Name: LC-MS / MSを用いて乾燥血液スポット上で免疫抑制タクロリムスの定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぶ LC-MS/MSを用いた乾燥血液スポット上でのタクロリムス定量法。最小侵襲的な採血で患者の負担を軽減し、小児の治療薬物モニタリングや薬物動態研究に有用な検体採取技術を習得できます。

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この作業は、米国連邦医薬品局(FDA)の契約HHSF223201310224Cおよび米国国立衛生研究所/FDA助成金1U01FD004573-01の支援を受けました。

健康な個体からの匿名化血液サンプルは、コロラド大学病院（オーロラ、コロラド州）からのものでした。検証研究のためだけでなく、キャリブレータおよび品質管理サンプルの調製のための非識別血液バンクサンプルの使用は、コロラド多施設内倫理委員会（COMIRB、オーロラ、コロラド州）によって「免除」と考えられました。 参照とソリューションの作製<ol><li>タクロリムスと内部標準のD 2を購入し、材料リストに記載されているベンダから13 C-タクロリムス。 <ol><li>タクロリムス1 mg / mlの濃度とD 2のために10μg/ mlの、13 C-タクロリムスの濃度で純粋なメタノール中のストック溶液を準備します。三つの独立した重みに基づいて、標準物質のストック溶液を作ります。小分けストック溶液とストア-70℃以下です。 </li></ol></li><li>タンパク質を沈殿させるために溶液を調製します（：、3 V：7 v）を、水にメタノール/ 0.2 MのZnSO 4を使用して、タクロリムスを抽出します。この溶液は、内部標準D 2、2.5 ngの/ mlの濃度の13 C-タクロリムスを含有し、ブランク試料の抽出を除くすべてのサンプル（1.3.3を参照）の抽出のために使用されます。 <ol><li>各抽出日に新鮮にこのタンパク質沈殿溶液を調製し、12時間で溶液の有効期限を設定します。 </li></ol></li><li>検量線および品質管理（QC）サンプルの作製<ol><li>純メタノールを使用したスト​​ック溶液の適切な希釈を行うことにより、タクロリムスのス​​トック溶液を調製します。 </li><li> 、キャリブレータおよび品質管理サンプルの調製EDTA全血の中に適切に希釈されたストック溶液20μlをスパイクするために、20分およびアリコートのための細胞の血液成分へのタクロリムスの均一な分布を可能にするために、水浴中で穏やかに振盪下、37℃でインキュベート1.5ミリリットルポリープへ円錐形の底部を有するr​​opyleneチューブとスナップオンふた。有機溶剤の相対量が5％を超えないことを確認してください。 </li><li>スポットピペットを使用してフィルタカード上の各円の中央にスパイクの全血50μlの。 </li><li> 3時間室温でのフィルタカードの血液スポットを乾燥させます。 </li><li> 1、2.5、5、10、25、および50 ngの/ mlのタクロリムスの濃度で人間のEDTA全血中タクロリムス校正標準を準備します。内部標準D 2、13 C-タクロリムス（「ゼロサンプル」）を含むタンパク質沈殿溶液と較正基準のような抽出のためのブランク試料を準備します。 </li><li> 0、2、4、20、40 ngの/ mlの濃度のヒトEDTA全血にQCサンプルを準備します。ブランク試料を準備します。内部標準D 2を含む沈殿を用いて抽出されたQCサンプルとは対照的に、13 C-タクロリムス、ないタンパク質沈殿溶液とこのブランクサンプルを抽出します内部標準D 2、13 C-タクロリムス（「ブランク試料」）を含みません。 </li></ol></li><li>臨床サンプルの採取<ol><li> 43,44で説明したように乾燥した血液スポットを収集します。 </li></ol></li></ol> 2.タクロリムスの抽出乾燥血液スポットサンプル<ol><li>視覚的に許容可能なサンプルの品質とボリューム45を確実にするために、乾燥血液スポットを検査します。 </li><li> 6 mmの穴パンチとフィルタカード上の血液スポットのパンチ中心。 注：パンチの品質を秤量することによってモニターすることができます。パンチ飽和フィルターディスクは、0.09ミリグラム（：4.83- 5.14 mgであり、N = 12の範囲）±平均5.02ミリグラムで重量を量ります。 </li><li>円錐形の底部及びスナップオン蓋付き1.5ミリリットルポリプロピレンチューブに置きディスク。 </li><li>各チューブに20〜30箇条書きを追加します。 </li><li>各チューブにタンパク質沈殿溶液（2.5 ngの/ mlの内部標準とV：0.2 MのZnSO 4、7：3、Vメタノール）の500μlのを追加します。 EXTRについてブランクサンプルの動作は、内部標準なしでタンパク質沈殿溶液を使用しています。 </li><li> （「10」を設定し、最高速度）1分間の弾丸ブレンダーでディスクを均質化します。 </li><li> 10分間（「10」を設定し、最高速度）マルチチューブボルテックスに室温でサンプルを振ります。 </li><li> 10分間16,000×gで4℃で遠心分離サンプル。 </li><li> 300μlのインサートを備えたガラス製HPLCバイアルに上清を移します。前スリットテフロンシールを使用してください。 注：抽出したサンプルは、-20℃以下でLC-MS / MS分析まで保存することができます。 </li></ol> 3. LC-MS / MS分析<ol><li> C8カートリッジ抽出カラム上に負荷抽出されたサンプルの上清100μlを、図7を用いて洗浄する：水中の0.1％ギ酸の比率3：1分間5 ml /分の流量でアセトニトリル。切替弁の接続は、 図2に示されており、勾配は、 表1の抽出ポンプによって実行されます</st&gt;栄。 </li><li>以下、分析カラム上に、プレカラムからの検体のバックフラッシュの結果、切替弁を作動させます。 </li><li> 65°Cまでのカラムサーモスタットを設定します。 </li><li> 表1に示す流量と勾配を用いて分析カラムから分析物を溶出します。 </li><li>ターボエレクトロスプレーイオン化源を介してタンデム質量分析計に分析カラムを接続します。 表2に記載の質量分析装置の主要なパラメータを調整します。 </li><li>複数の反応モード（MRM）中の正イオン（[M +のNa] +）を検出します 。定量化のために、次のイオンの移行を使用して：タ ​​クロリムス：m / z（質量/電荷）= 616.2→826.6とD 2、13 C-タクロリムスた：m / z = 829.6→619.2。 注：総実行時間は4.6分です。 </li></ol> 4.定量<ol><li>各実験について、1.3.5で製造したキャリブレーターに基づいて検量線を作成し、各分析の実行に含めます。 <ol><li>質量分析計ソフトウェアを使用して、分析物（ピーク面積[検体] /ピーク面積[内部標準]）の応答係数対名目濃度をプロットすることにより検量線を作成します。 </li><li> 1 / Xの重み付けと組み合わせて二次フィットを用いてキャリブレータを取り付けます。 </li></ol></li><li>乾燥血液スポットにおける量タクロリムスタクロリムス抽出のMRMクロマトグラムにおける内部標準のピークを統合することができます。タクロリムスの応答係数（ピーク面積[検体] /ピーク面積[内部標準]）を計算し、質量分析ソフトウェアを使用して検量線と比較します。 </li></ol> 5.検証手続<ol><li>検出（LLOD）及び定量化（LLOQ）の下限値の下限。 <ol><li>検出（LLOD）の下限として1：4のピーク対雑音比で最低のタクロリムス濃度を考えてみましょう。定量化（LLOQ）の下限を定義します。等しいか、または名目濃度に等しいか、またはより良好な20％の精度（変動係数）から±20％の偏差よりも良好な精度で較正曲線の最低濃度です。 </li></ol></li><li>内および間日間の精度と精度。 <ol><li> 2 ng / mlで（QC1）、4 ng / mlで（QC2）、20 ng / mlで（QC3）および40 ng / mlで（QC4）の4濃度レベルで正確さと精度をテストします。 </li><li>フィルタカード、エキスの乾燥、人間のEDTA全血に各バリデーション日にQCサンプルを用意し、上記のように分析します。 </li><li> QC濃度レベルごとに6つのサンプルでイントラデイの正確さと精度を決定します。 </li><li> 20日間の間日間の正確さと精度を評価します。 4サンプルを毎日各QCレベルを測定します。 </li><li>毎日のQCサンプルと一緒に2つの較正曲線を分析します。 </li><li>名目上の濃度の％（濃度レベルごとに6つのサンプルは、5.2.2を参照してください）​​などのイントラデイ精度を計算します。 Calcの分散係数（CV％）としてulate精度。 </li><li>それは名目濃度の115％に許容限界に85％を下回る場合には許容可能なイントラデイ精度を考えてみましょう。それは15％のCV（変動係数）と同等かそれ以上の場合、許容できるならばイントラデイの精度を考慮してください。 </li><li> 20検証日間にわたって分析各QC濃度レベルの平均としてインター日間の正確さと精度を計算します。 </li><li>それは名目濃度の115％に許容限界に85％低下した場合に許容できるインター日間の精度を意味することを検討してください。それは15％のCV（変動係数）と同等かそれ以上の場合、許容できる場合インター日間の精度を考慮してください。 </li></ol></li><li>マトリックス干渉の排除。 <ol><li>マトリクス信号によって引き起こされることがある干渉を排除するために、空白の乾燥血液スポット（8異なる個体、好ましくは4人の男性と4人の女性）を分析。 </li><li>視覚イオンクロマトグラムを検査します。