Name: 海洋生物の組織からの二次代謝産物のAntipredatory活性を評価するために魚の供給研究所バイオアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: 学ぶ海洋生物の二次代謝産物の捕食防御活性評価法。Thalassoma bifasciatumを用いたバイオアッセイにより、カリブ海産無脊椎動物の化学的生態学的役割を実験的に解明する手法を紹介します。

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このビデオの撮影と編集に協力してくださったJames Maeda氏とAaron Cooke氏に感謝します。資金は全米科学財団(OCE-0550468、1029515)によって提供されました。

注：このプロトコルのステップ3は、脊椎動物動物被験体を伴う。手順は、動物は、可能な限り最も人道的な扱いを受けるように設計されており、ノースカロライナ州ウィルミントンの大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。 1）組織の抽出<ol><li>これは二次代謝産物の体積濃度が変更されますように絞った、乾燥したアウトまたは過度に湿った水和のその自然の状態ではないです組織を使用してください。 50mlの遠心管に挿入することができる断片またはスライスに組織を切断またはチョップ。注：新鮮な組織は、いくつかのケースで使用することができるが、それは時カットを圧迫を受けない凍結組織を、切断又は切るほうが良い場合が多い。 </li><li> 40ミリリットルの最終体積に達するまで目盛り遠沈管にジクロロメタンの1：1混合物（DCM）およびメタノール（MeOH）で30 mlに1の組織片を追加する。移転すべてのステップを実施するようにしてください適切な換気と換気フード中の溶剤。 </li><li>チューブに蓋をし、それを数回転倒し、4時間の抽出期間中に繰り返し攪拌する。注：この期間中、水はMeOHで結合し、得られたメタノール：水相をDCM相から分離する。組織を交互DCMおよびMeOHにさらされる：チューブなどのエマルジョン等の水が攪拌される。 </li><li>丸底フラスコにDCM抽出物を移し、低熱を使用して、ロータリーエバポレーターで乾燥するまで蒸発させ（&lt;40℃）。最小限の溶媒を用いて20mlのシンチレーションバイアルに乾燥した抽出物を移す。ロータリーエバポレーターアダプタでバイアルを取り付け、再び弱火を使用して、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固する（&lt;40℃）。 注：（1）ナット（2）、ワッシャー、および（3）ドングリナット：次のステップでは、ねじロッドの端部上に順番に以下の項目をねじ込むことによって組み立てることができる自家製圧迫器の使用を必要とする。ワッシャーは、穿孔またはいずれかでなければなりませんそれを50mlの遠心分離管の内径よりも小さくなるように嵌め込ま。 </li><li>圧縮により組織から抽出媒体を絞る、水抽出：組織およびMeOHを含んで目​​盛り遠心管に戻る。 MeOHを転送：同じ丸底フラスコに、水抽出物を、冷却保存（&lt;10℃）。 </li><li>水抽出物：今、脱水組織は2から6時間の期間の第二の抽出のために水没されるまで、新たなMeOHをメタノールを含む冷却丸底フラスコに抽出転送した後、卒業した遠心管にメタノールを追加します。組織が完全に抽出されなかったことをいずれかの懸念がある場合は、2〜6時間のメタノール抽出を繰り返す。 </li><li>低熱を使用して、ロータリーエバポレーターでメタノールを乾燥（&lt;40℃）。丸底フラスコをすすぎ、MeOH中の最小体積を用いて、乾燥した非極性抽出物を含有するシンチレーションバイアルに丸底フラスコから残りの水性抽出物を移す。 </li><li> E真空濃縮器で弱火（&lt;40℃）を使用して乾燥するまで水抽出物をvaporate。シンチレーションバイアルは現在、組織の10ミリリットルの総乾燥粗製の有機抽出物を含有する。密栓し、酸化を防ぐためにN 2ガ ​​スをバイアルのヘッドスペースを排気し、ストアは凍結（-20℃）。 </li></ol> 2）食品の準備<ol><li>凍結乾燥したイカマントル粉末を準備します。 注：イカマントルは、他の底生無脊椎動物のものに匹敵する、および2.2のサブ工程の原料として使用される栄養源を提供する。 <ol><li>温かい脱イオン（DI）水中のイカマントルの融解凍結リングは、その後、高速ブレンダーでそれらをピューレ。 </li><li>浅いクッキーシートと凍結にピューレイカマントルの薄層を注ぐ（-20℃）、次いで凍結乾燥される小さな断片に凍結されたイカピューレのシートを破る。 </li><li> FRの操作方法以下の凍結イカマントルピューレを凍結乾燥eezeドライヤー。 </li><li>粉末を形成するために、高速ブレンダー中でイカマントルピューレの凍結乾燥された部分を粉砕する。 </li><li>ヒュームフードでは、回転小麦粉ふるいに粉末状のイカ外套を注ぐと微粉末から組織の大きな塊を分離するためにふるいにかける。 </li><li>密封可能容器に微粉末イカ外套を転送します。酸化を防止し、凍結保存するためのN 2ガ ​​スで容器のヘッドスペースを排気する（-20℃）。 </li></ol></li><li>食品の混合物を準備します。 