パッチクランプ技術を用いたダーク適応、マウス網膜スライス標本におけるニューロンにおける記録光誘発シナプス後応答

この実験の全体的な目標は、暗く適応した網膜ニューロンから光応答記録を取得することです。これは、最初にマウスの目を採取することによって達成されます。2番目のステップは、網膜を分離し、スライス調製のためにそれをカットすることです。

次に、網膜調製物をマウントし、顕微鏡で観察して、パッチクランプ記録の標的細胞を見つけます。全細胞パッチクランプ構成を確立した後、細胞近傍に光刺激を加えます。最後に、同時の電気生理学的応答は、取得ソフトウェアを通じて観察できます。

KRCイメージングのような既存の方法のこの手法の主な利点は、記録感度が高く、記録細胞を形態学的に同定できることです。一般的に、この方法に慣れていない人にとっては、完全な暗闇での作業は困難で方向感覚を失う可能性があるため、この方法に不慣れな個人は苦労するでしょう。範囲を開始するには、解剖ツールとピペットを解剖顕微鏡の近くに移します。

作業エリアは、暗闇でも各ツールに簡単にアクセスできるように、よく整理されています。準備ができたら、Dawn 赤外線ビューアを使用して、暗闇で手順を実行します。安楽死後、すぐに目を核に形成し、顕微鏡下で作業する暗い箱に保管して、冷たい解剖液の皿に入れます。

冷たい解剖液で目を皿に移します。酸素で連続的に泡立てます。角膜と水晶体を取り外すには、眼球のもう一方の端にある視神経を動かさないように保持し、マイクロサージカルナイフで角膜の上部を切開します。

手術用ハサミを使用して切り口を伸ばし、角膜を取り除き、角膜の周りに強膜を残します。次に、細い鉗子でレンズをつかみ、ゆっくりと引き抜きます。アイカップができたら、小さなトランスファーピペットで冷たい酸素化解剖液をアイカップに静かに注ぎます。

網膜の形状を維持するためにすばやく作業し、穏やかな圧力を使用して網膜の背側と腹側を特定します。赤外線ビューアを使用して、網膜アイカップを横切り、視神経乳頭の近くを通過する線を特定します。この線は主に視神経の腹側を横切り、視神経を含む側は背側です。

実験に応じて、腹側または背側のいずれかに切り込みを入れます。これは不要な側面を示し、前進するための有用なマーカーです。次に、網膜に触れずに極細鉗子で硝子体を優しく取り除きます。

硝子体は主にアイカップの底と外縁に取り付けられています。硝子体がアイカップにしっかりと取り付けられている可能性があるため、網膜剥離を静かに取り除きます。張力が感じられなくなるまで引っ張り続けます。

網膜が分離されたら、強膜をつかみ、網膜をそっと剥がします。鉗子の裏側を使用して、網膜をトリミングし、不要な半分を同じプラスチック皿に捨てます。残りの網膜を各部分について2つに切ります。

端を切り取って網膜スラブを作り、折り畳み端を切り取ります。次に、大型のトランスファーピペットを使用して、網膜スラブをガラスプレートに移します。小さなピペットで余分な溶液を吸い上げ、濾紙を使用してスラブを平らにします。

小さなトランスファーピペットを使用して、フィルターメンブレンの一部を組織の上にそっと置きます。フィルターメンブレンに解剖液を一滴垂らします。溶液が広がり、網膜組織をフィルター膜に貼り付けるまで、約15秒待ちます。

くっついたら、メンブレンが浮くまで、フィルターの下と周囲にさらに冷たい解剖液を注ぎます。次に、フィルターメンブレンをスライスチャンバーに入れ、解剖液で覆います。膜が乾かないようにすばやく作業し、チョッパーを使用して網膜組織をスライスします。

グリースレール付きのプラスチック製カバースリップをスライスチャンバーに入れます。グリースレールの上に網膜スライスを移し、スライスを90度回転させて横断面が見えるようにします。フィルターペーパーの側面をグリースで覆う前に、フィルターメンブレンをカバースリップに押し下げます。

プラスチックカバースリップに固定された後、33ミリメートルのプラスチック皿に移します。調製物を石炭解剖液に浸し、各皿を連続的に酸素化された暗い箱に保管します。パッチクランプ録音用。

Mediumを狙ってProfusionチューブをプライミングし、すべての気泡がチューブから通過できるようにします。ガラス極性で記録ピペットを作成した後、チップをピペット溶液で埋め戻します。次に、マイクロピペットフィラーを使用して、充填したピペットの約3分の1を充填し、各ピペットを湿らせたピペットボックスに保管します。

次に、暗い場所で動作するコンピューターアンプCCDカメラや顕微鏡など、パッチプラントの記録用の機器の電源を入れます。レチナールスライス調製物を、赤外線ビューアを使用して顕微鏡ステージに置きます。固定化した後、連続灌流を開始します。

灌流温度を33〜37°Cに設定します。CCDカメラでスライス面を観察する。ターゲットの位置に焦点を合わせます。

ターゲット細胞タイプが存在する状態で、パッチCrat記録用に健康そうな細胞を選択します。健康な細胞が特定されたら、記録ピペットをピペットホルダーに入れ、ピペットをスライス調製に進めます。スライス調製物に近づいたら、顕微鏡でピペットの先端を見つけます。

ピペットチップが顕微鏡で見えるようになったら、チップをターゲットセルに向かって下に動かします。次に、アンプをセットし、ピカアンプでピペットを調整します。ナナアンペアあたり5ボルト。

約5ミリボルトと約10ヘルツの連続電気パルスを開始し、ピペット抵抗を確認します。理想的な抵抗は5〜12メガオームです。ほとんどの網膜ニューロンに。

準備ができたら、マウスピースまたはシリンジを使用して、ピペットの先端が標的細胞の表面に来るまで内部溶液を吹き飛ばします。正圧が細胞表面に小さなくぼみを作るときは、先端を少し進めて吹き出を止めます。ピペットの抵抗が継続的に増加している場合は、ピペットを放置し、1ギガオームを超えるまで抵抗を監視します。

抵抗が自然に増加しない場合は、ギガシールになるまで優しく負圧をかけます。ギガシールが達成されたら、保持電位をマイナス70ミリボルトに変更し、断続的に負圧を加えてピペットチップ内のメンブレンを破裂させます。セル全体の構成を行うと、ピペットの抵抗は500メガオームから1ギガオームの間になり、容量性電流は観察可能です。

負の 80 ミリボルトから 40 ミリボルトまでの IV 関係を記録します。セルの種類に応じて、さまざまなタイプの電圧依存性チャネルがアクティブ化されます。最後に、シナプス電流または電圧を誘発した光を記録します。

このスライス調製物を10 xで見ると、濾紙からの剥離がない光受容体と神経節細胞の両方を示しています。この調製物を60倍対物レンズで見ると、各細胞層がはっきりと観察されます。網膜ニューロンからの興奮性シナプス後電位を誘発する光は、ステップ光に応答して誘発されました。

ピーク振幅と減衰時間は、細胞の種類とサブタイプによって異なります。細胞型とその形態学的サブタイプは、その発生後、生理学的記録後の硫黄標識によって明らかにされました。この技術は、網膜研究の分野の科学者が、自然な視覚シグナル伝達の機能とシナプスメカニズムの寄与を研究する道を開きました。