もし保持時間内にピークタクロリムスのウィンドウがLLOQでタクロリムスでスパイク統合し、ブランク試料におけるタクロリムスピークのものと曲線下その面積を比較し、検出されました。ブランク試料中のピークの面積は、LLOQでタクロリムスのものの15％を超えることが想定されていません。 </li></ol></li><li>イオン抑制/イオン強化。 <ol><li>共溶出マトリクス成 ​​分によるイオン抑制/イオン強化の潜在的な干渉を評価するために45を説明するようにポストカラム注入プロトコルを使用してください。 </li><li> 10μL/分の速度でメタノール（30：70、v / v）のポストカラム：0.1％ギ酸に溶解した10μg/ mlの濃度のタクロリムスを注入。 <ol><li>分析カラムと質量分析計のエレクトロスプレー源との間にTピースを経由してシリンジポンプを接続します。 </li><li>タクロリムスのためのMRMトランジションのMS / MSシグナル強度を監視し、その内部標準（のm / z = 616.2とのm / z = 829.6→619.2→826.6）extracの注射後テッドのブランクサンプル（N =異なる個体から8サンプル）。 注意：イオン抑制が信号とイオン増強ピークのディップが発生している間イオン抑制/イオン強化がない場合には検体の注入によって引き起こされる連続信号は、ブランクマトリックスの注入によって影響されるべきではありません。 </li></ol></li></ol></li><li>持ち越す。 <ol><li>最高キャリブレーター後に抽出ブランク試料を分析することにより、潜在的なキャリーオーバーを評価する（50 ngの/ mlの、N = 6）。 </li><li>視覚イオンクロマトグラムを検査します。タクロリムスの保持時間ウィンドウ内のピークが検出された場合、LLOQでタクロリムスをスパイクブランクサンプル中のタクロリムスのピークのものと曲線の下のそれらの領域を統合し、比較します。ブランク試料中のピークの面積は、LLOQでタクロリムスのものの15％を超えることが想定されていません。 </li></ol></li><li>抽出回収。 <ol><li> QC SAMの抽出後の検体の信号を比較することにより、回収を決定しますブランクの乾燥血液スポットのものとすべての4つの濃度レベルでples（N =濃度につき6）は、抽出後のタクロリムスの対応する量でスパイク。 </li><li> 4のQCのセット（：2、4、20、40 ngの/ mlの濃度レベル）を準備します。 </li><li>ろ紙のカードに空白のEDTA全血50μlのをスポッティングし、2時間乾燥させることにより、「回復試験サンプル」に対応する他の4セットを準備します。 </li><li>以下、QCとブランク」回収試験サンプル」の両方のために、はさみでフィルタカードの全体の血液スポットを切り出し、円錐状の底部とのスナップ式の蓋付きポリプロピレンチューブに生じたディスクを配置します。 </li><li>すべてのサンプルを抽出します。 </li><li>ガラスHPLCバイアルに上清（400μl）を転送します。 </li><li> 2、4、20、および40 ng / mlで（200、400、2000、4000 ngの/ mlのタクロリムスストックゾルの4μLの濃度に到達するまでの空白」が抽出回収試験サンプル」にタクロリムス原液を追加上清400μlにutions）。 </li><li> LC-MS / MS分析の後、QC試料及び対応する濃度の「回収試験試料」の両方の信号を比較する（抽出/信号サンプルを抽出X 100の後にスパイクする前に、回復％=信号サンプルをスパイク）。 </li></ol></li><li>希釈の整合性。 <ol><li>サンプルを使用して希釈の整合性を確立ng / mlで500、250および100での検体でスパイク。 </li><li>抽出後、タンパク質沈殿溶液を用いて、サンプル希釈（1:10、n = 3の濃度レベルにつき）。 </li><li>名目濃度からの偏差を計算します。 85％の範囲内の公称許容できるの-115％減の結果を考慮してください。 </li></ol></li><li>安定性。 <ol><li>すべての4つの濃度レベルでQCサンプルを使用して安定性を調査した（n =濃度あたり4）異なる時点で、異なる貯蔵条件下で分析しました。 </li><li>公称値で保存した後の結果を比較してください。 Rを考えてみましょう85％の範囲内の公称許容できるの-115％減esults。 </li><li> 4℃、-20℃で1ヶ月間、-80℃で1ヶ月に1週間、室温で1週間のサンプルの安定性を確立します。 </li><li> 3サイクルにわたってテスト凍結融解安定性（-20℃）。試験は、4℃に調節サーモスタットオートサンプラーにサンプルを配置することによって、サンプル及びオートサンプラー安定性を抽出しました。 72時間後にサンプルを注入します。 </li></ol></li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

