腫と血栓症を引き起こし、局所的な組織虚血を効果的に作り出します。虚血性損傷は隣接領域へと拡大し、それに伴う血管原性浮腫による微小血管の圧迫によってさらに悪化します。私たちは、後方虚血性視神経症によって引き起こされる損傷を再現するため、Bbar視神経のディレクターを介してこの形態の虚血を選択的に誘導しました。ここでは、WangとDale Brownがこの手順をステップバイステップで実演します。我々の知る限り、後方視神経における虚血性損傷モデルは、物理的な外傷を避けつつ虚血を誘発できるため、これまで開発されてきました。これにより、後方虚血性視神経症の生理学的プロセスをより正確に模倣できると考えられます。このビデオでは、後方視神経を外科的に露出させた後の、後方虚血性視神経症の再現モデルの全手順を実演します。光増感染料を静脈内に注入し、レーザービームを視神経表面に集光させます。照射中のeryri Bとレーザーの光化学的相互作用が血管内皮を損傷し、血小板血栓症と血管圧迫によって介在される微小血管閉塞を誘発します。その結果生じる虚血性損傷により、軸索入力の喪失に起因する緩やかではあるが顕著な網膜神経節細胞の脱落が起こります。これは遠隔損傷によって誘発される、臨床的に関連性のある結果です。最大出力300 milliwatts、波長532 nanometersで動作するYAレーザーを使用します。次に、250 hertzで動作するビームチョッパーを用い、平均出力をピーク出力の7.5%まで低減させます。また、通常は閉じた状態にあるENCビームシャッターを使用しており、閉じた状態で弱いエイミングビームを出すために、直径100 micronの小さな穴が開けられています。次は焦点距離25 centimeterの平凸レンズ、そして最後に、ビームを視神経に向けて下方へ導くための赤い直角プリズムです。光源から射出されたレーザービームはチョッパーを通過し、平均出力がピークの7.5%まで低減されます。その後、チョップされたビームはシャッターによって遮断されます。シャッターを閉じた状態では、ビームが直径100 micronの穴で空間フィルタリングされることにより、非常に弱いエイミングビームが生成されます。この弱ビームはレンズによって集光され、直角プリズムを介して露出した後方視神経へと下方に向きを変えられます。手術用顕微鏡の光路にセーフティフィルターを切り替えることで照射が開始され、1秒の遅延後にビームシャッターが開きます。この時点で、フルパワーのチョップビームが集光され、露出した視神経に向けて下方へと照射されます。ビームと血流中に溶解したエチンBが相互作用すると、532 nanometerのグリーンレーザー光が循環している赤血球およびB色素によって効率的に吸収され、黄色に蛍光します。三重項状態の色素分子に分子状酸素が衝突すると、励起エネルギーを受け取って一重項酸素となり、これは非常に高い反応性を持ちます。この一重項酸素が血管内皮を直接過酸化し、バリアに点状の損傷を引き起こします。これにより特異的に血小板が集まり、また実質への血漿漏出が促進されます。したがって、この損傷プロセスは血栓症による血管閉塞と、微小血管の圧迫による血管原性浮腫の両方を引き起こし、後者はレーザー光の浸透深さを超えて病変を拡大させます。この手法が正しく行われれば、血小板トロンビンに線維は含まれません。これにより、本手法は効率が大幅に低い熱依存性の足凝固プロセスとは区別されます。高ピークパワーでの動作により、ビーム経由で平均電力を7.5%に低減しつつ、乳白色の視神経への有効浸透深さを向上させます。チョッピング（切断）を行うことで、熱的なプロセスではなく化学的なプロセスによって組織損傷が誘発されていることを確実にします。ケタミンとジアゼパムのカクテルを腹腔内投与してラットを麻酔します。麻酔後、窒息を防ぐために舌をそっと前方に引き出し、手術部位を剃毛し、手術中の角膜乾燥を防ぐために両眼に潤滑剤を塗布します。手術中に動物が痛みを感じないよう、麻酔の深度を確認してください。大腿静脈のカテーテル挿入から開始します。手術操作の前に、あらかじめ計量した2%eryri B溶液を入れた1 mLシリンジに、滅菌済みで生理食塩水でフラッシュしたチューブを接続します。体重1 kgあたり20 mgの用量で、シリンジを注入ポンプに装着し、注入速度を600 µL/minに設定します。手術部位を10%ポビドンヨードで拭き、続いて70%エタノールで清浄します。15番メスを用いて右大腿部の基部を切開します。ハサミで膜を切開および展開し、大腿静脈の分枝が視認できるまでピンセットで筋肉を分離します。必要に応じてハサミとピンセットを用いて下方へ解剖を続け、血管を周囲の組織から分離します。静脈の視認性を高めるため、手術部位を冷たい滅菌BSSで洗浄します。静脈、動脈、および神経を包む鞘を、下層の組織から慎重に分離します。次に、静脈の両側を鈍的剥離して分離します。血管を慎重に持ち上げ、微細チップピンセットを下に挿入して掴んで引き抜くことで、2本の針付きナイロン縫合糸を静脈の下に通します。