Name: 共培養系における神経結合の形成を評価するための光遺伝学的アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶ光遺伝学的アプローチによるiPSC由来神経細胞と一次皮質神経細胞の共培養系構築法。この手法は神経結合形成と機能的シナプス活動の評価に有用です。

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私たちは、IPSCの生成に関する専門知識とプロトコルを共有するため、それぞれにChR2とシナプシン-tdTomatoレンチウイルス構築物についてC.チャイをK. DeisserothとS.帝に感謝し、ワイオミング州レオン技術サポートのために、共有試薬および専門知識のためのゴーラボのメンバー。この作品は、ELGにその競争的研究プログラム（002から082 2008 NRF-CRP NRF）の下で国立研究財団シンガポールにより、アボット栄養とELGに優秀の学術センター（ACE）グラクソ·スミスクライン（GSK）から研究賞によってサポートされていましたし、 GJAへ：GJA、及び文部科学省によって資金を供給韓国国立研究財団（NRF）のワールドクラス研究所（WCI）プログラムで、韓国の科学技術（MEST）（WCI 2009-003 NRF認可番号）

<ol><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+mapping+of+synaptic+connectivity+using+photostimulation+in+Channelrhodopsin-2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Stroh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+stem+cell+differentiation+in+the+setting+of+automated+optogenetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation.</a> Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).</li>
<li>Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+neurons+adopt+and+regulate+the+activity+of+an+established+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).</li>
<li>Viviani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+coculture+of+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation and coculture of neurons and glial cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).</li>
<li>Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+of+human+iPS-cells+in+a+rat+cortical+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiologiae+Experimentalis%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture.</a> Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).</li>
<li>Shivaraj, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taurine+induces+proliferation+of+neural+stem+cells+and+synapse+development+in+the+developing+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain.</a> PLoS ONE. 7, e42935(2012).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+and+long-term+self-renewal+of+primitive+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells+by+small+molecule+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neurons+and+photons+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting neurons and photons for optogenetics.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).</li>
<li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+Syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li>
<li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 160(2013).</li>
</ol>