上述のように、乾燥血液スポットに基づいて、タクロリムスの治療薬及び遵守監視の概念は魅力的であるが、一般的に静脈EDTA全血サンプル中のタクロリムスのLC-MS / MS分析に関連するものを超えた分析課題があります。これらには、マトリックスは、ここで使用されるフ​​ィルタカード材料と低血液量（20μL）のコットンリンターの材料に浸漬毛細血管全血であるという事実が、これらに限定されません。それにもかかわらず、中央検査室でのハイスループット分析は、特定の堅牢かつ高感度LC-MS / MS分析と組み合わせたマトリックス干渉及びマトリックス効果を欠いているサンプルをもたらす高速かつ信頼性の高い抽出方法を必要とします。すでにパンチフィルタカードが抽出/ LC-MS / MS分析に障害が発生した場合に再分析のために左側に十分な材料は通常存在しないとして、アッセイの信頼性は非常に重要です。 Fiの本研究で使用しLTERカードは、これらがFDA承認されたクラスIIデバイスであるため、NCCLSガイダンスLA4-A5 44に準拠していると、CEマークの付いたヨーロッパにある選択...

タクロリムスは、マクロライド構造8（ 図1）を持つ強力なimmonosuppressant 1-7です。 653グラム/ L、エタノール： - シスのためにCN結合のトランス異性それを逆相高速液体クロマトグラフィーによって分離することができる液9中の2つの回転異性体を形成する（HPLC）は、タクロリムスは、アルコール（メタノール中の親油性と可溶性である355 G / L）、ハロゲン化炭化水素（クロロホルム：573グラム/ L）およびエーテル。 9分子は、任意の発色団を含んでいないし、その紫外線吸収極大が192 nmである0.0047グラム/ L）タクロリムスの行為カルシニューリンの阻害を介して：0.1グラム/ Lおよび水（pHは3：それは（ヘキサン脂肪族炭化水素に難溶性です。 。その作用機序は、参考文献10,11に概説されている。これは、現在、米国において12固形臓器移植患者の80％以上に使用されています。 タクロリムスの治療指数はconsidereですdは13狭くします。また、タクロリムスの投与量と血中濃度との相関が悪く、薬物動態変数14,15あります。移植患者におけるタクロリムスの投与をガイドするための治療薬モニタリングは、したがって、一般的な臨床実践16-20です。目標は、事前定義された治療範囲内タクロリムスの血中濃度を維持することです。治療の窓を超える濃度が過剰免疫抑制、癌や、腎毒性、神経毒性、高血圧、および糖尿病などの毒性のリスクを増加させながら、治療範囲以下のタクロリムスの血中濃度は、慢性または急性同種免疫反応の活性の増加をもたらす可能性があります。タクロリムスの高い薬物動態個体内変動は、移植臓器と患者の生存21,22の両方に有害である可能性があります。タクロリムスの薬物動態の個体間変動は、主にCYP3A5の遺伝子多型、個体内の理由によって引き起こされている間可変性は、薬物-薬物、疾患、薬物および食品薬物相互作用は、14,15、含まれるが、これらに限定されません。また、免疫抑制治療薬レジメンの遵守の欠如が要因と移植片喪失の23,24の主な理由です。 これらの考慮事項は、頻繁に家の治療薬やタクロリムス全血濃度の遵守の監視は、患者が常に所望の治療ウィンドウ内タクロリムスエクスポージャーを持っていることを確認することが有益であり得ることを示唆しています。しかし、それは現在の臨床実践15であるように、より頻繁な治療薬モニタリングの物流コストは法外です。理由の一つは、患者が瀉血専門医が描画に必要な静脈血のサンプルを持って見る必要があることです。乾燥血液スポットは最近、魅力的なコンセプト25-28として浮上しています。簡単な指の後、患者は特別なろ紙カードに血液滴を収集し、血液スポットの後にdを有するスティックリート、患者が現在服用してもよいことタクロリムス及び他の免疫抑制剤の分析のための中央検査室に郵送することができます。これは、そのような乾燥血液スポット（血液の一般的に20μl）を25,29-43のような非常に少量の血液量のタクロリムスおよび他の免疫抑制剤の定 ​​量化のための高感度かつ特異的LC-MS / MSアッセイの開発が可能となっています。別の利点は、乾燥血液スポットとして低侵襲性、低容量のサンプル収集戦略が大きく小さな子供28中の治療薬のモニタリングおよび薬物動態学的研究を促進することです。 タクロリムスは、通常、静脈のEDTA全血15で測定されます。理由は、タクロリムスは、広範囲の血液細胞に分配することと臨床研究は、臨床イベント15,18のプラズマに比べて血液中のタクロリムストラフ濃度との間のより良好な相関関係を報告しているということです。比較では、TAの分析乾燥血液スポットにおけるcrolimusを濾紙マトリックスと混合される毛細管血に基づいています。これは、タクロリムスおよびLC-MS / MS分析での潜在的な干渉の可溶化の点で課題を提示。ここでは、高流量のオンラインコラムサンプルクリーンアップの手順とLC-MS / MS分析と組み合わせて、箇条書きのブレンダーを用いて乾燥血液スポットの均質化に基づいて設立され、確認されたアッセイを提示します。今日のように、このアッセイは成功し、臨床試験における遵守を監視するための以上5000タクロリムス乾燥血液スポットサンプルの定量に使用されています。

