Name: 小オリゴマー形成膜タンパク質の沈降平衡：五量体安定性に対するヒスチジンプロトン化の影響 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶ沈降平衡法による膜タンパク質のオリゴマー形成解析。C14スルファレン界面活性剤中で小さな疎水性ポリペプチドの五量体サイズとpH変化による安定性を評価する手法を解説。

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この研究は、National Research Foundationの助成金NRF-CRP4-2008-02 (J.T.)およびTier 1助成金RG 51/13によって資金提供されています。

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<li>Jin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+respiratory+syncytial+viruses+with+deletions+in+the+NS1%2C+NS2%2C+SH%2C+and+M2-2+genes+are+attenuated+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo.</a> Virology. 273, 210-218 (2000).</li>
<li>Karron, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+SH+and+G+proteins+are+not+essential+for+viral+replication+in+vitro%3A+clinical+evaluation+and+molecular+characterization+of+a+cold-passaged%2C+attenuated+RSV+subgroup+B%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).</li>
<li>Whitehead, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+respiratory+syncytial+virus+bearing+a+deletion+of+either+the+NS2+or+SH+gene+is+attenuated+in+chimpanzees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees.</a> J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).</li>
<li>Rixon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+hydrophobic+%28SH%29+protein+accumulates+within+lipid-raft+structures+of+the+Golgi+complex+during+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection.</a> J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).</li>
<li>Collins, P. L., Mottet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+orientation+and+oligomerization+of+the+small+hydrophobic+protein+of+human+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus.</a> J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).</li>
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<li>Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+%28hRSV%29+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science+%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

本論文では、平衡沈降を使用して、洗剤の小さな膜タンパク質のオリゴマー化の試料調製および分析のための実験プロトコルを提供します。密度マッチングステップが必要とされないように記載されるプロトコルは、可溶性タンパク質に同等に有効で-and simpler-ある。実際に、システムは、界面活性剤とタンパク質との混合物で構成されている。それは、粒子浮選に寄与しないように、沈降研究を実施するために、界面活性剤は、重力場には見えなければなりません。このように、洗剤の密度は慎重に使用される洗剤は、あまりにも密である場合、 例えば 、SDSは、ありませんさらに100％D 2 Oは、それを一致させることができることを制限して、バッファへのD 2 Oを添加することによって一致する必要があります。水溶性タンパク質を扱う際、試料が界面活性剤を有していないので、密度マッチングステップは、必要とされない。 我々のアプリケーション、イオンchannを形成小さなウイルスタンパクでELSが使用されている。すべてviroporinsと同様に、SHタンパク質はα...