利益相反は宣言されていません。

光遺伝学は、ニューロン13の定義された集団の活性化のための時間的·空間的な精度を提供します。我々の実験では、顕微鏡対物レンズの全視野は、光刺激のChR2を発現するだけ皮質ニューロンを30秒間照射した。これは、私たちは、シナプスの接続は、共培養内のニューロンの異なる集団の間に形成されたかどうかを判断することができました。我々の結果は、これらのニューロンがChR2をを表現するシナプス前皮質ニューロンからシナプス入力を受け取ることを示している、光刺激はIPSC由来の神経細胞でPSC周波数を増大させることを明らかにした。これは、順番に、IPSC由来の神経細胞が正常に皮質ニューロンを持つ回路に組み込まれていることを確立した。 この共培養系を生成するためのいくつかの重要なステップがある。これは、メッキを進める前に、最小限の細胞死に、マウスNPC由来の星状細胞培養が健康であることを確認することが重要です他の種類の細胞。皮質ニューロンと人間のNPCは健康的なアストロサイト上によく付着し、電気生理学的記録は、培養条件に大きく依存しています。このプロトコルの他の重要なステップは、星状細胞培養へのエレクトロポレーションおよび皮質ニューロンのメッキです。多数の細胞がエレクトロポレーション後に死滅したように、少なくとも600万皮質ニューロンを、24ウェルプレート中で星状細胞培養上にメッキする電気穿孔されることを保証することが重要である。私たちは、より少ない600万人以上の細胞をエレクトロポレーションした時、生き残るニューロンの数は、電気生理学的記録に影響を与えた密な神経回路網を形成していなかったことを観察した。エレクトロポレーション皮質ニューロンの数は、異なる研究間の比較を可能にするために、各共培養実験のための一貫している必要があります。酵素消化に関与するすべての手順については、それはあまりにもあれば細胞死につながる可能性があるために、消化液中で細胞を残さないことが不可欠である。 このアプローチは、他のニューロンとのシナプス接触を形成するために、患者固有の線維芽細胞から誘導された神経細胞の能力をスクリーニングすることができる。神経発達障害、レット症候群（RTT）に罹患している患者からの線維芽細胞から誘導されたニューロンは、シナプス伝達の欠陥を示す：RTTニューロンは、おそらく少ないシナプス接続14に、健康なニューロンに比べPSC周波数及び振幅の有意な減少を示す。我々の同時培養系は発達障害を表示するニューロンに対する薬物効果の検査を可能にする。これは、罹患した人間のNPCの播種の間、並びに神経分化の時間にわたって化合物への連続暴露中に目的の化合物の添加によって行うことができる。 この共培養系はまた、薬物試験のためのモデルとして使用することができるが、このアプローチの限界は、各候補化合物の効果を調査するプロセスは長くとして面倒であることであるそれは、ハイスループットスクリーニング法ではない。候補化合物で処理した後、IPSC由来のニューロンは、個別のPSCの各化合物の効果を決定するためにパッチを適用する必要があります。また、患者から多くの利用可能な線維芽細胞およびiPS細胞は、現在、存在しない。したがって、より多くの患者の細胞を有し、また、ハイスループットスクリーニングのためにこのプロトコルを適応させるために、近い将来において重要であろう。例えば、このようなイオンまたは膜電位の遺伝的にコードセンサーとして動作インジケータとIPSC由来のニューロンを標識することにより、サイドステッピング時間のかかる電気生理学的手順をすることにより、実質的にスループットレートを増大させることが可能であろう。電気生理学的記録を実行する線維芽細胞を再プログラミングから、この共培養系を生成するプロセス全体としては、90日以上、それはそれぞれのリプログラミングや神経誘導ステップの後、人間性IPSCまたはNPCはどちらが展開することをお勧めします必要があり、凍結保存将来の実験のために必要な時間を短縮する。 我々の実験では、我々はシナプシンプロモーター下皮質ニューロンにChR2を発現した。このプロモーターはパン神経であるため、我々は、おそらく抑制性と興奮性皮質ニューロンの両方を光刺激された。将来の実験の目的は、特に、阻害または刺激性のいずれかの回路を調べるためである場合、より特異的プロモーターを使用することができる。代替的に、皮質ニューロンは、トランスジェニック（またはウイルスを注射したマウス）にChR2の発現が特異的にニューロンの遺伝的に定義された亜集団を標的とするから得ることができる。例えば、Creリコンビナーゼは、フロックスChR2を持つマウスと交配されているパルブアルブミン含有介在ニューロン（PVの介在ニューロン）に発現しているマウスから収穫皮質組織は、ChR2をを表現する唯一の皮質ニューロンは、PVの介在ニューロン15になります状況が得られます。私たちの共同Cu中などChR2を発現介在ニューロンの使用ltureシステムは、パッチを適用したIPSC由来のニューロンがPVの介在ニューロンとの回路に組み込むことができるかどうかの決定を可能にします。 以前の研究9に基づき、皮質ニューロンは、in vitroで 14日後に樹状突起が重複する成熟している。光刺激は、パッチを適用したIPSC由来の神経細胞からの応答を誘発しない場合にはこのように、それはニューロンは、皮質ニューロンとシナプス結合を行う能力を持っていないことを示す必要があります。 IPSC由来のニューロンのいずれか他のIPSC由来の神経細胞または皮質ニューロンからシナプス入力を受信することができる。従来のパッチクランプ記録を用いた場合には、シナプス入力がどこから来ているのかを区別することは不可能である。私たちのシステムの利点は、皮質のシナプス前入力からシナプス後応答が選択的に誘発し、識別することができるということです。ここで概説した手順を統合するIPSC由来の神経細胞の能力を評価するために、簡単なアプローチを提供定義された神経回路網に。