注：必要に応じて、複数の連続した​​アッセイを実行するとき、それは〜食品の混合物の100ミリリットルを用意することが現実的である、しかしこのレシピは、より小さなボリュームにスケーリングすることができる。 <ol><li> 3グラムアルギン酸150mlのビーカー中で脱イオン水100mlで5gの凍結乾燥したイカマントル粉末の混合物を組み合わせる。粉末が完全に水和され、混合物が均質になるまで数分間ミクロ激しく攪拌する。 注：必要に応じて、食品着色料本STで添加することができるEP：それはむしろ追加することによって、抽出物処理混合物の色にマッチしようとするよりも、両方の処置および対照の混合物が生成されます食品混合物（抽出物処理混合物中の抽出物の天然色素をマスキング）に染料を追加する方が簡単です対照混合物に染料。緑がかった、または茶色がかった食品の色、粗抽出物中の任意の顔料をマスクすることが望ましい場合が多い。 </li><li>卒業シリンジに食品の混合物の正確に10ミリリットルをロードします。このプロセスの間に気泡の混入を避けるように注意してください。 </li><li>冷凍庫からの乾燥原油有機抽出物を20ミリリットルのシンチレーションバイアルを取り外します。その後ミクロとの均一な混合物にエキスをかき混ぜる、メタノールの低下や2を追加します。 </li><li> 20ミリリットルのシンチレーションバイアルに食品マトリックスのロードを10mlシリンジを取り出し、抽出物処理食品混合物を均質化するためにミクロでかき混ぜる。 注：小さい増分（IEで注射器を取り出すために役立つことがあり、2ミリリットルを取り出し、均質化する場合、R。すべての10ミリリットルまでのEPEAT）が均質化されています。 </li></ol></li><li>アッセイペレットを準備します。 <ol><li>シリンジにエキス混合物（約1 ml）を、非常に小さなボリュームをロードし、0.25 MのCaCl 2溶液にシリンジ先端を水没。長い、スパゲッティのようなストランドを形成するために、シリンジの内容物を取り出します。 </li><li>数分後、その後、かみそりの刃でガラスカッティングボード上に4ミリメートル長いペレットにそれをチョップ、硬化ストランドを削除海水をですすぐ。 </li><li>繰り返しますコントロールペレットを作るために組織抽出物を含まずに2.3.1と2.3.2を繰り返します。溶剤添加のために制御する（ステップ2.2.3で扱わ混合物にメタノールを添加することを参照のこと）、溶媒の等量の制御ペレットを扱うようにしてください。陰性対照は、そのアッセイの魚を確認することが望まれる場合、給電思いとどまることができ、2 mgのmlの濃度で安息香酸デナトニウムを追加-1生食液27。 </li></ol></li></ol> 3）嗜好性バイオアッセイ<ol><li>野生捕獲黄相blueheadベラと摂食アッセイを行う、Thalassomaのbifasciatumは、実験室の水槽の不透明な両面区画に3のグループに保管。 </li><li>ゴム球付きガラスピペットを用いて、海水のビーカーから食物ペレットを配信。注：この方法で食べ物を受け取るために魚を訓練するために数日かかる場合があります。食品の配達の前に条件刺激（水槽のガラスにピペットの例えば数回タップ）は、食物ペレットの追加を期待する魚を訓練するために役立つことがあります。 </li><li>スコアリングペレット。容易に魚が消費する場合は、受け入れられたペレットを考えてみましょう。彼らの口腔にそれを取るために1つ以上の魚による3回の試行の最小の後に食べていない場合は、拒否されたペレットを考えて、またはペレットは、そのような試みの後に接近され、無視されている場合。 </li><li>スコアリングのサンプル。注：アッセイ手順は、 図1のフローチャートとして示されている食べたがらない魚のグループ。プロトコルの任意のステップにおいて、制御ペレットはさらに考慮されない。アッセイの一回の実行の2潜在的な結果があります。サンプルは、承認または拒否されるか。 <ol><li>魚のグループが協力的であることを確認するために、制御ペレットで始まる。治療ペレットを提供します。魚が扱わペレットを受け入れると受け入れとして、サンプルスコア。魚が扱わペレットを拒否した場合、魚が給餌を中止しているかどうかを判断するために次の制御ペレットを提供します。魚はその後の制御ペレットを受け入れると拒否されたとして、サンプルスコア。 </li></ol></li><li>レプリケーション。各抽出物のための魚の10の独立したグループでアッセイ手順を繰り返します。 </li></ol> 4）評価の意義<ol><li>フィッシャーの正確確率検定26の修正バージョンで処理されたペレットVSコントロールの消費量の差の有意性を評価します。制御のための限界​​合計と扱わペレットが固定されているように、テストを変更します、ランダムサンプルとしてそれらの両方を処理する。注：7ペレットを食べているときには、p = 0.057を提供します。 7以上のペレットを食べている場合は、したがって、すべての抽出物は、6個以下のペレットが食べられている場合には抑止力とみなされ、口当たりている。 </li><li>抽出物のグループ間の相対的な嗜好性を比較するために、各グループ内で食べられたペレットの平均数を計算します。ペレットの平均数は+標準誤差（SE）≤6を食べている場合ので、反復抽出物のグループが抑止力と考えられている6ペレットしきい値を保管してください。注意：代表的な結果では、グループ割り当ては、種であるので、複製する抽出物は、異なる個体に由来する相対嗜好性は、種間で比較することができる。 </li></ol>

