Name: エンテロウイルスと文化とRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615計測。 II。総培養可能なウイルスアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 学ぶ、水試料中の感染性ウイルス粒子を測定する標準化手法。BGM細胞を用いた培養可能ウイルスアッセイにより、飲料水と環境水のウイルス汚染を評価する。公衆衛生上のリスク評価に貢献する。

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著者は、この研究で使用されたSabinポリオウイルス血清型3を提供してくれた米国農務省、マーシュフィールド、ウィスコンシン州、マーク・ボーチャード博士に感謝します。Dynamac CorporationのMary Jean See、Nancy Schable、Jenifer JonesはBGM文化の準備を担当しました。Nichole E. Brinkman、Shannon M. Griffin、Brian R. McMinn、Eric R. Rhodes、Eunice A. Varughese、Ann C. Grimm、Sandhya U. Parshionikar、Larry Wymer は、USEPA Method 1615の全体的な評価に貢献していただきました。グレッチェン・サリバン(Gretchen Sullivan)氏(技術支援)そして、水のサンプルを収集することを許可してくれた地元の私有井戸の所有者と公益事業。この研究はUSEPAによってレビューされ、出版が承認されましたが、必ずしも公式の機関の方針を反映しているとは限りません。商号または商用製品への言及は、使用を推奨または推奨するものではありません。