分析超遠心分離1-5は弱いと強い相互作用の両方にアクセス可能であること、生理的条件下での高分子の相互作用を研究するための最も重要な方法の一つである。この方法は、無標識であり、光吸収または干渉を利用し、さらに蛍光光学システムは、大きさが6の数桁にわたって濃度範囲にアクセスするために使用することができる。 ほとんどの生化学的過程が可逆的相互作用に依存するため、この方法は特に便利です。これらの相互作用の化学量論および強度を定量的生物学的プロセスを理解することを特徴とする必要があり、多数の方法が、この目的の7,8のために存在する。しかし、一時的な相互作用は、9を研究することは困難である。 巨大分子の相互作用を特徴付けるための方法の選択は、その静的または動的な性質に依存する。最初のケースでは、sedim<html> entation速度（SV）は、半径方向の輸送速度が測定され、複合体が浮力質量と形状の違いに基づいて分画される場合、使用されている。 対照的に、実験の時間スケールで可逆的で動的な関連付けは、物理的に分離することができない。この場合には、自己または非共有結合性相互作用をもたらすヘテロ相互作用は、総タンパク質濃度に依存して平衡状態にある。これらの動的な相互作用は、沈降平衡（SE）及び沈降速度（SV）10の両方で研究することができる。しかし、第一の方法は、実行するために簡単であり、ここで説明されている。平衡拡散沈降の間に到達するようにSEでは、遠心分離が十分に低速で行われる。この時点で、半径方向距離の関数としての光信号（UV-VIS）の平衡プロファイルは、アソシエーション11用に事前設定された熱力学モデルを用いて分析することができる。 ve_content &quot;&gt;本研究では、沈降平衡試験があるため、その疎水性のイオンチャネルを形成し、ウイルス膜タンパク質の自己会合が示されているが、実験は、界面活性剤の存在下で実行され、この場合の密度のさ溶媒は、界面活性剤のそれに一致させる必要があるが、記載されるプロトコルは、水溶性タンパク質の場合には同一の場合と、無溶媒濃度マッチングを必要としないであろうことを除いて。 使用されるタンパク質は、世界中のヒト呼吸器合胞体ウイルス（はhRSV）、乳児の下気道疾患の原因となるパラミクソウイルス科に包まニューモ、高齢者や免疫不全の集団12でエンコードされます。最大6400万はhRSV感染16万人の死亡の症例が毎年発生すると報告した。 はhRSVゲノム三膜タンパク質F、G、及び小さな疎水性（SH）を含む11のタンパク質を転写する。 SHタンパク質が関与しているRSV感染の病因に。 SH遺伝子（RSVΔSH）を欠くRSVは、生存可能であったシンシチウムの形成を引き起こし、野生型（WT）ウイルス13-16と同様に増殖した。しかし、RSVΔSHウイルスは上気道15、16にWTよりも低い効率で10倍に複製。また、RSVΔSHウイルスはin vivoでのマウスとチンパンジーモデル13、17で減衰されました。 SHタンパク質は、主にゴルジコン ​​パートメント18の膜64に蓄積する（RSVサブグループA）または65（RSVサブグループB）アミノ酸長いII型内在性膜タンパク質である。 SHタンパク質は高度に保存されている20,21を単一の予測ヘリックス膜貫通（TM）ドメイン19を有している。 C-およびN-末端膜外ドメインは、それぞれ、内腔に/細胞外及び細胞質に配向されている。 両方の合成TMドメイン（残基18-43）及び全長SHタンパク質は、界面活性剤の様々なhomopentamersを形成することが示されている。ホモ五量体の形は、平面脂質二重層22,23におけるチャネル活性を担当しています。脂質二重層におけるTMモノマーの正しい配向は、第1のインターらせん配向に近い内腔であることのHis-22を示した部位特異的な赤外線二色23を使用して決定した。同一のTMドメイン配向は、ドデシルホスホコリンにおける全長タンパク質の五量ヘリックスバンドル（DPC）が22をミセルが再構成されたNMR研究により確認された。この「ミセル」モデルでは、単一のA-らせんTMドメインは、拡張B-ヘアピンによってC末端AヘリックスによってN末端が隣接し、そしてた。 SHタンパク質の2つのプロトン化可能な残基のHis-22およびHis-51、TMドメイン（内腔に配向）に配置され、膜外C末端βヘアピンの先端のそれぞれ、（遠チャンネル孔から）。バイセルエンバイロでnmentは、しかし、TMのαヘリックスは、彼の-51にまで延びており、両方のHis残基は、チャンネル24の内腔にアクセス可能である。チャネル構造は、（のCys-45へのSer-29）狭い地域漏斗のようなアーキテクチャ22は、22は疎水性側鎖（イル·32、イル= 36、イル= 40およびLeu-44）が並んで採用しており、イル·36は、チャンネル内腔に狭いポイントを定義します。のHis-51が最も小さい開口部の先端部に、一方のHis-22は、このファンネルの最大の開口部に配置されている。 本論文では、沈降平衡モードでの分析の遠心分離は、Hisプロトン化は、SHタンパク質五量の安定性に影響を与えるかどうかを決定するために使用されてきた。この場合、SHタンパク質は、そのSHタンパク質の形態五量体オリゴマー22を表示するために以前に使用されているC14-ベタイン界面活性剤で可溶化した。