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<li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defenses+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+I.+Assays+with+hermit+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).</li>
<li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+II.+Assays+with+sea+stars%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).</li>
<li>Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-predatory+defenses+of+Red+Sea+and+Caribbean+sponges.+I.+Chemical+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense.</a> Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).</li>
<li>Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+for+defensive+synergy+in+Caribbean+sponges%3A+Bad+taste+or+glass+spicules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322 (1), 67(2005).</li>
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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

明細書に記載の手順は、海洋生物にantipredatory化学防御を評価するための比較的単純な、生態学的に関連する研究室プロトコルを提供する。ここでは、メソッドのこのセットによって満たされる重要な基準を確認してください。 （1）適切な捕食者を。この送りアッセイはblueheadベラ、Thalassoma bifasciatum、カリブ海全域サンゴ礁上で最も豊富な魚の1を採用しています。 blueheadは底生無脊椎動物19の幅広い品揃えをサンプリングすることが知られてジェネラリスト肉食動物です。ジェネラリスト捕食者は、サンゴ礁上の捕食魚の大半はジェネラリストであるため、これらの初期アッセイのための最良の選択であり、それは防御を回避する機構を進化させてきたことが専門家の捕食者とは対照的に、antipredatory防御が広く、それらに対して向けられることが予想される。シングル潜在的な捕食者を使用する化学防御の実験室での調査はである10現場条件28-33の下で潜在的な捕食者の完全な補完の応答に依存している...