<table><tbody><tr><td>タクロリムス</td><td>米国薬局方条約</td><td>1642802</td><td></td></tr><tr><td>D2,13C-Tacrolimus</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td></td><td></td>F370002</tr><tr><td>赤血球</td><td>コロラド大学病院</td><td>W20091305500 V</td><td></td></tr><tr><td>血漿</td><td>コロラド大学病院</td><td>W2017130556300Q</td><td></td></tr><tr><td>アセトン CHROMASOLV, HPLC, &ge;99.9%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>439126-4 L</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリルオプティマ LC/MS、UHPLC-UV</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール 99.9%、HPLC</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2632-4</td><td></td></tr><tr><td>メタノールオプティマ LC/MS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターオプティマ LC/MS、UHPLC-UV</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>硫酸亜鉛</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Z68-500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 &ndash; 10 & マイクロ;l ピペット、VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>メトラー・トレド</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml エッペンドルフチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10 &ndash; 100 & micro;l ピペット, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>メトラー・トレド</td><td>17008651</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;l ピペットチップ(フィルター付き)、滅菌済み</td><td>Neptune</td><td>BT 10XLS3</td><td></td></tr><tr><td>100 &ndash; 1,000 & micro;l ピペット、VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>メトラー・トレド</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;l ピペットチップ フィルター付き、滅菌済み</td><td>Neptune</td><td>BT 100</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu;l ピペットチップ(フィルター付き)、滅菌済み</td><td>Multimax</td><td>2940</td><td></td></tr><tr><td>2 &ndash; 20 & micro;l ピペット、VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>メトラー・トレド</td><td>17008650</td><td></td></tr><tr><td>2 ml エッペンドルフチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-681-258</td><td></td></tr><tr><td>20 &ndash; 200 &micro;lピペット、VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>メトラートレド</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;l ピペットチップ フィルター付き、滅菌済み</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-20</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l フィルター付きピペットチップ</td><td>マルチマックス</td><td>2938T</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l ピペットチップ フィルター付き、滅菌済み</td><td>Multimax</td><td>2936J</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu;l HPLCバイアル用インサート</td><td>Phenomenex</td><td>ARO-9973-13</td><td></td></tr><tr><td>バランス PR2002</td><td>メトラー・トレド</td><td>1117050723</td><td></td></tr><tr><td>バランス AX205 デルタレンジ</td><td>メトラー・トレド</td><td>1119343379</td><td></td></tr><tr><td>ブレットブレンダー ホモジナイザー</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 バイオフュージ フレスコ</td><td>ヘレウス</td><td>290395</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てワイプ</td><td>PDI</td><td>Q55172</td><td></td></tr><tr><td>ガラス製ウイルス、4 ml</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-955-334</td><td></td></tr><tr><td>ガラス製バイアル、20 ml</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>B7800-20</td><td></td></tr><tr><td>グローブ、ニトリル</td><td>タイタンブランドグローブ</td><td>44-100S</td><td></td></tr><tr><td>HPLCバイアル、9 mm、2 ml、透明</td><td>フェノメネックス</td><td>ARO-9921-13</td><td></td></tr><tr><td>HPLCバイアル用蓋フェ</td><td>ノメネックス</td><td>ARO-8952-13-B</td><td></td></tr><tr><td>針、18 G 1.5</td><td>精密グライド</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>ラック エッペンドルフチューブ用</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>03-448-11</td><td></td></tr><tr><td>HPLCバイアル用ラック</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-541-29</td><td></td></tr><tr><td>スチールビーズ 0.9 &ndash; 2 mm</td><td>ネクストアドバンス</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>冷凍庫/冷蔵庫用収納ボックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>標準マルチチューブボルテクサー</td><td>VWR サイエンティフィックプロダクツ</td><td>658816-115</td><td></td></tr><tr><td>ワットマン紙、903 プロテインセーバー US 100/PK</td><td>GE ワットマン&nbsp;</td><td>2016-05</td><td></td></tr><tr><td>オートサンプラー</td><td>CTC PAL&nbsp;</td><td>パル。HTCABIx1</td><td></td></tr><tr><td>バイナリポンプ、Agilent 1260 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G1312B</td><td></td></tr><tr><td>バイナリポンプ、Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G4220A</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ真空脱気装置、Agilent 1260</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G13798</td><td></td></tr><tr><td>カラムオーブン、&nbsp;Agilent 1290 2ポジション&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1216C</td><td></td></tr><tr><td>6ポートスイッチングバルブを内蔵したサーモステーテッドカラムコンパートメント</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1316C</td><td></td></tr><tr><td>HPLCプレカラムカートリッジ、Zorbax XDB C8(5 &micro;m粒子サイズ)、4.6&middot;12.5 mm</td><td>Phenomenex</td><td>820950-926</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 分析カラム、Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &micro;m粒子サイズ)、4.6&middot;150 mm</td><td>Phenomenex</td><td>993967-906</td><td></td></tr><tr><td>タンデム質量分析計</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>API5000 MS/MS と TurboIonspray ソース</td><td>AB Sciex</td><td>4364257</td><td></td></tr><tr><td>質量分析ソフトウェア</td><td>AB Sciex</td><td>Analyst 1.5.1</td><td></td></tr></tbody></table>