注：定義のリストのための補足的な材料セクションS1を参照してください。 USEPAメソッド1615に関連したQA手順は補足材料セクションS2に記載されています。 1.フィルター溶出手順<ol><li>最初の溶出<ol><li>バッファリング1.5％牛肉エキス、pHが9.0の500ミリリットルを置き、メスシリンダー中で室温まで温めました。フィルターカートリッジハウジングを開き、完全に電気陽性フィルターをカバーするために牛肉エキスの十分な量を追加します。フィルターハウジング蓋を交換し、滅菌したビーカーに残った牛肉エキスを注ぎます。 </li><li>接触時間の1分後、その圧力容器または蠕動ポンプを使用して、ゆっくりとフィルターを通して滅菌ビーカーに残っているとともに、ハウジング内の牛肉抽出液を通過させます。 2Lのガラスビーカーに溶出液を収集します。 </li></ol></li><li> 2回目の溶出<ol><li>バッファリング1.5％牛肉エキスの追加の500ミリリットルを使用して、手順1.1を繰り返しますしかし、15分にステップ1.1.2での接触時間を増加させます。 </li><li> 2回目の溶出からの最初の溶出​​からそれを含む2リットルのビーカーに牛肉エキスを追加します。ビーカーに滅菌攪拌棒を追加します。 </li></ol></li></ol> 2.有機凝集濃度の手順<ol><li>少なくとも5分間、0.525％の次亜塩素酸ナトリウムとの組み合わせ型pH電極を滅菌します。無菌の dH 2 Oを有する電極をすすぎ、その後、0.05 Mチオ硫酸ナトリウムで脱塩素。 pHが4と7標準を使用してpH計を校正。 </li><li>撹拌プレート上で溶出液を入れたビーカーを置きます。プレートをオンにして、渦が形成されるまで攪拌速度を上げます。 </li><li>溶出液に1.2 M HClを滴下することにより、ゆっくりと3.5±0.1に溶出液のpHを調整します。急速な添加は、ウイルスを不活性化するため、塩酸滴下を追加します。沈殿物が形成し始めるようこの間の溶出液が白濁します。 </li><li>混合SPEを削減ゆっくりと攪拌に編し、その後30分間、室温で3.5±0.1で溶出液のpHを監視し、維持し続けます。 </li><li> 4℃で2500×gで15分間一つ以上の遠心ボトルや遠心分離機に沈殿した牛肉エキス懸濁液を注ぎます。遠心機からボトルを取り出して、いずれかの吸引またはゆっくりペレット状の沈殿物の損失を防ぐために、上清をデカントします。上清を捨てます。 注：沈殿物の量と質で牛肉エキスのロット間のかなりの変動がある場合もあります。他のロットからそれが困難で溶解しながら、いくつかのロットから生成した沈殿物を迅速に溶解します。 </li><li>沈殿物を含む遠心ボトルに、0.15Mリン酸ナトリウムの30ミリリットルを追加します。 <ol><li> 0.15 Mリン酸ナトリウム、5分以内に溶解牛肉​​エキスロットからの沈殿物のためのpH 9.0を使用してください。沈殿物が完全に溶解した後、10分間攪拌し、その後、2.7のステップにすぐ進みます。 </li><li>他のすべての沈殿物のために0.15 Mリン酸ナトリウム、pHが7.0から7.5を使用してください。 、またはより困難な沈殿物のために溶解するために10〜15分間攪拌し、オービタルシェーカー上で160 rpmで沈殿物を振盪することにより、ピペットで攪拌中に繰り返し上下ソリューションを描くことによって、滅菌スパチュラでそれらを破ります、またはこれらの手順の組み合わせによって。 注：複数の遠心分離ボトルを使用して、リン酸ナトリウム未満の30ミリリットルを使用して沈殿物を結合した​​後、1瓶やビーカーに沈殿物を合成後のボトルをすすぐために30ミリリットルの残りの部分を使用します。 </li><li>合わせた沈殿物を平底遠心分離ボトル内にある場合、瓶に攪拌棒を加えます。 2.6.5に進みます。 </li><li>合わせた沈殿物が円錐形の底部を有する遠心分離ボトル内にある場合は、小さなガラスビーカーにそれを転送し、ビーカーにスターラーバーを追加します。 </li><li>マグネチックスターラー上に瓶やビーカーを置き、PRまで攪拌ecipitateは完全に溶解しました。 </li><li> 0.525％の次亜塩素酸ナトリウムとの組み合わせ型pH電極を再滅菌し、工程2.1に記載のように0.05 Mチオ硫酸ナトリウムを用いて脱塩素。 pHは7と10の規格を使用してpH計を校正。ゆっくりと、1M NaOHで9.0に完全に溶解させ、沈殿物のpHを調整した後、10分間攪拌します。 </li></ol></li><li>攪拌棒を外し、4,000-10,000×gで、4℃で10分間溶解した沈殿物を遠心分離します。 </li><li>ペレットを乱さないように注意しガラスビーカーに上清を注ぎます。ビーカーに攪拌棒を追加し、ペレットを捨てます。 </li><li>マグネチックスターラー上にビーカーを置き、溶液をかき混ぜます。 7.0から7.5にpHを調整するのが賢明1.2 M HClのドロップを追加します。 </li><li>フィルターは、1.5％牛肉エキスの15ミリリットル、0.05 Mグリシン、pHが7.0〜7.5で前処理されたプレフィルターを含む滅菌フィルターを通過させることにより、上清を滅菌します。 </li><li>アッセイサンプルVolumE（S）の計算。 <ol><li>空白空白ラボ要塞を除くすべての試験サンプルおよびラボ試薬のためにSを計算するために使用する式（1）、 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" />式（1） D（アッセイしたオリジナル水試料の体積）は、地下水の500 Lであり、TSV（総サンプル量）は、フィールドサンプルの量は、実験室で受信された5インチ陽電カートリッジフィルター、およびFCSV（最終濃縮サンプルボリューム）を通過させますステップ2.10でろ過以下の体積です。例では、補足的な材料セクションS4.1に示されています。 </li><li>そしてブランクラボ試薬（LRB、 すなわち 、試薬グレードの水を使用して、負の品質管理）0.3によってFCSVを乗じて、ブランクラボ要塞（ すなわち 、シードされた試薬グレードの水を使用して、正の品質管理LFB）のためにSを計算します。 </li></ol></li><li> THREにFCSVを分割Eのサブサンプル。 <ol><li> 1.04倍アッセイサンプル量と同量のサブサンプル1と2を準備します。彼らは、全培養可能なウイルスアッセイ（サブサンプル1、ステップ4）を用いて分析または24時間内の分子アッセイ（図示せず）のために処理することができない場合は-70℃以下にこれらのサブサンプルを凍結します。それ以外の場合は、4℃で保持します。 </li><li>で、または-70℃以下に残りの容量（サブサンプル3）をフリーズします。 </li></ol></li><li> 10でSを分割することにより種菌の体積を計算します 。 </li></ol> 3.総培養可能なウイルス素量アッセイ注：すべての手順については、常に細胞単層を乱さないように注意してくださいソリューションを追加します。 <ol><li>デカントまたは3-6日後に分割でBGM細胞の単層を含む試験容器から吸引メディアとその後除去メディアに等しい平衡塩溶液の量を追加します。 </li><li>細胞培養TEからバランスのとれた塩溶液をデカントまたは吸引目の容器を使用し、次いで、細胞培養試験容器に接種されました<ol><li> （補足材料セクションS2.4）総培養可能なウイルス量子アッセイ対照と一緒に接種物の容積に等しいサブサンプル1の体積で各試験サンプルのための10試験容器を接種します。 </li><li> LFBとラボ強化さサンプルマトリックス（LFSM; すなわち 、播種水マトリックスサンプル）の場合は、希釈剤としてサブサンプル3および0.15 Mリン酸ナトリウム、pHが7.0から7.5を使用して5-、25-、および125倍希釈液を準備します。希釈液を作製するための手順の一例を補足材料セクションS3に示されています。ステップ3.2.1で希釈していないサブサンプル1を接種した血管に加えて、各試験容器に接種物のボリュームを使用して、各希釈系列のための10洗浄した細胞培養試験容器を接種します。 </li><li>インキュベーションの14日後、すべての10連でCPEを持っている（ステップ3.2.2に接種したもの以外の）ステップ3.2.1から任意の試験サンプルについては、事前に（ステップ3.3を参照してください）5-、25-、および125-を削減する、とサブサンプル3の625倍希釈液を接種10は、全培養可能なウイルス量子の新しいセットと一緒に各試験容器に接種物のボリュームを使用して、各希釈系列のための細胞培養試験容器を洗浄しアッセイ対照（補足材料セクションS2.4）。 </li><li>前後に血管を傾けることによって、細胞単層の表面上に接種物を配布します。存在する任意のウイルスを細胞に吸着することができるように、すべての15-20分1-5振動/分で、または血管の揺り動かしながら機械的ロッキングプラットフォーム上で80-120分間室温で試験容器をインキュベートします。 </li><li>予め温め維持培地を追加し、36.5±1℃で試験容器をインキュベートします。 </li></ol></li><li>最初の3日間、毎日顕微鏡を用いて、各試験容器内のCPEの出現を探し、その後、またはに設定冷凍庫に≥75％のCPEを示す日までの14転送任意の試験容器2〜3日ごとにそれらを調べます以下-70℃です。最終日に血管を調べた後-70℃以下に残りのすべての文化や総培養可能なウイルス量子アッセイ対照をフリーズします。 </li><li>すべての文化を解凍し、0.2μmの滅菌フィルターを通してすべてのCPE陽性試験容器からの媒体の≥15％をフィルタリングします。指定されたボリュームが目詰まりにフィルタを通過することができない場合は、濾過前に1,500-18,000×gで4℃で10分間、培地を遠心します。 </li><li>洗浄BGMの試験容器を使用して、すべての第1通路試験容器の第2の通路を実行します。 <ol><li>すべての負の試験容器から、正の血管から濾過さ媒体から解凍した培地の10％を表し接種量で新しい試験容器を接種します。 </li><li>ステップ3.2.4-3.4.3を繰り返しますが、ステップ3.3で説明したように2 回目に1 回目の通路上の負及び正だった任意の試験容器を凍結します。 3 番目のパスを実行唯一のマイナスアッセイ対照と第2通路内の 1 回目の通過時に負と陽性であった細胞培養物を使用して、2 回目の通過のために説明したように年齢。 </li></ol></li><li>彼らは1 番目と2 番目の通路の両方でCPEまたは、CPEは、第2および第3の通路の両方で、2 番目の通路まで発生していない場合はを表示したときに、ウイルス陽性と個々の試験容器を特定します。 </li><li>すべての試験サンプルのウイルス力価を計算するために、 表S2に示すように設定されたデフォルトのプログラム設定でUSEPAの最確数の電卓を使用します。 <ol><li>入力MPN / mlの値（M mL）および上部（CL UML）と下位（CL 1mLの ）95％信頼限界/ mlの値を決定する計算に各試験サンプルのためのステップ3.6からのウイルス陽性の複製試験容器の数。 </li><li> O式2を使用して対応する試験サンプルのMPN / L値（Mの L）btain。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" />式（2） M mLのステップ 3.7でMPN / mlの値であり、Sは、 分析試料の体積であり、そしてDは、 アッセイ され た元の水試料の体積です。 </li><li> M mLの値のCL UML値を代入することにより、上側信頼限界/ Lを計算します。 M mLの値のCL 1mLの値を代入することにより信頼下限/ Lを計算します。計算例は補足材料セクションS4.2に示されています。 </li><li> 0 / D 1≤などの報告M mLの値。例えば、地下水試料の0.002 MPN / L（≤1/500 L）≤。 </li><li> MPNとブランク要塞各ラボの95％信頼限界値とラボのReを計算します第1のSにより計算で得られた値/ mlに乗算した後、0.3によって、結果を分割することによってブランクエージェント。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