化学生態学は、化学者と生態学者のコラボレーションにより開発された。地上波化学生態学のsubdisciplineがしばらくの周りされているが、海洋化学生態学のはわずか数十年古いですが、海洋生物1-8の進化生態学と社会構造に重要な洞察を提供してきた。スキューバダイビングとNMR分光法の緊急の技術を利用して、有機化学者は急速に1970年代と1980年代9底生海洋無脊椎動物と藻類由来の新規の代謝産物を記述する出版物を多数生成した。二次代謝産物は、経験的証拠なしに新しい化合物に生態学的に重要な特性を帰さこれらの出版物の多くは、いくつかの目的を果たす必要があることを仮定する。約同時に、生態学者は、以前あちこちに知られているスキューバダイビングの出現を利用することと底生動物や植物の分布と存在量を記述したそのような浚渫などの比較的効果サンプリング方法をメートル。これらの研究者の仮定が固着し、ソフトボディの何かが化学的に捕食者10によって消費を避けるために擁護しなければならないということでした。種の存在量にそうでなければ説明的な作業だったものに経験主義を導入するための努力では、いくつかの生態毒性アッセイ11からの化学防御を外挿する開始しました。最も毒性アッセイは半アッセイ生物を死滅させるために責任の抽出物の乾燥質量濃度の後続の決定に、脊椎動物の組織の粗有機抽出物の水性懸濁液に、魚全体、または他の生物の曝露を含んでいた。しかし、毒性アッセイは、潜在的な捕食者は、自然条件の下で獲物知覚している様子をエミュレートしていない、とその後の研究では、毒性や嗜好性12-13の間には何の関係は認められません。それは、権威ある雑誌に出版物はほとんど、あるいは全くecologicaを持つ技術を使用していることは驚くべきことであるLの関連性14-15、これらの研究はまだ広く引用されている今日。これは、毒性データに基づいて、研究は16〜18を発表され続けることに注意することは、さらに憂慮すべきである。明細書に記載のバイオアッセイ法は、antipredatory化学防御を評価するために、海洋化学生態学者のための生態学的に関連したアプローチを提供するために、1980年代後半に開発されました。方法は、より生態学的に意味のある毒性データよりも嗜好性データを提供する、栄養的に同等の食品マトリックス中の天然の濃度で標的生物からの粗有機抽出物をサンプリングするために、モデル捕食者を必要とする。 海洋生物の組織のantipredatory活性を評価する一般的なアプローチは、4つの重要な基準は、（1）適切なジェネラリスト捕食者は、摂食アッセイにおいて使用されなければならない、（2）すべての極性の有機代謝産物は徹底的の組織から抽出されなければならない生物体を標的とする、（3）代謝産物をbしなければならないeは、それらを抽出した生物に見られるのと同じ体積濃度で栄養的に適切な実験食品に混入、及び（4）実験デザインと統計的アプローチは、相対的なdistastefulnessを示すために意味のある測定基準を提供する必要があります。 以下に概説する手順は、カリブ海の海洋無脊椎動物でantipredatory化学防御を評価するために特別に設計されています。この種はカリブ海のサンゴ礁に一般的であり、底生無脊椎動物19の幅広い品揃えをサンプリングすることが知られているので、私たちはモデル捕食魚として、blueheadベラ、Thalassoma bifasciatumを採用。標的生物由来の組織は、まず、抽出された食品の混合物と混合し、最終的にTのグループに提供されbifasciatumは、それらが抽出処理された食品を拒否するかどうかを観察した。この方法を用いたアッセイのデータは、海洋生物12,20-21、Lの防御的な化学に重要な洞察を提供してきたIFE履歴トレードオフ22-24、およびコミュニティ生態学25-26。

<table><tbody><tr><td>ジクロロメタン</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>D37-20</td><td></td></tr>メタ<tr><td>ノール</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>A41220</td><td></td></tr><tr><td>無水塩化カルシウム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>クライオクール伝熱流体</td><td>フィッシャーサイエンティフィック20-548-146</td><td></td><td>真空濃縮器用</td></tr><tr><td>アルギン酸ナトリウム塩高粘度</td><td>MPバイオメディカル</td><td></td><td></td>154723</tr><tr><td>イカのマントルリング</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>食料品店で購入可能</td></tr><tr><td>安息香酸デナトニウム</td><td>アルドリッチ</td><td>D5765</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 目盛り付き遠心分離管</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>20ml シンチレーション・バイアル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>03-337-7</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブル・パスツール・ピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット用ゴム球</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>ペレット配送用赤色電球</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>03-448-27</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 丸底フラスコ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-067E</td><td></td></tr><tr><td>ロタバップ用シンチレーションバイアルアダプター</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>K747130-1324</td><td></td></tr><tr><td>ウェイトボート</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 目盛り付きシリンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-817-53</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 目盛り付きシリンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>14-817-54</td><td></td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S17302</td><td></td></tr></tbody></table>