lc-ms / msを用いて乾燥血液スポット上で免疫抑制タクロリムスの定量化

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

カルシニューリン阻害剤タクロリムスは、米国の固形臓器移植後の免疫抑制ほとんどの治療プロトコルの基礎となるものです。タクロリムスは、狭い治療指数薬であり、そのようなものとして、その全血トラフ濃度に基づく治療薬モニタリングおよび用量調節を必要とします。家庭治療薬と遵守の監視を容易にするために、乾燥した血液スポットのコレクションは魅力的な概念です。フィンガースティックの後、患者は自宅でろ紙上の血液滴を収集します。血液が乾燥した後、それは、タクロリムスは、単純な手動のタンパク質沈殿工程およびオンラインカラム抽出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析（HPLC-MS / MS）を用いて定量された分析研究室に郵送されます。 タクロリムスの分析のために、6 mmのディスクは、血液スポットの飽和中央から打ち抜かれます。血液スポットは、弾丸ブレンダーaを使用して均質化され、ND次いでタンパク質は、内部標準D 2、13 C-タクロリムスを含むメタノール/ 0.2 MのZnSO 4で沈殿させます。ボルテックス及び遠心分離後、上清100μlをオンライン抽出カラムに注入し、5 mlの0.1ギ酸/アセトニトリル/分（7：3、V：V）で洗浄し、1分間。以降、切替弁が活性化され、分析物は、分析カラム上にバックフラッシュ（0.1％ギ酸/アセトニトリル勾配を用いて分離されます）。タクロリムスは、タンデム質量分析計を用いて、正の反応マルチモード（MRM）で定量化されます。 アッセイは、1〜50 ng / mlでの直線です。アッセイ間の変動（3.6％-6.1％）と精度（91.7パーセント-101.6％）20日間にわたって評価として受け入れ基準を満たしています。平均抽出回収は95.5％です。キャリーオーバー、マトリックス干渉とマトリックス効果該当はありません。タクロリムスは、室温で1週間4℃で乾燥した血液スポット中で安定です。で抽出したサンプルオートサンプラーは、少なくとも72時間4℃で安定しています。

サンプルは定量下限と患者試料にスパイクブランク試料の代表的なイオンクロマトグラムは、 図3に示されています。 検量線検出の下限値は、0.5 mlのNG /であり、定量化の下限はng / mlで1.0でした。より高い濃度は、通常の状況下では、診療所に到達されそうにないとして50ngの/ mlの最高キャリブレーターとして選ばれました。 検量線たて、人間のEDTA全血に各バリデーション日に調製フィルタカードで乾燥させ、メタノールで抽出した/ 0.2 MのZnSO 4（70:30 V / V）+内部 ​​標準の内部標準（最終濃度：2.5 ngの/ mlの）。 1日目の検証（Nキャリブレーターのための6とn = QCレベル6 =）と2日目のためにのために - （各QCレベルのためのn =キャリブレータのための2及びn = 4）20、濃度1、2.5、5を用いて分析しましたCALIBのための10、25、50 ng / mlでrat...

ここでは、簡単な手動タンパク質沈殿ステップとオンラインカラム抽出を使用して、乾燥血液スポット中の免疫抑制剤タクロリムスを定量するための高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(HPLC-MS/MS)アッセイについて説明します。