近年では、ニューロン及び神経回路機能の我々の理解は、神経細胞の興奮性を制御するいくつかの光遺伝学的ツールで革命をもたらしてきた。そのようなツールが光活性陽イオンチャネルであり、チャネルロドプシン2（ChR2を）：光刺激1-3に対応してChR2を消防活動電位を発現するニューロン。神経細胞が光に通常は区別されませんので、この驚くべき能力は、ニューロン4の遺伝的に定義された集団の活動の正確な時間的および空間的制御のための新たな道を切り開くと大幅に脳機能の研究を加速しています。 ChR2をニューラルネットワーク6の活性を調節する神経発達5の監視が 、異なる目的のために幹細胞研究するために適用されている。 ここでは、神経細胞の共培養系の有用性を高めるためにChR2を用いる。共培養システムは、異なる細胞型の間の相互作用の評価を可能にする。ニューロンおよびグリアの共培養は、神経系の主要な細胞型は、一般的に、これらの異なる細胞型の間のシグナリングを調査するために、ならびに生理学的反応のためにこのシグナリングの重要性を評価するために、損傷の伝播及び検査するために使用されている潜在的にこのシグナル伝達7に関与する分子機構。以前の研究は、ヒトiPS細胞がラット皮質初代培養含有ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、およびミクログリア8の存在下でニューロンに非常に迅速に分化することを明らかにした。 このプロトコルでは、我々は、ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）に由来するラット皮質ニューロン及びニューロン間のシナプス結合を調べるために、共培養系でのChR2を利用する方法を実証する。我々は、アストロサイトに解剖するステップと収穫脳組織9と同様に、マウス神経前駆細胞を維持し、分化する（NPCの）を記述し、人間のNPC値intOニューロンは、共培養系を作成する。この共培養系を確立するために、我々は、ヒトiPS細胞を生成するために、 文献 10沖田らによって記載統合のない再プログラミング法を用いた。 Li らによって記載されているように、これらのiPS細胞は、その後、効率的小分子阻害剤を用いた化学的に定義された条件でのNPCに分化した。11 共培養では、ニューロンの異なる集団は、トマト（tdTomato）二量体蛍光タンパク質、タンデム経由IPSC由来のニューロンの皮質ニューロンにおけるChR2を発現の検出とタグ付けを介して同定することができます。皮質ニューロンの光遺伝学的光刺激とIPSC由来のニューロンからの電気生理学的記録を組み合わせると、互いに回路を形成するニューロンのこれら2つのタイプの能力の評価を可能にする。具体的には、ChR2を発現皮質神経細胞の光刺激は、シナプス回路を形成しているIPSC由来のニューロンにおけるシナプス応答を呼び起こす輝皮質ニューロンネットワークと。我々は、増加したシナプス後電流が実際にそのような条件下でIPSC由来のニューロンで検出されたことを示している。このプロトコルは、疾患患者からの線維芽細胞から派生iPS細胞を使って、別の神経疾患モデルの要約を含む実験条件、種々の条件下でシナプス回路の評価を可能にする。

<table><tbody><tr><td>Neurocult Proliferation Kit (Mouse)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5702</td><td>には、NSC基礎培地とNSC増殖サプリメント</td></tr>が含まれています <tr><td>Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>12719F</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>21103049 MEM グルタミン不使用</td><td>Invitrogen</td><td>11090081</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td></td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>25030081</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX サプリメント</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>15140122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Human LIF</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9484</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130103926</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td></td></tr><tr><td>Compound E</td><td>Merck Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck Millipore</td><td>324856</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R&D Systems</td><td>233FB025</td><td></td></tr><tr><td>研究用グレード FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30160.03</td><td>アストロサイト分化培地用</td></tr><tr><td>定義 FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>一次ニューロン培地用</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>一次ニューロン培地</td></tr><tr><td>用 スクロース</td><td>シグマ</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>EMD ミリポア</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>パパイン</td><td>ワージントン</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>ロシュ</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>収穫脳</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>70 & micro;m細胞ストレーナー</td><td>BD Biosciences&nbsp;&nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro;m フィルターユニット</td><td>ザルトリウス ステディム</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</>Fluka</td><td></td> <td>71505</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-グルコース</td><td>Sigma</td><td>G7520</td><td>電気生理学的研究用</td></tr><tr><td>K-グルコン酸</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>KANTO Chemical</td><td>3234400</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>電気生理学的研究用</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細血管</td><td>World Precision instruments, Inc</td><td>1604323</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 遠心分離管</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>50 ml 遠心分離管</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>9761146</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>T25 フラスコ</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>12 mm カバーグラス</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111520</td><td></td></tr><tr><td>AMAXA ラットニューロン Nucleofector キット&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>VPG1003</td><td>初代皮質ニューロンのエレクトロポレーション</td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>ヒト線維芽細胞のエレクトロポレーション</td></tr><tr><td>Mini Analysis&nbsp;</td><td>Synaptosoft</td><td>Mini Analysis v.6</td><td>PSCs</td></tr><tr><td>Normal Dermal Human Fibroblasts</td><td>PromoCell</td><td>C12300</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE</td><td>Addgene</td><td>20945</td><td></td></tr><tr><td>Mercury short-arc lamp</td><td>OSRAM</td><td>HBO 103 W/2</td><td></td></tr></tbody></table>の測定用