海洋生物の組織からの二次代謝産物のantipredatory活性を評価するために魚の供給研究所バイオアッセイ

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

海洋化生態学は、海洋生物の組織からの二次代謝産物の生態学的機能を調べることを目的として、1980年代に天然物化学者と海洋生態学者の協力から生まれた新しい学問です。その結果、実験アプローチの生態学的関連性をますます洗練させるプロトコルが進歩しました。ここでは、研究者が海洋生物の組織からの二次代謝産物の抗捕食活性を評価できるようにする、魚を飼う実験室バイオアッセイの最新版を紹介します。すべての極性の有機代謝物は、標的生物の組織から徹底的に抽出され、栄養的に適切な食品マトリックスに自然濃度で再構成されます。実験的な食品ペレットは、抽出物の抗捕食活性を評価するために、実験室の摂食アッセイでジェネラリストの捕食者に提示されます。ここで説明する手順では、ブルーヘッドであるThalassoma bifasciatumを使用して、カリブ海の海洋無脊椎動物の嗜好性をテストします。ただし、設計は他のシステムに容易に適合させることができます。このラボアッセイを使用して得られた結果は、潜在的な捕食者の完全な補完の摂食応答に依存するフィールド実験の重要な前奏曲です。さらに、このバイオアッセイは、バイオアッセイガイドによる分画を通じて摂食抑止性代謝物の単離を指示するために使用できます。この摂食バイオアッセイは、カリブ海のサンゴ礁における海洋無脊椎動物の分布と豊富さを制御する要因の理解を前進させ、薬理学、バイオテクノロジー、進化生態学など、さまざまな研究分野での研究に役立つ可能性があります。

ここでは、一般的なカリブ海のスポンジの6種（ 図2）については、このバイオアッセイの結果を報告する。これらのデータは、最初Pawlik らによって1995年に出版された。12と共起する分類群の間で化学防衛戦略の違いを調査するために、このアプローチの力を証明している。結果は、それぞれの種のために、標準誤差（SE）+食べ食物ペレットの平均数として報告した。ほとんどないペレットはAgelasのclathrodes、アムピメドーンcompressa、及びAplysinaのcauliformisからの粗有機抽出物を用いるアッセイで食べました。これとは対照的に、 カリ膣、Geodiaのgibberosa、及びMycaleツメガエルからの抽出物で作られたペレットは容易にアッセイ12で消費された。 6未満のペレットは、最初の3種のために食べられたので、彼らはかなりの抑止力と考えられた。対照的に、第2の3種は、対照からの有意差はなかった、とあった口に合うと考えた。 </p...

このバイオアッセイは、栄養的に同等の食品マトリックスを使用して、天然の濃度での海洋生物の組織の有機抽出物からの給電抑止代謝産物の存在を評価するためのモデル捕食魚を用いる。