LC-MS / MSを用いて乾燥血液スポット上で免疫抑制タクロリムスの定量化

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

次の実験の全体的な目標は、乾燥した血液スポットのタクロリムスを定量化することです。この手法の主な利点は、IV採血後の血液サンプル中のタクロリムスの定量化よりも優れていること、患者が自分でサンプルを採取できること、乾燥血液スポットなどの低侵襲の少量サンプル収集戦略、小さな子供の治療薬のモニタリングと薬物動態研究を容易にすることです。簡単な指の棒の後、患者は特別な濾紙カードに血液滴を集め、血液スポットが乾燥した後、タクロリムスや患者が服用している可能性のある他の免疫抑制剤の分析のために中央研究所に郵送することができます。乾燥血液スポットなどの非常に少量の血液中のタクロリムスやその他の免疫抑制剤を定量するための高感度で特異的なLCM SM Sアッセイの開発により、乾燥血液スポットでの薬物の定量が可能になりました。まず、タクロリムスについては1ミリグラム/ミリリットルの濃度で、1ミリリットルあたり10マイクログラムの濃度で純粋なメタノールにストック溶液を調製します。D 2つの13 Cアリコート原液について、各抽出日に摂氏マイナス70度以下で保存し、メタノールと0.2モル硫酸亜鉛を7対3の割合で水に調製してタンパク質を沈殿させ、タクロリムスを抽出します。内部標準原液を沈殿液にスパイクします。ソリューションの有効期限を 12 時間に設定します。その後、純メタノールを用いて原液を適量希釈し、タクロリムスの原液を調製し、キャリブレーターおよび品質管理サンプルを調製します。適切に希釈した原液20マイクロリットルをEDTにスパイクします。全血を摂氏37度でインキュベートし、水浴中で20分間穏やかに振とうし、細胞の血液成分にタクロリムスを均一に分布させます。大量のキャリブレーターと品質管理サンプルを調製するには、適切に希釈したストック溶液の2000マイクロリットルをEDTにスパイクします。全血を摂氏37度でインキュベートし、水浴中で20分間穏やかに振とうし、細胞の血液成分にタクロリムスを均一に分布させます。次に、サンプルを円錐形の底とスナップオン蓋を備えた1.5ミリリットルのポリプロピレンチューブに分注します。スパイクした全血の50マイクロリットルをピペットを使用してフィルターカード上の各円の中央にスポットし、血液スポットを室温で3時間乾燥させた後、ヒトEDTA全血のタクロリムス較正標準を1ミリリットルあたり1つの2.5、5、10、25、および50ナノグラムのタクロリムス濃度で調製します。抽出用のブランクサンプルは、キャリブレーション標準試料と同様に、内部標準物質D two 13 Cタクロリムスを含まないタンパク質沈殿溶液で調製します。次に、ヒトEDTA全血中に0、2、4、20、および40ナノグラム/ミリリットルの濃度で品質管理サンプルを調製します。ブランクサンプルも調製する 乾燥した血液スポットを採取した後、各血液スポットを目視検査して、サンプルの品質と量が許容できることを確認します。次に、フィルターカードの血液スポットの中心を6mmの穴パンチで打ち抜きます。