USEPAメソッド1615 17（UCMR3）未規制汚染物質の監視規則の第三の監視サイクル中に使用するために開発され、主に地下水にウイルスの発生を測定するために設計されました。これは、情報収集ルール（ICR）法、15,18と共通のステップ数を共有するが、2つの小さな違いがあります。両方とも、最確数（MPN）の計算に基づいている定量でBGM細胞の単層上でCPEを生成するウイルスを測定するための量子アッセイを使用しています。方法1615が、様々な水マトリックスからウイルスを濃縮するための新しい電気陽性のフィルタの使用を可能にし、細胞培養試験容器の数が20から両方の軽微な変更は、方法全体のコストを削減10に希釈ごと複製減少します。反復数の減少は、労働力を減少させるが、わずかに低い検出限界をもたらします。地下水が地表水よりもウイルスの低い濃度を有することが期待されるものの、19,20番目アッセイしたサンプルの電子の量が違いを部分的に補償する、地表水の5倍です。少ない繰り返しの使用が最も地表水には十分だろうが、いくつかは、サンプル希釈が必要になります。 方法1615は、いくつかの重要なステップと制限があります。牛肉抽出物は、ロットごとに異なります。記載されているように各ロットは、ウイルスの溶出および二次濃縮工程を経てウイルス濃度の能力の有効性について試験されるべき補足材料セクションS2.3です。この方法は、BGM細胞培養物に接種し、ウイルス力価を決定するために試料の量を計算するための正確な公式を使用します。これらの式は厳密に従わない場合は不正確な結果が生成されます。適切な無菌技術は、細胞培養物を維持するために使用されなければなりません。 14日間のインキュベーション期間の間に苦痛を示す非感染BGM細胞培養コントロールは、おそらく細胞培養の維持の問題を示しています。細心の注意はまた、TAでなければなりません交差汚染を避けるための接種及び細胞培養フラスコに培地添加に伴うピペッティングステップの間ケン。補足材料セクションS2で説明した品質管理を厳格に守る必要があります。セクションS2はまた、品質問題のトラブルシューティングに関するアドバイスを提供します。 フィルタを電気陽性するウイルス吸着の主要なメカニズムは、フィルター上の正電荷の強さとその等電点に関連したウイルスの負電荷の強さと21をテストされている水のpHに関連する電荷相互作用です。フィルターからの溶出はまた、これらの相互作用の強さに影響されます。彼らはウイルス型の間であっても、同一タイプ内の菌株によって異なるため、フィルターからの溶出は一様ではありません。これは、任意の結果は環境水中に存在するウイルスの実際のレベルを過小評価してもよいことを意味します。単一BGM細胞株の使用は、ウイルスの発生を過小評価します。範囲主にポリオウイルスとエンテロウイルスB種の血清型だけでなく、いくつかのレオ14,15,22に限定され、この細胞株でCPEを生成することができます腸内ウイルスの。他の感染性ウイルスの型は検出されません。 地面と試薬グレード水からのポリオウイルスの回収率は、両方の性能評価のためのUSEPAメソッド1615パフォーマンス受け入れ基準を満たした（PE;開始前にアナリストの性能を評価するために使用されているアナリストに未知の力価を有する、すなわち 、シードされた試薬グレードの水サンプル研究の）とLFBサンプル（補足材料表S1）。培養の手順を使用して地下水から58％回収は、水道水23,24を使用して他の人が報告したものと同様です。変動係数100％の（CV）と111％とLFBサンプルからの平均回収率はまた、PEのサンプルについて観察されたものよりも高いにもかかわらず、メソッド性能受け入れ基準を満たしたDURICRをる。 ICRは、平均intralaboratory回収率は85％（; ICR PEデータベースからの未発表データのCV 58〜131％）に36から変化させながら、施設間回収率は92％の変動係数（CV）で56％であったわけ。高い回収率がより高い種子サンプル（122 42対％）の場合よりも低いシードLFBのサンプルについて、本研究で観察されました。 ICRは、計画された時点で、それは、低いシード値を受信したPEのサンプルを、それらの高い種を受信することがより低い回収率を有するであろうことが予想されました。 LFBサンプルについてここで観察されたものと同様の、ICR PEサンプルのポリオウイルスの回収は、シード値の（CV 100％）、54％（CV 69％）、44％（CV 71％）71％であった≤300MPN、300-それぞれ1500 MPN、および&gt; 1500 MPN、。 水試料25中の感染性ウイルスを測定するための多くの方法があります。この方法は、標準化の程度の他の方法に関してで重要です。標準化は、品質と性能のコントロールが含まれていないだけで、だけでなく、すべての分析ラボは、同一の方法を実行することを確実にするために定義されているボリュームと数式を使用しています。標準化せず、実験室全体で結果を比較することは困難であり、複数の分析研究室における大規模な研究を行う際に、従って標準化が不可欠です。内蔵の標準化と、この方法は、追加のウイルス型および細胞株が含まれるように、将来的に拡張することができます。研究は、メソッドへのアデノウイルスの混入のためのデータを提供するために進行中です。