海洋生物の組織からの二次代謝産物のAntipredatory活性を評価するために魚の供給研究所バイオアッセイ

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

この手順の全体的な目的は、海洋生物の組織に由来する二次代謝産物の抗捕食活性を評価することです。ノースカロライナ大学ウィルミントン校のジョセフ・ポロック博士です。本日は、海洋生物の組織における化学的防御を試験するためのバイオアッセイの実施に関する本ビデオの制作チームリーダーを務めた大学院生のマイケル・マーティと共に解説します。これからご紹介する手法の開発は、1980年代後半に開始されました。当時、天然物化学者は実験的な根拠がないまま二次代謝産物に生態学的な役割を割り当てていました。一方で生態学者は、生態学的な関連性のない毒性試験から防御的な役割を推測していました。本稿では、海洋生物の組織から抽出した二次代謝産物の抗捕食活性を評価するために設計されたアプローチを提示します。このアプローチは、フィーディングバイオアッセイにおける4つの重要な基準を満たしています。第一に、適切な汎用捕食者を使用していること。第二に、組織からあらゆる極性の有機代謝物を網羅的に抽出していることです。3つ目に、これらの代謝物を、生物内で見られるものと同じ体積濃度で実験用飼料に添加しました。そして4つ目に、我々の実験設計と統計的手法により、相対的な不快感を示す有意な指標が得られます。これらの摂食実験では、カリブ海の海洋無脊椎動物の組織を用いたアッセイに適したモデル捕食魚であるブルヘッドトマバイフォッサム（blue head thoma by fossum）を使用しています。この魚種はカリブ海のサンゴ礁に広く分布しており、多種多様な底生無脊椎動物を捕食することが知られているためです。それでは、マイケルがプロトコルの詳細について説明します。まず、組織を抽出する必要があります。メジューティング遠心チューブに、ジクロロメタンとメタノールの1:1混合液を最終容量30 millilitersになるまで加えます。次に、対象となる生物から組織を切り出します。これは新鮮な組織または凍結組織を用いて行うことができます。本研究では海綿動物を扱っているため、このビデオデモンストレーションではオレンジ色の象耳海綿、*Alcyonium pletroadis*を使用します。適切な体積にするために、組織を非常に小さく切断する必要がある場合があります。体積置換法を用いて、正確に10 mLの組織を抽出し、チューブに蓋をして倒立させます。その後4時間撹拌します。この期間中に、水がメタノールと混合し、得られたメタノール・水相がジクロロメタン相から分離します。チューブを撹拌することで、組織は各抽出溶媒に交互にさらされます。この抽出期間の後、2つの明確な相が現れます。メタノールと水の極性相が、ジクロロメタンの非極性相の上に位置します。パステールピペットを用いて、メス付き遠心チューブからジクロロメタン抽出液を丸底フラスコへ移してください。なお、メス付き遠心チューブは冷蔵庫で保存してください。次に続くいくつかのステップにおいて、ロータリーエバポレーターで行うすべての操作では、丸底フラスコをロータリーエバポレーターに取り付けます。ウォーターバスの温度が 40 °C 以下に保たれていることを確認してください。ロータリーエバポレーターの基本的な操作手順に従って、丸底フラスコ内のジクロロメタンを乾固させ、乾燥した非極性抽出物をごく少量のジクロロメタンを用いて再懸濁させます。丸底フラスコの壁面に付着した乾燥物質を取り除くために、攪拌または旋回操作を行うと有効な場合があります。次に、丸底フラスコからクロロメタン抽出液を20 milliliterのシンチレーションバイアルに移します。シンチレーションバイアルにキャップを付けるのではなく、シンチレーションバイアルにエバポレーター用アダプターを取り付け、再度エバポレーターで乾固させます。非極性抽出物を乾固させたシンチレーションバイアルは、以降の数ステップの間、冷蔵庫で保存することが可能です。組織とメタノール水抽出液が入った目盛り付き遠心チューブに戻り、自作の器具を用いて組織を圧縮し、抽出媒体を組織から絞り出します。次に、メタノール水抽出液を丸底フラスコに移し、冷蔵庫で冷やして保存します。目盛り付き遠心チューブに、組織が完全に浸るまでメタノールを加え、2〜6時間の2回目の抽出を行います。2回目のメタノール抽出が完了したら、冷蔵庫から冷却した丸底フラスコを取り出します。メス付き遠心チューブの内容物を凝集させ、この新しいメタノール抽出液を、先にメタノール水抽出液が入っていた元の丸底フラスコに移します。この時点で、組織が十分に抽出されていない懸念がある場合は、2〜6時間のメタノール抽出ステップを繰り返しても構いません。丸底フラスコをエバポレーターに取り付け、前述と同様にメタノールを乾去します。ウォーターバスの温度を40 °C以下に維持してください。