共培養系における神経結合の形成を評価するための光遺伝学的アプローチ

本実験の全体的な目的は、Channel Rhodospsin-2（ChR2）を用いた培養ニューロンへの光刺激に基づく遺伝学的アプローチにより、ヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンの機能的接続形成能を評価するための共培養系を構築することです。まず、マウス一次神経前駆細胞（NPC）を単離し、それらをアストロサイトへと分化させます。次に、ラット一次皮質ニューロンにChR2を導入し、既存のニューロン集団として機能するアストロサイト層の上に播種します。

次に、人工多能性幹細胞（iPSC）培養から誘導されたヒトNPCにsynapsin one 2D tomatoウイルスを導入し、アストロサイト・ニューロン共培養系に播種して分化を誘導することで、シナプス接続を形成させます。CHR2を発現する皮質ニューロンに光遺伝学的刺激を与えた際のiPSC由来ニューロンにおけるポストシナプス電流の電気生理学的記録により、iPSC由来ニューロンがラット皮質ニューロンとシナプス接続を形成することが示されました。ヒトiPSC由来ニューロンとアストロサイトのみを共培養する既存の手法に対する本手法の主な利点は、これらヒトニューロンの成熟時間が短縮されることです。

これは、一次ニューロンの存在によってこれらのヒトニューロンの成熟が促進されるためです。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるUni Chinと、George Augustine研究室のsuing Yが行います。記述されたプロトコルに従ってラット胚脳を採取し、皮質組織を単離した後、あらかじめ加温しておいた皮質組織消化液を含むディッシュに皮質組織を移します。皮質組織をできるだけ細かく刻み、37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、皮質組織を50 mL遠心チューブに移し、組織片のない均一な溶液になるまでセロロジカルピペットを用いて組織を解離させます。

組織溶液を70 micronのセルストレーナーに通し、残っている組織塊を除去します。溶液3 mLを15 mL遠心チューブに分注します。

各チューブの底に7.5%BSA含有1×PBSを800 µL加え、組織層の下に層を形成させ、200 ×gで5分間遠心分離します。その後、2つの層の界面から吸引して上清を除去します。この際、チューブ底部の細胞ペレットを乱さないように注意してください。

1 mLの一次ニューロン培地を用いて各細胞ペレットを再懸濁させた後、それらすべてを15 mL遠心チューブにまとめます。次に、血球計数計を用いて細胞密度を測定します。6 million個のラット皮質ニューロンを200 ×gで5分間遠心分離し、上清を除去します。

エレクトロポレーションには、少なくとも6 million個の皮質ニューロンが必要です。生存したニューロンによるニューロンネットワークの形成を確実にするため、細胞ペレットに100 µLのエレクトロポレーション溶液を加え、穏やかに再懸濁します。次に、細胞懸濁液100 µLと6 µgのCR twoプラスミドを混合し、認定されたキュベットに移します。

メーカーの指示に従って、エレクトロポレーションに適したプログラムを選択し、適用します。エレクトロポレーション後、キュベットに500 µLのMEMを加えます。細胞を11.5 mLの一次ニューロン培地に移し、穏やかに再懸濁します。

次に、マウスアストロサイトを含む24ウェルプレートの各ウェルに500 µLを加えます。プレートを37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。人工多能性幹細胞（iPSCs）を作製した後、テキストプロトコルに従って、細胞をヒト神経前駆細胞（NPC）培養として誘導し、維持します。

この例では、アストロサイト培養液に一次ニューロンを加えた翌日に、レンチウイルスベクターsynapse in one TD tomatoを用いてNPCを標識します。1×PBSでヒトNPCを1回洗浄し、その後、細胞剥離溶液を加えて30 °Cで5分間インキュベートします。すべての細胞が剥離していることを確認してください。

その後、2倍量のD-M-E-M-F 12を含む15 milliliterチューブに移し、200 Gで5分間遠心分離します。上清を除去し、神経分化培地を用いてペレットを穏やかに再懸濁し、単一細胞にします。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。

次に、アストロサイト皮質ニューロン培養プレートから培地を慎重に吸引します。神経分化培地を用いて、ウェルあたり1cm²あたり5,000個のヒトNPCsを播種します。37°C、5%CO2条件下でインキュベートし、少なくとも28日間、2〜3日ごとに培地を交換してください。

ヒトIPCが成熟ニューロンのように振る舞うかを確認するため、60倍の水浸レンズを装着した共焦点顕微鏡を用いて、ヒトIPCから分化した細胞を探索します。TD tomatoを可視化してください。記録用ピペットを引き、抵抗値が4～6 MΩになるように調整して灌流させます。

室温にて、95%酸素および5%二酸化炭素で絶えずバブリングした外部溶液中に細胞を置きます。内部溶液を用いて記録用マイクロピペットを満たし、ホールセルモードでTDトマト陽性細胞にパッチクランプを行い、カレントクランプ下での電流注入に対する活動電位の発生を記録します。これにより、ChR2を発現している皮質細胞の活動電位が、光刺激によって確実に誘発されることを確認します。

まず、水銀アークランプによる光照射下で、480/40 nmの励起フィルターを用いてGFPを可視化し、CRを発現している皮質細胞を特定します。その後、ホールセルモードでのカレントクランプ記録により、活動電位が確実に誘発されることを確認します。遺伝的刺激を行うには、水銀ランプの全視野照射および480/40 nmの励起フィルターを用いて、TD tomato陽性細胞をホールセルモードでパッチし、ボルテージクランプを-70 mVに設定します。

視野全体を30秒間刺激します。ChR2を発現する前シナプス皮質ニューロンの光刺激によって誘導される、パッチクランプ細胞の後シナプス電流（PSC）を記録します。振幅および電流面積の閾値をそれぞれ5 pAおよび5 pA・sに設定し、これらのイベントを手動で確認して、PSCではないトレースを除外します。

このビデオで実演しているように、iPC由来ニューロン、初代皮質ニューロン、およびアストロサイトの共培養系を構築するには、いくつかの手順が必要です。この画像は、マウスNPCをアストロサイトへ分化させてから2日目で、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）陽性のアストロサイトが容易に観察できることを示しています。マウスNPCを少なくとも1週間分化させた後、CR2を発現する皮質ニューロンをアストロサイト単層上に播種しました。この共培養系における両細胞は、GFAPおよびCHR2の免疫蛍光染色によって同定されます。

ヒトNPC分化の3〜4週間後、ここに示すように、培養物中にTD tomato陽性ニューロンが検出されました。光刺激を与えると、CHR two IPSCを発現している皮質ニューロンにおいて活動電位が生成されました。誘導されたニューロンは興奮性も有しており、活動の増加を示しています。

脱分極電流パルスの振幅を増大させると、活動電位が発生した。光がない状態で、iPSC由来ニューロンは自発的なシナプス入力を受けた。これらの内向きポストシナプス電流は、主にAMPA受容体を介して媒介されていた。

皮質ニューロンへの光刺激を32回目の長い光フラッシュの間継続させたところ、PSCの頻度が上昇しました。ChR2を発現している皮質ニューロンを光刺激した際、その振幅に影響は見られませんでした。この手順に続き、異なる患者特異的な細胞種を用いた他の共培養システムを使用することで、関心のある特定の疾患に対する候補薬物の影響など、さらなる疑問を解明することが可能です。