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

腸溶性ウイルスはヒトの腸のシステムに感染し、糞口経路を介して送信されるウイルスの多様なグループです。これらのウイルスは、下水処理場や浄化槽排水、不適切に設計された、または壊れた浄化槽、壊れた下水道、合流式下水道のオーバーフロー、および他のポイントとの非点源1-4を介して表面と地面の水を入力してください。水性ウイルスからヒトへの感染および疾患は、汚染されたか、不十分な消毒した水の消費を介して、またはレクリエーションの水との接触を介して起こります。病気の症状が重度の胃腸炎に軽度伴ってもよいです。結膜炎;熱;上部呼吸窮迫。手足口病。心筋炎;無菌性髄膜炎;脳炎;麻痺;敗血症5-8、および死亡9,10。 USEPAメソッド1615は、環境や飲料水中の感染性腸内ウイルス粒子を測定するための手順を提供します。これらの水は含めることができます感染性および非感染性ウイルス粒子の混合物が、唯一の感染性​​粒子は、潜在的な健康被害をもたらします。感染性ウイルス粒子は、タンパク質カプシドの完全性の喪失、太陽光から起因するUV放射線への核酸の損傷、および11-13存在することができる任意の消毒剤による損傷から環境や飲料水の中で時間をかけて感染性を失います。メソッドで提供される総培養可能ウイルスの手順はバッファローミドリザル腎臓（BGM）細胞株における細胞変性効果（CPE）の生産に基づいています。この細胞株は、検出された感染性ウイルスの種類の範囲を特定のエンテロウイルス15に主に制限されていても、なぜなら環境ウイルス学の分野14,15におけるその広範な使用を選択しました。本稿の目的は、5インチの電気陽性カートリッジフィルターの溶出、二次濃度、および全培養可能なウイルスの測定のための方法1615の手順を記述することです。の評価全体的な方法はCashdollar ら 16に記載されています。

<table><tbody><tr><td>牛肉抽出物、乾燥粉末</td><td>BD Bacto</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>極低温チューブサー</td><td>モフィ</td><td>ッシャー3775 / 945373</td><td></td></tr><tr><td>ハンクs balanced salt solution</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>機械式ロッキングプラットフォーム</td><td>Daigger</td><td>EF4907G</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-285-729</td><td></td></tr><tr><td>プレフィルター付き滅菌フィルター</td><td>VWR</td><td>28143-295</td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジフィルター</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>pH Standards</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33643, 33646, 33648</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1018 or M4642</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム, 7.5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン、EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