丸底フラスコには水系抽出液が入っており、これを20 mLシンチレーションバイアル内の乾燥した非極性抽出液と混合させる必要があります。したがって、丸底フラスコの内容物を20 mLシンチレーションバイアルに移してください。必要に応じて、丸底フラスコを少量のメタノールで洗浄し、残っている抽出物をすべて回収します。これにより、シンチレーションバイアルには乾燥した非極性抽出物と極性抽出物が含まれます。ただし、極性抽出物は少量の液体中に懸濁した状態になります。真空濃縮機を用いて弱熱で水性抽出物を乾固させます。シンチレーションバイアルには、組織10 millilitersの乾燥した粗有機抽出物が含まれています。バイアル内を乾燥窒素ガスで吹き飛ばし、−20 °Cのフリーザーで保存します。これらの組織抽出物の嗜好性を試験するには、まず標的生物と同等の栄養価を持つ食品マトリックスで再構成させる必要があります。イカ外套膜のリングは、無脊椎動物組織のバイオアッセイに適したタンパク質源であり、容易に凍結乾燥粉末に調製することができます。このバイオアッセイを開始するには、冷凍したイカ外套膜のリングを温かい脱イオン水に入れます。解凍後、水を一部的に捨て、リングをブレンダーに注ぎます。イカの外套膜が粘性の液体状になるまで、高速で十分にブレンダーにかけます。材料が濃すぎて混ぜ合わせにくい場合は、水を加えてください。液状になったイカの外套膜を浅いクッキーシートに薄く注ぎ、均一に広げます。クッキーシートを-20 °Cのフリーザーに入れます。凍結させたイカのシートは、凍結乾燥のプロセスを促進するために、より小さな破片に砕く必要があります。破片が小さいほど乾燥が早くなるため、より好ましいです。凍結乾燥機にて。凍結したイカの破片をチャンバーに入れ、凍結乾燥機の操作手順に従って処理します。凍結乾燥後、イカの破片を粉砕してください。これはブレンダーを用いて行うことができます。乾燥させたイカの破片をブレンダーに入れ、材料が均一な粉末状になるまで高出力で撹拌します。次工程は、イカの粉塵の吸入を抑えるため、ドラフトチャンバー内で行ってください。凍結乾燥させたイカパウダーを回転式フラワーシフターに注ぎます。ふるいを通ったパウダーを受けるため、シフターの下に容器を保持します。ハンドルを回転させ、凍結乾燥イカ素材をふるい分けます。前工程で十分に混合されなかった大きな結合組織の断片は、ふるいで除去されます。これにより、より微細な粉末が得られます。必要に応じて漏斗を使用し、凍結乾燥させたイカ粉末を密封容器に移し、乾燥窒素ガスで置換した後、-20 °Cで冷凍保存します。凍結乾燥イカ外套膜粉末の準備が整ったので、アッセイ用飼料混合物を一括して調製します。同日に複数回のアッセイを連続して行う場合は、飼料混合物を大量に調製するのが実用的です。ここでは、100 mLの混合物の調製プロセスを実演します。清潔なウェイボートを用いて、アルギン酸 3 gと凍結乾燥させたイカ外套膜粉末 5 gを計量します。これらの乾燥原料を150 mLのビーカーに入れ、水を加えます。マイクロスパチュラで乾燥原料を穏やかに撹拌し、均一に混合させます。脱イオン水を100 milliliters加え、激しく撹拌します。粉末を完全に水和させるのに数分かかる場合があります。次のステップに進む前に、混合液が均一になっていることを確認してください。食品マトリックスを単一の色に染色する場合は、このステップで色素を添加します。目盛り付きシリンジに、食品混合物を正確に10 milliliters分採取します。このステップでは、容量の精度が極めて重要であるため、気泡が混入しないよう細心の注意を払ってください。乾燥した粗有機抽出物が入った20 mLシンチレーションバイアルをフリーザーから取り出し、メタノールを1〜2滴加えます。メタノールを加えすぎないでください。これにより、食品マトリックスが凝固するのを防ぎます。マイクロスパチュラと最小限の溶媒を用い、抽出物を均一な混合物になるまで再懸濁させます。抽出物全体が確実に再懸濁されるよう、バイアルの側面をしっかりこそげ落としてください。10 millilitersの食品マトリックスが入ったシリンジの内容物を、再懸濁した均質化抽出物が入った20 milliliterシンチレーションバイアルに注入します。この混合物をマイクロスパチュラで均一になるまで撹拌します。抽出液の混合物をごく少量、シリンジに採取します。1 mLあれば十分です。シリンジの先端を 0.25 molar 塩化カルシウム溶液に浸し、シリンジの内容物を押し出して、スパゲッティのような長いストランドを形成させます。このストランドは溶液中で硬化します。数分後、硬化したストランドを取り出し、ガラス製カッティングボードの上に広げます。カミソリを使用して、ストランドを4 mm長のペレット状に細断します。抽出液で処理したペレットを回収し、海水で洗浄します。対照用のペレットを準備します。組織抽出物を加えずに、同様の手順に従ってください。対照群と処理群のペレットの色を合わせるために、食用色素の添加が必要な場合があります。