遠位側の静脈をきつく結紮し、近位側の静脈には緩い結び目を作ります。遠位結紮部の近くで静脈を部分的に切開し、必要に応じて広げます。ピンセットで切開部の静脈壁を保持しながら、生理食塩水フラッシュ用チューブを血管内に慎重に挿入します。その後、チューブの周囲で緩めておいた近位側の結紮糸を締め付けます。チューブを遠位側の縫合糸に結びつけて固定します。カテーテル挿入の質を確認し、閉塞や漏れがないことを確かめた後、カテーテルと組織を保護するために、切開部を縫合して一時的に閉じます。手術部位を10%ポビドンヨード洗剤溶液と70%エタノールで消毒します。15番メスを用いて眼球後方の皮膚を切開し、次いでヴェニス剪刀を用いて結合組織を切断します。眼窩骨の上縁に沿って、結合組織の剥離を続けます。この際、局所の血管を損傷しないように注意してください。上直筋が視認できるまで、眼窩組織を剥離します。視神経はその下に位置しています。皮膚のフラップと結合組織を外側および下方へ牽引します。すると、眼球が前方および外側へと回転します。鋭いピンセットを慎重に挿入し、神経を露出させるために神経と平行に広げます。レーザー照射中は、神経に栄養を供給している微小血管網をターゲットにします。レーザー光から身を守るため、レーザー照射装置の操作中は常にオレンジ色の保護メガネを着用してください。レーザーの電源を入れ、ピーク出力と平均出力を数分間かけて調整します。すべての照射手順を開始する前に、動物を装置の上にそっと置き、照準ビームが視神経の露出部位の近くに当たるように位置を調整してください。次に、微細チップ鉗子を用いて視神経の長さを慎重に再露出させます。照準ビームが視神経乳頭から3～4 mm後方の視神経に当たるように、位置を微調整します。輸液ポンプを作動させて2% rosin B溶液を注入し、数秒間循環させます。この間、BSSを少量滴下して視神経の表面を湿らせてください。エイミングビームの位置を確認した後、フットスイッチで制御されるセーフティフィルターを作動させ、続けてレーザー照射を開始し、90秒間照射します。フィルターを通してオレンジ色に見える黄色蛍光が神経の上面に観察されるはずであり、この蛍光が視神経全体に均一になるようにします。ラットの位置をわずかに調整しながら行います。照射後、セーフティフィルターは自動的に開きます。場合によっては微小出血が観察されることがあるため、外眼筋への牽引を緩めて眼球を中立位に戻し、切開部を結節縫合で閉鎖する。大腿静脈カテーテルを固定している縫合糸を切断し、チューブを慎重に抜去する。漏出を防ぐため、大腿静脈の近位端をしっかりと結紮し、切開部を結節縫合で閉鎖する。両方の切開部位に抗生物質軟膏を塗布し、眼底を確認して中心網膜静脈および動脈の血管整合性をチェックします。動物を清潔な加温ケージに戻して回復させ、術後の鎮痛剤を投与し、動物のケアを行います。これらは施設の動物愛護ガイドラインに従って実施してください。術後の動物を頻繁に観察し、切開部位が清潔で感染がないことを確認し、疼痛を評価して適切な鎮痛剤を投与し、適切な摂食およびその他の行動をモニタリングしてください。網膜フラットマウントの共焦点イメージングを用いて、コントロール動物と比較したレトロリピン投与後の後方虚血性視神経症誘発後の網膜神経節細胞の生存率を定量化できます。PIN誘発から2週間後の動物では、神経節細胞の数が有意に減少しています。シャム対照群の動物における網膜神経節細胞数に有意な差は見られませんでした。これは、網膜神経節細胞の脱落が、レーザー単独による熱エネルギーではなく、Bとレーザー照射の組み合わせによって誘導されたことを示しています。本手順において最も重要な部分は、視神経の露出と照射です。シャークファインチップピンセットによる損傷や、眼動脈における牽引を防ぐため、慎重に解剖を行う必要があります。視神経乳頭から約1 mmの位置で視神経を切断します。視神経乳頭から3～4 mm離れた位置に放射照射を行うことは、虚血範囲を網膜内側に供給する動脈およびその分枝ではなく、神経に供給する毛細血管のみに限定するために重要です。レーザー照射のパラメータを設定した後、処置後の中心網膜動脈および静脈の血管の完全性を確認するために、内視鏡検査が必要です。ピーク強度と照射時間は虚血性損傷の2つの決定要因であるため、このモデルでは細胞死の再現性のあるタイムコースが得られます。さらなる最適化を行うことで、これらのパラメータの重症度を調整し、異なる研究目的に合わせて網膜神経節細胞損傷の程度を調節することが可能です。本モデルは、後方虚血性視神経症の病原性および分子変化に関する研究のための新しいプラットフォームを提供し、本疾患およびその他の中枢神経系虚血性疾患の治療薬のスクリーニングに利用できます。

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光化学誘起後方虚血性視神経障害のラットモデル

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