共培養系における神経結合の形成を評価するための光遺伝学的アプローチ

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

ここでは、2つの異なるニューロン集団からなる共培養を生成するためのプロトコルについて説明します。人工多能性幹細胞(iPSC)は、エピソームベクターを用いてヒト線維芽細胞から再プログラムされます。iPS細胞のコロニーは、線維芽細胞のリプログラミング開始から30日後に観察することができます。多能性コロニーは、神経誘導培地で手作業で選択して増殖させ、神経前駆細胞(NPC)への分化を可能にします。iPS細胞は、1週間以内に急速に神経上皮細胞に変化し、高い培養密度で維持されると自己複製能力を保持します。初代マウスNPCは、血清含有培地に7日間曝露することによりアストロサイトに分化し、その上に胚18日目(E18)ラット皮質ニューロン(チャネルロドプシン-2(ChR2)をトランスフェクト)添加した単層を形成する。蛍光タンパク質であるタンデムダイマートマト(tdTomato)でタグ付けされたヒトNPCは、翌日、アストロサイト/皮質ニューロン培養に播種され、28〜35日間分化させます。このシステムは、iPS細胞由来ニューロンと皮質ニューロンとの間にシナプス結合を形成していることを示しており、これは皮質ニューロンの光刺激によるシナプス電流の頻度の増加から明らかです。この共培養システムは、iPS細胞由来ニューロンが他のニューロン集団とシナプス結合を形成する能力を評価するための新しいプラットフォームを提供します。

ここで、共培養から星状細胞、皮質ニューロンおよびヒトの神経細胞の生成に関与する複数のステップを説明するプロトコルが示されている。ヒトiPS細胞は、エピソームベクター10と高密度（ 図1A）に維持されたNPCは11を作り、小分子阻害剤のカクテルで神経系統に指定を使用して線維芽細胞を再プログラムすることによって得た。 tdTomato（ 図1B）でタグ付けされた人間のNPCのアストロサイトへのマウスのNPCの分化、ChR2をを表現するラット皮質ニューロンのめっき、播種を：いくつかのステップが共培養を生成するのに必要とされる。分化の2日目に、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）+アストロサイトは容易に私たちの培養物（ 図1C）で観察することができる。マウスのNPCは、アストロサイトの単分子層（ 図1D）にChR2をを表現する皮質神経細胞をプレーティングする前に少なくとも1週間分化させた。 3の後人間のNPC分化の4週間、tdTomato +ニューロンは、培養物（ 図1E）で検出された。 この共培養系は、光刺激（ 図2A）に応答して、個々のIPSC由来のニューロンからシナプス後電流の一貫した検出を可能にする。光によって刺激されると、活動電位は、ChR2を（ 図2B）を発現する皮質ニューロンで生成された。 IPSC由来のニューロンは、現在の脱分極パルスの振幅が増加したように（ 図2D）増加し、活動電位発火を示す、また（ 図2C）励起可能である。したがって、これらの細胞は、成熟したニューロンの特性を示す。光がない場合には、IPSC由来のニューロンは、自発的なシナプス入力（ 図2E）を受けた。 GABA受容体を介して電流が外向きになるので、これらの内向きシナプス後電流は、主に、AMPA受容体によって媒介され、NMDA受容体は電流αを有していない-70 mVの保持電位トン。光刺激が大幅にシナプス後電流（ 図2E）の周波数を増加させているため、これらの入力のうちの少なくともいくつかは、ChR2を発現しているが、シナプス前皮質ニューロンからのものであった。シナプス入力の増加の時間経過を図2Fに示されている：皮質ニューロンの光刺激は、30秒の長い光のフラッシュを通して持続した。 ChR2を発現皮質神経細胞は（ 図2G）輝されたときのPSCの周波数が上昇したが、その振幅は（ 図2H）影響を受けなかった。要約すると、これらの結果は、IPSC由来のニューロンが成熟した神経細胞の性質を示し、シナプス前皮質ニューロンとシナプス結合を形成することができることを示している。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> 図1：共培養の生成のための模式図のNPCに性IPSCと神経誘導にヒト線維芽細胞を再プログラムするためのシステム。（A）のタイムライン。皮質ニューロンとアストロサイト培養物に対する成熟したニューロンへの人間のNPCの最終分化のために（B）タイムライン。（C）マウスNPCは急速に2の後GFAP +アストロサイトに分化するインビトロでの日数（D）1週間後にChR2を発現する皮質ニューロンのGFAP +星状細胞上にプレーティングした。（E）4〜5週目人間のNPCの分化後、電気生理学的記録は、tdTomato +ニューロンで行った。スケールバーは、100μmを表す。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> 図2：機能的なシナプスの接続性の光遺伝学的解析。 tdTomatoでタグ付けされた（A）IPSC由来細胞（赤色）は、皮質ニューロンが光活性を発現する共培養したチャンネル、ChR2を（緑）。 IPSC由来のニューロンからの記録は、皮質ニューロンまたは他のIPSC由来の神経細胞のいずれかから来ることができシナプス後電流（PSC）の応答を、明らかにした。（B）イルミネーション（青いバー）ChR2をを表現する皮質ニューロンにおける活動電位のシリーズを誘発。（ C）IPSC由来の細胞は、ChR2を発現皮質神経細胞の（E）光刺激（青いバー）。IPSC由来細胞の現在の関係を示す曲線D）焼成（。電流注入により誘発されるIPSC由来の神経細胞内のPSCの頻度が増加している光刺激によって生成PSC周波数の増加の。（F）時間のコース。青いバーが光刺激の時間を示している。 PSC周波数は光刺激（G）増加したが（G、H）、PSC振幅が（H）影響を受けなかった。 *はp &lt;0.05は、スチューデントのt検定を用いてコントロールと比較して示している。