<table><tbody><tr><td>3-(N,N-ジメチルミルミスチルアンモニオ)プロパンスルホン酸</td><td>シグマ</td><td>T0807</td><td></td></tr><tr><td>酸化重水素 99.8%</td><td>ケンブリッジ同位体</td><td>DLM-4-99.8</td><td></td></tr><tr><td>An-50 Ti ローター、分析、8 プレース</td><td>ベックマン コールター</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>An-60 Ti ローター、分析、4 プレース</td><td>ベックマン コールター</td><td>361964</td><td></td></tr><tr><td>セル ハウジング</td><td>ベックマン コールター</td><td></td><td></td>334784</tr><tr><td>12 mm 6チャンネルセンターピース、エポンチャコール入り</td><td>ベックマンコールター</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>ウィンドウホルダー</td><td>ベックマンコールター 305037</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウィンドウガスケット</td>ベ<td>ックマンコールター</td><td>327021</td><td></td></tr><tr><td>ウィンドウライナー</td>ベ<td>ックマンコールター</td><td>362329</td><td></td></tr><tr><td>サファイアウィンドウ</td><td>ベックマンコールター</td><td>307177</td><td></td></tr><tr><td>クォーツ窓</td><td>ベックマン・コールター</td><td>301730</td><td></td></tr><tr><td>ネジリングワッシャー</td><td>ベックマン・コールター</td><td>362328</td><td></td></tr><tr><td>スクリューリング</td><td>ベックマン・コールター</td><td>301922</td><td></td></tr><tr><td>スピンコート</td><td>ベックマン・コールター</td><td>306812</td><td></td></tr><tr><td>トルクスタンドアセンブリ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>361318</td><td></td></tr><tr><td>カウンターバランス</td><td>ベックマン・コールター</td><td>360219</td><td></td></tr><tr><td>セルアライメントツール</td><td>Beckman Coulter</td><td>362340</td><td></td></tr><tr><td>SEDNTERP</td><td></td><td></td><td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td></tr><tr><td>HeteroAnalysis&nbsp;</td><td></td><td></td><td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td></tr><tr><td>SEDFIT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm</td></tr><tr><td>SEDPHAT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm</td></tr></tbody></table>

小オリゴマー形成膜タンパク質の沈降平衡：五量体安定性に対するヒスチジンプロトン化の影響

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

分析用超遠心分離（AUC）は、相互作用の強さの広い範囲にわたって、生理的条件下において高分子間の可逆的な相互作用を研究するために使用することができる。これはAUC定量的に化学量論および生化学過程で一過性で可逆的でホモおよびヘテロ会合の熱力学を評価するための最適な方法になります。沈降平衡（SE）のモダリティでは、拡散と沈降の間のバランスは、特定の相関モデルに依存して半径方向距離の関数としてプロファイルを提供しています。本明細書において、詳細なSEプロトコルは、分析用超遠心を用いた小型膜タンパク質のオリゴマーのサイズ及びモノマー - モノマー関連エネルギーを決定するために記載されている。 AUC-ESは、物理的原理に基づいて、無標識であり、そして水溶性及び膜タンパク質の両方で使用することができる。例は後者の表示され、人間の呼吸器合胞体ウイルスの小さな疎水性（SH）タンパク質（はhRSV五量体イオンチャネルを形成する単一のαヘリックス膜貫通（TM）ドメインを持つ）、65アミノ酸のポリペプチド。 NMRベースの構造データは、SHタンパク質がチャネルの内腔に面して配向され、その膜貫通ドメイン二つのプロトン化のHis残基を有することを示している。 SE実験は、pHが会合定数及びSHタンパク質のオリゴマーサイズにどのように影響するかを決定するために設計されています。五量体形態はすべての場合に保存されたが、その結合定数が低いpHで減少した。これらのデータは、SHタンパク質内の2つのHis残基の内腔の向きと一致SHチャネル活性について観察同様のpH依存性と一致している。後者は、静電反発力が発生し、低pHでのオリゴマーの安定性を低減することができる。要約すると、この方法が適用されるたびに、生理学的条件の微妙なタンパク質 - タンパク質会合の変化に関する定量的情報を測定する必要がある。

