鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

この手順の全体的な目標は、費用対効果の高いシステムで高力価のインフルエンザウイルスを大量に生産することです。これは、最初に血清病原体を含まない、受精したばかりの鶏の卵を得ることによって達成されます。第2段階では、卵はアラントイックの根を介してインフルエンザウイルスに感染します。

その後、ウイルスを含むアラントイック液を48時間採取し、ウイルスを液体窒素で急速冷凍します。最終的に、プラークおよびヘマグルチニンアッセイを実施して、採取したアラントイックのウイルス力価の影響を決定することができる。この方法の流体 収穫手順は非常に敏感で、卵の慎重な取り扱いと卵の解剖学的構造に関する十分な知識が必要なため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。

手順を開始する前に、適切なベンダーから血清病原体を含まない、新たに受精したdavian卵を取得しました。到着したらすぐに、卵を自動エッグターナーを備えた加湿卵インキュベーターに入れて、摂氏37度、湿度55〜60%で卵を10〜11日間定期的に回転させます。7〜8日間のインキュベーション後、70%エタノール消毒手袋を着用してください。

エッグキャンドラーをエタノールで拭き、インキュベーターから空の卵パックに卵を移します。次に、ライトを消し、卵の大きい方の端を一度に1つずつキャンドラーに押し付けます。卵子が受精可能な場合、豆の形をした胚につながる細い血管がはっきりと見えるはずです。

卵子が受精していない場合、卵黄が見える小さな血斑が観察されます。次に、未受精卵を捨てて、生存可能な卵をインキュベーターに戻します。卵子の状態が確認できない場合は、受精後10日目または11日目および使用直前に、インフルエンザA型ウイルス株を1ミリリットルあたり10倍から3倍から10倍から4倍に希釈し、ヒッピーを添加した無菌PBSで氷の上に置きます。

次に、各卵に再びキャンドルを灯し、死んだ動かない胚を排除します。次に、インキュベーターから3つの卵を取り出し、それらを別のホルダーに配置します。エアサックを上げた状態で、卵の空域に油性マーカーで印を付けます。

次に、空域の上の領域を70%エタノールで洗い、卵の空域をA BSL 2バイオセーフティフード内の卵パックに移します。次に、滅菌済みの18ゲージの針を使用して、各卵のエアバッグの上に殻に小さな穴を開けます。胚や卵黄を刺さないように、針を深く挿入しすぎないように注意してください。

次に、希釈したインフルエンザウイルスを滅菌済みの1ミリリットルの注射器に引き込みます。22ゲージの針を取り付け、針を45度の角度で最初の卵のアラントイック腔に慎重に進めます。希釈したウイルスを0.2ミリリットル卵に注入し、他の2つの卵を注入した後、注射器を捨て、グルーガンから接着剤を滴下して各穴をニードルシールします。

、卵の内部に漏れないようにしてから、卵をインキュベーターに戻します。すべての卵を接種した後、感染した卵を摂氏37度、湿度60%で、最適なインキュベーション時間のために回転せずにインキュベートします。インフルエンザウイルスの種類によって異なります。

潜伏期間の終わりに、卵子を摂氏4度で最低4時間冷やして、胚を殺し、血管を収縮させます。卵が十分に冷えたとき。それらをバイオセーフティフードとしっかりしたホルダーに移し、70%エタノールで卵の表面をきれいにします。

次に、滅菌ハサミを使用して、最初の卵のエアバッグの上の卵殻を開きます。エアサックの周りのシェルを取り外します。絨毛膜アラントイック膜を傷つけないように注意してください。

次に、滅菌鈍い鉗子を使用して絨毛膜アラントイック膜を開き、卵黄を破裂させないように注意しながら、小さなへらまたはスプーンで胚と卵黄袋をそっと脇に移動します。次に、1ミリリットルのエイノールピペットを使用して、アラントイック液を慎重に収集し、卵を横に傾けて必要なだけ水分を採取します。各卵は、各卵が収穫されるときに、わずかに黄色がかった液体を5〜10ミリリットル産出する必要があります。

氷上の50ミリリットルのプラスチック製円錐管にアラントイック液をプールします。すべての液体が収集されたら、ウイルスをスピンダウンし、透明な液体を氷上の新しい50ミリリットルのチューブに移します。最後に、卵をA BSL 2つの廃棄物容器に捨て、すぐにEloquaを清澄化したLANトニック液に捨てます。

次に、スナップしてウイルスを液体窒素で凍結し、凍結した茎を摂氏マイナス80度の冷凍庫に入れます。長期保存の場合、インフルエンザウイルス感染は細胞変性効果を引き起こし、その結果、単層の細胞上に形成される混ざり合った細胞またはプラークの円形ゾーンが生じます。この実験では、細胞内をクリスタルバイオレットで染色してプラークを可視化し、ウイルスの希釈率が500マイクロリットルであるため、ウイルスの1倍からマイナス12希釈のウェルで65プラークをカウントし、細胞上で培養したウイルスストックを培養した。

この実験では、最終力価は10の10の1.3倍から14PFU/mLであった。ヘマグルチニンネーションアッセイは、インフルエンザウイルスが赤血球の表面に付着する能力に基づいて、インフルエンザウイルスの力価を測定する方法です。観察されたように、ウイルス懸濁液は赤血球を凝集させ、赤血球が懸濁液から落ち着くのを防ぎます。

50マイクロリットルでウイルスを2〜マイナス10倍に希釈すると、明らかに陰性の結果が観察されました。したがって、最終力価は1ミリリットルあたり10の4HAUの2.1倍となる。このビデオを見た後、鶏の卵に接種し、ウイルスを含む大西洋の液体を採取することにより、インフルエンザウイルスを増殖させる方法について十分に理解しているはずです。