人工多能性幹細胞(iPSC)に由来するニューロン、初代皮質ニューロン、およびアストロサイトからなる共培養システムを生成するためのプロトコルが説明されています。この共培養システムにより、新しいiPS細胞由来ニューロンとチャネルロドプシン-2を発現する既存の皮質ニューロンとの間のシナプス接触および回路の形成を検出することができます。

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

本実験の全体的な目的は、Channel Rhodospsin-2（ChR2）を用いた培養ニューロンへの光刺激に基づく遺伝学的アプローチにより、ヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンの機能的接続形成能を評価するための共培養系を構築することです。まず、マウス一次神経前駆細胞（NPC）を単離し、それらをアストロサイトへと分化させます。次に、ラット一次皮質ニューロンにChR2を導入し、既存のニューロン集団として機能するアストロサイト層の上に播種します。次に、人工多能性幹細胞（iPSC）培養から誘導されたヒトNPCにsynapsin one 2D tomatoウイルスを導入し、アストロサイト・ニューロン共培養系に播種して分化を誘導することで、シナプス接続を形成させます。CHR2を発現する皮質ニューロンに光遺伝学的刺激を与えた際のiPSC由来ニューロンにおけるポストシナプス電流の電気生理学的記録により、iPSC由来ニューロンがラット皮質ニューロンとシナプス接続を形成することが示されました。ヒトiPSC由来ニューロンとアストロサイトのみを共培養する既存の手法に対する本手法の主な利点は、これらヒトニューロンの成熟時間が短縮されることです。これは、一次ニューロンの存在によってこれらのヒトニューロンの成熟が促進されるためです。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるUni Chinと、George Augustine研究室のsuing Yが行います。記述されたプロトコルに従ってラット胚脳を採取し、皮質組織を単離した後、あらかじめ加温しておいた皮質組織消化液を含むディッシュに皮質組織を移します。皮質組織をできるだけ細かく刻み、37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、皮質組織を50 mL遠心チューブに移し、組織片のない均一な溶液になるまでセロロジカルピペットを用いて組織を解離させます。組織溶液を70 micronのセルストレーナーに通し、残っている組織塊を除去します。溶液3 mLを15 mL遠心チューブに分注します。各チューブの底に7.5%BSA含有1×PBSを800 µL加え、組織層の下に層を形成させ、200 ×gで5分間遠心分離します。その後、2つの層の界面から吸引して上清を除去します。この際、チューブ底部の細胞ペレットを乱さないように注意してください。1 mLの一次ニューロン培地を用いて各細胞ペレットを再懸濁させた後、それらすべてを15 mL遠心チューブにまとめます。次に、血球計数計を用いて細胞密度を測定します。6 million個のラット皮質ニューロンを200 ×gで5分間遠心分離し、上清を除去します。エレクトロポレーションには、少なくとも6 million個の皮質ニューロンが必要です。生存したニューロンによるニューロンネットワークの形成を確実にするため、細胞ペレットに100 µLのエレクトロポレーション溶液を加え、穏やかに再懸濁します。次に、細胞懸濁液100 µLと6 µgのCR twoプラスミドを混合し、認定されたキュベットに移します。メーカーの指示に従って、エレクトロポレーションに適したプログラムを選択し、適用します。エレクトロポレーション後、キュベットに500 µLのMEMを加えます。細胞を11.5 mLの一次ニューロン培地に移し、穏やかに再懸濁します。次に、マウスアストロサイトを含む24ウェルプレートの各ウェルに500 µLを加えます。プレートを37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。人工多能性幹細胞（iPSCs）を作製した後、テキストプロトコルに従って、細胞をヒト神経前駆細胞（NPC）培養として誘導し、維持します。この例では、アストロサイト培養液に一次ニューロンを加えた翌日に、レンチウイルスベクターsynapse in one TD tomatoを用いてNPCを標識します。