聴覚路の光遺伝学的刺激のためのマウス背側蝸牛神経核の直接可視化

この手順の全体的な目標は、マウスモデルの蝸牛核に外科的にアクセスし、光遺伝学に基づく実験を可能にすることです。これは、まずマウスを開頭術の準備をし、頭皮を覆う皮膚の軟部組織と筋肉を横方向に引っ込めることによって達成されます。第2のステップとして、ラムダ縫合線まで約2ミリメートルの左頭頂間骨に開頭術が行われます。

この領域は蝸牛核を覆っています。次に、5つのフレンチサクションチューブを使用して、DCNを覆う左小脳の外側最上部を吸引します。結果には、DCN の遮るもののないビューが表示されます。

定位誘導などの補助方法に対するこの技術の主な利点は、蝸牛核の直接可視化を達成し、光源や電極アレイなどの神経シミュレータを脳幹表面に配置することです。この方法は、光遺伝学と聴覚の両方の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。遺伝子導入により、聴覚脳幹を光によって刺激し、顔面および時間的な分解能を十分に得ることができるような人工装具はありません。

腹腔内投与によりマウスにケタミンとキシラジンを投与した後、つま先つまみ離脱反射を確認し、心拍数と呼吸数をモニターして適切な麻酔を確認します。次に、乾燥を防ぐために両目に獣医軟膏を塗ります。次に、頭皮を覆う髪を剃り、手術部位へのアクセスを妨げないようにします。

その後、マウスを小動物の定位固定装置ホルダーに入れます。鼻のクランプを調整して、十分な呼吸を可能にするのに十分な緩さがあり、マウスの頭を完全に固定するのに十分なきつく締めます。顕微鏡下で、耳介の間の正中線から直接開始し、後頭部の抱きしめ部分まで伸びる、皮膚を垂直に切開します。

次に、皮膚を横方向にずらします。頭蓋骨の左頭頂骨、頭頂間骨、後頭骨を覆っている筋肉をメスまたは虹彩はさみで取り除きます。その間、綿の先端のアプリケーターで10〜15秒間穏やかな圧力をかけることにより、出血を最小限に抑えます。

次に、矢状縫合線とラムダ縫合線を特定します。ロンジュエルのペアを使用しています。ラムダ縫合線から約2ミリメートル寄りかかった左頭頂間骨に開頭術を行います。

この領域は、開頭術後のDCNを覆っています。小脳を覆う硬膜の薄い層を観察し、メスの刃を使用して慎重にそれを取り除きます。凝固した血液を綿の先端で取り除くか、生理食塩水を小脳にそっと滴下して血液を洗い流します。

次に、5つのフレンチサクションチューブを使用して、左小脳の外側の最も外側の部分を吸引し、DCNを覆って補助します。吸引では、顕微鏡の焦点面を蝸牛核の予想される深さに設定して、視覚化を改善し、鮮明な画像を確保します。左小脳の約4分の1から3分の1を取り除きます。

DCNに隣接する主なランドマークは、上半規管のAMです。誤嚥後、さらなる出血、脳脊髄液の蓄積、およびDCN上の小脳の変位が現れ、開頭術に生理食塩水を迅速に注入して血液凝固を防ぎます。デンタルポイントによる穏やかなダミングと吸引の組み合わせを使用して、DCNを直接視覚化するための経路をクリアします。

DCNがはっきりと見え、上に横たわる血液とCSFがなくなったら、5マイクロリットルのガスタイトハミルトンシリンジを使用して、DCNにベクトルを圧力マイクロ注入します。浅い斜角を備えた34ゲージの針を使用して、鈍的外傷を最小限に抑え、DCN内の注入量を局所化します。次に、マイクロマニピュレーターを使用して、先端がDCNの表面の下に見えなくなるまで、針をゆっくりと導入します。

ベクターの1.5マイクロリットルの注入を開始します。これが完了したら、針をゆっくりと引き抜き、続いて皮膚を近似し、マウスが標準的な回復手順に従って回復するのを待ちます。2〜4週間の治癒とウイルス媒介遺伝子導入インキュベーションの後、ベクター注入マウスを再麻酔し、開頭術部位の瘢痕組織を切除します。

その後、DCNの上に残っている小脳と瘢痕組織の組み合わせを特定します。5フレンチサクションを使用して、上にある小脳と瘢痕組織を吸引します。志を追いかける。

開頭術に生理食塩水をすばやく塗布します。血液の滲出を防ぐために、穏やかな歯のポイントダブと吸引の組み合わせを使用して、DCNを直接視覚化するための経路をクリアします。DCNは今、光遺伝学ベースの生理学実験のためにアクセス可能になり、ここに示されているのは、DCNの表面に直接レーザーファイバーを配置し、感染したDCNの表面でオプシンに感染したDCNA青色光パルスシリーズの光刺激を可能にし、光学的に駆動される聴覚脳幹応答をもたらします。

マイクロマニピュレータを使用して、青色光レーザーに結合された光ファイバーを蝸牛核の表面に直接配置し、電源を入れます。ここでは、蝸牛核の表面にパルス状の青色光を同定することができます。この手順に続いて、原子核の電気的シミュレーションなどの他の方法も実行できるため、音響的に誘発されるだけでなく、電気的に誘発される神経応答と光学シミュレーションによって誘発される神経応答を直接比較することができます。

このビデオを見た後、開頭術と小脳吸引術を準備して実施する方法を十分に理解し、最終的な目標は直接視覚化して蝸牛核にアクセスすることです。