50mMのトリスC14SBの界面活性剤ミセルの径方向分布プロフィール、100mMのNaCl pH7.3の形の線形モデル（ 図7A）に装着することができ、非常に浅い指数関数。この分布の傾きは逆にD 2 O濃度（ 図7B）と相関している。傾きがゼロとなる点、 すなわち、マッチングD 2 O濃度は、32.3％であることが見出された。 以下の図7を参照してください。 同じ実験を、異なる緩衝液について繰り返した：50mMリン酸ナトリウム、100mMのNaClをpH5.5および50mMのリン酸-クエン酸、100mMのNaCl pHを3に一致するDはそれぞれ30.3％および41.0％の2 O濃度を得た。 洗剤中のSH野生型（wt）のサンプルは、15000、19000、...

沈降平衡(SE)は、生理学的環境におけるタンパク質間相互作用の研究に使用できます。この論文では、この手法を使用して、ヒト合胞体呼吸器ウイルス(hRSV)によってコードされる小さな疎水性(SH)タンパク質によって形成されるホモペンタマーの安定性に対するpHの影響を決定する方法について説明します。

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

本実験の全般的な目的は、C 14 sulfalane界面活性剤中で小さな疎水性ポリペプチドによって形成されるオリゴマーのサイズを決定し、pH変化に伴うこのオリゴマーの安定性を評価することである。まず、界面活性剤ミセルの密度と一致し、その浮力を中和する重水の濃度を決定する。次に、可溶化した小さな疎水性タンパク質試料を用いて、一連の沈降平衡実験を行う。C 14 sulfalane洗剤を用いて、決定した洗剤濃度で実行します。次に、異なるpHにおいて第1ステップと第2ステップを繰り返し、これらの様々なpH値におけるタンパク質の沈降プロファイルを比較します。その結果から、この洗剤中における低分子疎水性タンパク質のオリゴマーサイズと、C 14 sulfalane洗剤におけるこのオリゴマーの安定性にpHが及ぼす影響の両方が明らかになります。この手法では、アセンブリや細胞のロード、密度の整合、平衡状態への到達など、多くのステップが含まれているため、視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。これらは、初めて使用するユーザーにとって負担が大きく、混乱を招きやすいためです。これらのステップでわずかなミスが生じても、数日分の実験時間を無駄にする可能性があります。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程学生であるsuriaが行います。まず、10倍バッファーと50倍界面活性剤を調製します。それぞれのストック溶液を0.2 µmのシリンジフィルターでろ過滅菌し、1.5 mLのエッペンドルフチューブに分注します。次に、容量比で重水（deuterium oxide）を10%、30%、50%含有する3種類のサンプル溶液を、それぞれ200 µLずつ調製します。外部充填なしで6チャンネル分析超ろ過セルを組み立てるには、ウィンドウガスケットをウィンドウホルダーに入れ、ウィンドウライナーをわずかに曲げて、ウィンドウホルダーの反対側に隙間ができるようにウィンドウホルダーに配置します。次に、サファイアウィンドウをウィンドウライナーの中に配置し、マークをウィンドウホルダーに合わせます。最後に、部品番号付きのセルハウジングを、キーウェイがハウジングキーと一直線になるように逆さまに配置します。面取り加工された側面を下にして、6セクターのセンターピースをセルハウジングにスライドして挿入し、続いてウィンドウアセンブリをウィンドウを下に向けて挿入します。次に、スピンコート用潤滑剤をスクリューリングのネジ山とスクリューリングワッシャーに薄く塗布します。ウィンドウアセンブリの上にスクリューリングワッシャーを配置します。「out」の文字が外側を向くようにスクリューリングをウィンドウハウジングに取り付け、セルアライニングツールを使用してスクリューリングを手で締め付けます。次に、トルクレンチを使用して、スクリューリングを 60 inch pounds まで締め付けます。その後、部品番号が記載されたセルを垂直に立て、12時の位置に配置します。左列に 120 µL のリファレンス溶液を、右列に 110 µL のサンプル溶液をロードします。