ディスクを円錐形の底部を持つ1.5ミリリットルのポリプロピレンチューブに入れ、蓋をはめ込みます。各チューブに20〜30発の弾丸を追加します。これに続いて、500マイクロリットルのタンパク質沈殿溶液を各チューブに加えます。バレットブレンダーでディスクを最高速度で1分間均質化します。終了したら、サンプルを室温でマルチチューブボルテックスで最高速度で10分間振とうします。次に、サンプルを16, 000 GSおよび摂氏4度で10分間遠心分離します。遠心分離後、SNATを300マイクロリットルのインサートを備えたガラス製HPLCバイアルに移します。この時点で、抽出したサンプルのスーパーナート 100 マイクロリットルを C eight カートリッジ抽出カラム洗浄にロードし、0.1% ギ酸水と酸性ニトリルを 7 対 3 の比率で、毎分 5 ミリリットルの流れでロードします。その後1分間、スイッチングバルブを作動させ、分析物をプレキャリブレーションから分析カラムに戻します。次に、カラムのサーモスタットを摂氏65度に設定します。ここに示す流速とグラジエントを使用して、分析カラムから分析種を溶出します。分析カラムをターボエレクトロスプレーイオン源を介してタンデム質量分析計に接続します。次の表に従って、質量分析計の主要なパラメータを調整します。次に、多重反応モードで陽イオンを検出します。乾燥した血液スポット中のタクロリムスを定量するには、ブランクサンプルの質量分析ソフトウェア代表イオンクロマトグラムを使用して、タクロリムスを検量線と比較します。ここでは、定量下限でスパイクしたサンプルと患者サンプルを示します。ここには、一般的な検量線を示します。相関の平均係数は0.9994です。ここでは、精度と精度の結果について詳しく説明します。有意なイオン抑制またはイオン増強の兆候は観察されず、ピークを超える可能性のあるキャリーオーバーは認められませんでした。定量下限でのシグナルの 15% が検出されました。希釈の完全性は、最高キャリブレーターを超える濃度で調製し、抽出後にタンパク質沈殿溶液で希釈して目標濃度に到達したサンプルを分析することにより調査しました。試験したすべての希釈液は、合格基準を満たしていました。室温で1週間保存した後、摂氏4度で1週間保存した後、および摂氏マイナス20度で1か月保存した後、損失は明らかではありませんでした。さらに、3回の凍結融解サイクルの後、摂氏マイナス80度で1か月間保存した後、および摂氏4度でオートサンプラーでサンプルを72時間抽出した後、損失は観察されませんでした。マスターすると、1時間以内に20個のサンプルを抽出できます。この手順を試行する際には、信頼性の高い定量化の鍵は、乾燥した血液スポットの品質であり、椎間板は濾紙の完全に飽和した領域から打ち抜かれることを覚えておくことが重要です。このビデオで紹介されている技術とアッセイは、乾燥血液スポット中の他の免疫抑制剤や薬物を定量するためのプラットフォーム技術を提供します。

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LC-MS / MSを用いて乾燥血液スポット上で免疫抑制タクロリムスの定量化

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