これは、魚が確実に拒絶して食べない陰性対照を調製するためのものです。Miller and Pollock (2013) の記載に従い、detonおよび安息香酸粉末を 2 mg/mL の濃度で餌の混合物に添加します。給餌試験は、野生採集したイエローフェーズの Blue head RAs thala を用いて行います。魚は、実験用水槽の不透明な側面を持つコンパートメントに3匹ずつ群れで飼育します。フードペレットの投与には、ゴム球付きのガラスピペットが適切な器具となります。ペレットが魚に容易に消費された場合、それは受容されたとみなされます。1匹または複数の魚が口に含もうとする試みを最低3回行った後でも食べられなかった場合、または、そのような試みを1回行った後にペレットに近づいたが無視された場合は、拒絶されたとみなされます。コントロールペレットの摂食を拒否する非協力的な魚のグループは、アッセイの対象から除外しなければなりません。このフローチャートは、まずコントロールペレットを与えて魚のグループが協力的であることを確認し、その後に処理済みペレットを与えるという、すべての場合に適用されるアッセイ手順を示しています。魚が処理済みペレットを口にした場合、このサンプルは「受容」と判定されます。魚が処理済みペレットを拒絶した場合、魚が摂餌を停止したかどうかを確認するために、続いてコントロール（対照）ペレットを提示する必要があります。魚がその後のコントロールペレットを受容した場合、当該サンプルは「拒絶」と判定されます。各サンプルについて、10個の独立した魚のグループを用いて試験を行う必要があります。以下は、この摂餌アッセイの実施例です。まず、対照ペレットを提示し、魚が対照ペレットを受け入れることを確認します。次に、処理済みのペレットを与えます。この場合、魚は処理済みペレットを拒絶します。そのため、続いて対照ペレットを与える必要があります。魚がその後のコントロール（対照）を受け入れない場合、そのサンプルは不適格として判定される可能性があります。各サンプルは、10個の独立した魚のグループを用いて実施する必要があります。コントロールペレットと処理済みペレットの消費量の差の有意性は、Low and Pollock (2014) によって提示されたフィッシャーの直接確率検定の修正版を用いて評価する必要があります。この試験は、対照区と処理区のペレットの周辺合計を固定し、両方をランダムサンプルとして扱うように修正されています。これにより、7個のペレットが摂食された場合のP値は0.057となります。したがって、6個以下のペレットが摂食された場合に、その抽出物は忌避性があり、摂食可能であると見なされます。ペレットが7個以上摂食された場合を正とした。抽出物グループ間で嗜好性を比較する場合、代表的な結果に示されるように、摂食されたペレットの平均個数を用いるべきである。ここでは、カリブ海に一般的に分布する海綿6種を対象としたこのバイオアッセイの結果を報告する。これらのデータはPollockら（1995年）によって最初に発表されたものであり、共存する分類群間における化学的防御戦略の違いを解明する上での本アプローチの有用性を示している。Y軸の各カテゴリーは、単一の海綿種の抽出物を表している。各種から複数の個体をサンプリングして抽出および試験を行っており、種名の後の括弧内の数字でその個体数を示している。結果は、各種の餌ペレットの平均摂取数と標準誤差として報告されています。alus、pleth、pheon、compressor、およびlycine called forisの粗有機抽出液を用いたアッセイでは、ペレットはほとんど摂取されませんでした。対照的に、VaisのCali spongyの抽出液を用いて作製したペレットでは、Geo OsaおよびMichel lavisは、アッセイにおいて速やかに消費されました。最初の3種については、摂食されたペレットが6個未満であったため、有意に忌避的であると考えられます。対照的に、後半の3種は対照群と有意な差がなく、食味が良いと考えられます。たった今実演した手法は、操作的なフィールド実験や調査と併せて、抗捕食化学防御を研究するための強力なアプローチとなります。これらのバイオアッセイの結果は、カリブ海のサンゴ礁における海洋無脊椎動物の分布と個体数を制御する要因を私の研究グループが理解するのに役立ちました。重要な点として、この手法は化学生態学の枠を超え、化学生態学における生態学的妥当性へのニーズを満たすものです。これらのバイオアッセイの結果は、薬理学、バイオテクノロジー、進化生態学など、多様な研究分野における調査に寄与する可能性があります。

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海洋生物の組織からの二次代謝産物のAntipredatory活性を評価するために魚の供給研究所バイオアッセイ

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