1×PBSでヒトNPCを1回洗浄し、その後、細胞剥離溶液を加えて30 °Cで5分間インキュベートします。すべての細胞が剥離していることを確認してください。その後、2倍量のD-M-E-M-F 12を含む15 milliliterチューブに移し、200 Gで5分間遠心分離します。上清を除去し、神経分化培地を用いてペレットを穏やかに再懸濁し、単一細胞にします。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。次に、アストロサイト皮質ニューロン培養プレートから培地を慎重に吸引します。神経分化培地を用いて、ウェルあたり1cm²あたり5,000個のヒトNPCsを播種します。37°C、5%CO2条件下でインキュベートし、少なくとも28日間、2〜3日ごとに培地を交換してください。ヒトIPCが成熟ニューロンのように振る舞うかを確認するため、60倍の水浸レンズを装着した共焦点顕微鏡を用いて、ヒトIPCから分化した細胞を探索します。TD tomatoを可視化してください。記録用ピペットを引き、抵抗値が4～6 MΩになるように調整して灌流させます。室温にて、95%酸素および5%二酸化炭素で絶えずバブリングした外部溶液中に細胞を置きます。内部溶液を用いて記録用マイクロピペットを満たし、ホールセルモードでTDトマト陽性細胞にパッチクランプを行い、カレントクランプ下での電流注入に対する活動電位の発生を記録します。これにより、ChR2を発現している皮質細胞の活動電位が、光刺激によって確実に誘発されることを確認します。まず、水銀アークランプによる光照射下で、480/40 nmの励起フィルターを用いてGFPを可視化し、CRを発現している皮質細胞を特定します。その後、ホールセルモードでのカレントクランプ記録により、活動電位が確実に誘発されることを確認します。遺伝的刺激を行うには、水銀ランプの全視野照射および480/40 nmの励起フィルターを用いて、TD tomato陽性細胞をホールセルモードでパッチし、ボルテージクランプを-70 mVに設定します。視野全体を30秒間刺激します。ChR2を発現する前シナプス皮質ニューロンの光刺激によって誘導される、パッチクランプ細胞の後シナプス電流（PSC）を記録します。振幅および電流面積の閾値をそれぞれ5 pAおよび5 pA・sに設定し、これらのイベントを手動で確認して、PSCではないトレースを除外します。このビデオで実演しているように、iPC由来ニューロン、初代皮質ニューロン、およびアストロサイトの共培養系を構築するには、いくつかの手順が必要です。この画像は、マウスNPCをアストロサイトへ分化させてから2日目で、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）陽性のアストロサイトが容易に観察できることを示しています。マウスNPCを少なくとも1週間分化させた後、CR2を発現する皮質ニューロンをアストロサイト単層上に播種しました。この共培養系における両細胞は、GFAPおよびCHR2の免疫蛍光染色によって同定されます。ヒトNPC分化の3〜4週間後、ここに示すように、培養物中にTD tomato陽性ニューロンが検出されました。光刺激を与えると、CHR two IPSCを発現している皮質ニューロンにおいて活動電位が生成されました。誘導されたニューロンは興奮性も有しており、活動の増加を示しています。脱分極電流パルスの振幅を増大させると、活動電位が発生した。光がない状態で、iPSC由来ニューロンは自発的なシナプス入力を受けた。これらの内向きポストシナプス電流は、主にAMPA受容体を介して媒介されていた。皮質ニューロンへの光刺激を32回目の長い光フラッシュの間継続させたところ、PSCの頻度が上昇しました。ChR2を発現している皮質ニューロンを光刺激した際、その振幅に影響は見られませんでした。この手順に続き、異なる患者特異的な細胞種を用いた他の共培養システムを使用することで、関心のある特定の疾患に対する候補薬物の影響など、さらなる疑問を解明することが可能です。

an-optogenetic-approach-for-assessing-formation-neuronal-connections

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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