200 µL ピペットを使用し、各サンプルとリファレンスが正しくペアリングされていることを慎重に確認します。ウィンドウを下に向けた状態でウィンドウアセンブリをセルハウジングにスライドさせます。この際、内容物が漏れる可能性があるため、セルを過度に動かさないよう注意してください。前の手順を繰り返し、2つ目のスクリューリングを 120 inch pounds まで締め付けます。次にセルを反転させ、最初のスクリューリングを120 inch poundsまで締め直します。セルをローターにセットします。ローターを遠心機に取り付け、製造元の指示に従ってモノクロメーターを設置します。十分な真空度に達した後、遠心分離機を 3000 RPM で回転させます。ユーザーインターフェースソフトウェアで干渉パターンを確認し、最高のコントラストが得られるようにレーザーパラメータを調整します。次に、平衡および干渉測定を指定して、新しいセットアップファイルを作成します。タンパク質サンプルを用いて、回転数45,000 rpmまたは想定される最高速度、温度20 °Cで沈降平衡法を設定します。1回分のデータを収集した後、少なくとも12時間は15分ごとにスキャンを行います。Hetero分析でデータファイルを開き、マッチ関数を選択して平衡の進行状況をモニタリングします。ここで、前述と同様の方法で、石英窓を備えた6チャンネル分析用超遠心機セルを組み立てます。ゲルローディングチップを用いて、あらかじめ調製した最高濃度の低分子疎水性タンパク質サンプルをローターの中心に最も近いチャネルに、最低濃度のサンプルをローターの中心から最も遠いチャネルにロードします。吸光度測定の設定を行うため、平衡状態と吸光度測定を指定して新しいセットアップファイルを作成します。検出波長には280 nanometersを指定してください。次に、最初のスキャン前のラジアルキャリブレーション確認およびスキャンオプションで、3000 RPMでのラジアルキャリブレーションを行います。低解像度でのデータ収集を指定し、シングルスキャンを実行します。スキャン完了後、このオプションのチェックを外します。 previously calculated 20 °Cでの初速で動作するように沈降平衡法のセットアップを行い、各セルの詳細設定で30分ごとに1回のスキャンを収集するように設定します。少なくとも18時間後から低解像度でのデータ収集を指定してください。ヘテロ解析（hetero analysis）でデータファイルを開き、平衡に達した後にマッチ関数を選択することで、平衡の進行状況をモニターします。スキャン完了後、高解像度で1回のみスキャンを行います。各速度に到達して平衡に達するまでの時間が既知である場合は、次の速度についても前述のステップを繰り返します。あらかじめ算出したすべての速度を含め、各速度の平衡時間後に1回ずつスキャンを行うよう、沈降平衡法のスキャンを設定してください。このケースでは、各セルの詳細において高解像度のデータ収集を指定します。C 14 sultan detergentを含む細胞および50 molar リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.3）の径方向分布は、線形モデルに適合させることができる非常に緩やかな指数関数を形成します。このプロファイルの傾きは重水濃度に依存し、傾きがゼロになる濃度は32.3%であることが分かりました。同様の実験をpH 5.5およびpH 3で繰り返し、それぞれ30.3%および41%という一致する重水濃度を得ました。pH 7.3において、この小型疎水性タンパク質と界面活性剤はペンタマー（5量体）を形成し、見かけの親和度定数の対数は21.05であることが分かりました。結合定数はpH 5.5では変化しませんでしたが、pH 3では著しく減少しました。これは、pKaが約4.5であり、低pHでコンダクタンスが減少することを示した以前の報告と一致しています。平衡細胞アセンブリに習熟すれば、適切に行うことで、試料のロードと実験のセットアップを1時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、膜タンパク質のオリゴマーサイズを決定し、安定性や異なる実験条件下での比較を行うための、沈降平衡実験の準備方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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