エンテロウイルスと文化とrt-qpcrにより水中のノロウイルス発生のepaメソッド1615計測。 ii。総培養可能なウイルスアッセイ

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

環境水や飲料水におけるウイルスの発生に関する全国的な研究が複数の分析ラボを利用する場合、標準化された方法が必要です。米国環境保護庁(USEPA)のメソッド1615は、これらの水域でエンテロウイルスとノロウイルスを測定するためのそのような標準を提供することを目的として開発されました。ウイルスは、電気陽性フィルターを使用して水から濃縮され、フィルター表面から牛肉抽出物で溶出され、さらに有機凝集によって濃縮されます。ここでは、フィルター溶出、二次濃縮、および全培養ウイルスの測定に関するメソッド1615のプロトコルを示します。各サンプルからの濃縮溶出液の一部を、バッファローグリーンモンキー腎臓細胞の10個の複製フラスコに接種します。細胞変性効果を示すフラスコの数は、1リットルあたりの感染単位の最可能性数(MPN)を定量するために使用されます。この分析法では、データ品質を向上させ、ラボ間およびラボ内のばらつきを減らすために、多くの品質管理を使用します。ラボは、定義された性能基準を満たさなければなりません。メソッド 1615 は、Sabin ポリオウイルス 3 型を播種した試薬グレードおよび地下水からのウイルス回収率を調べることによって評価されました。全培養アッセイによるポリオウイルスの平均回収率は、試薬グレードの水で111%、地下水で58%でした。

ウイルスは、3つの飲料水処理プラント及び電気陽性のフィルタを使用して、プライベートものソース地下水から濃縮しました。フィールドサンプルとLFSM制御からなる2つのサンプルセットは、別々の機会に処理プラントから回収し、一つのサンプルセットは、プライベートウェルから収集しました。各サンプルで使用される種子のMPN値を正確に起因し決定することができなかったため、全体的なウイルス回収は計算から除外された植物やプライベートウェル（1工場と別の1サンプルからの2つのサンプルの2からLFSMサンプルを用いて決定しました複製のフラスコの中で異常なCPE結果）へ。地下水試料からのポリオウイルスの回収は79％（ 図2）16の変動係数58％の平均を意味します。何の培養可能なウイルスは、重複播種していない地下水フィールドサンプルのいずれにおいても検出されませんでした。 この方法の性能はまた、LFB Sを用いて測定しました。二つの異なる種のレベルを使用して変更amples。ポリオウイルス1,000 MPNがで性能を試験するために使用されたのポリオウイルスの300 MPNの「低」力価は、USEPAメソッド1615 A​​ &quot;ハイ&quot;力価で使用される「標準的な」500 MPN LFBレベルより低いレベルでの性能を評価するために使用されましたLFSM制御のレベル。これらのコントロール111％で、平均回収率100％の変動係数（ 図2）と同様に行います。すべてのLRBサンプルは陰性であったし、すべてのLFBサンプルが合格範囲（補足材料表S1）内で行います。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> 図1のフィルタ溶出カートリッジフィルターを溶出するための圧力容器を使用するための概略図が示されています。正の空気圧は、カートリッジハウジングコン介して圧力容器内の牛肉抽出液を押し出すために使用され電気陽性カートリッジフィルターをtaining。蠕動ポンプは、牛肉抽出液を保持する容器内に配置され、ポンプの入口を、​​圧力容器の代わりに用いることができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> 地上から図2.平均ポリオウイルス回復（％）および試薬グレード水。平均回収率は、地上からのポリオウイルスのために示されています（ <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; N = 4）および試薬グレード水（ <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; N = 12）のサンプル。 12試薬グレードの水サンプルは、6が300 MPNを播種し、6は、ポリオウイルスの千MPNを播種含まれています。エラーバーは標準誤差を表します。

ここでは、バッファロー・グリーンモンキー腎臓細胞株を使用して培養可能なウイルス全体を測定する手順を紹介します。この手順は、環境水および飲料水中の感染性ウイルスの発生を測定するための標準化されたツールを提供します。

エンテロウイルスと文化とRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615計測。 II。総培養可能なウイルスアッセイ

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

本プロトコルの全体的な目的は、水試料中の感染性ウイルス粒子の量を測定することです。これは、飲料水または環境水からウイルスを濃縮した正電荷フィルターから、アルカリベースの抽出液を用いて負電荷のウイルス粒子を溶出させることで達成されます。正電荷カートリッジフィルターへのウイルスの回収については、本シリーズのパート1で解説しています。第2段階として、溶出液のpHを徐々に低下させ、サンプル中に存在するこれらの抽出タンパク質とウイルスを凝集させます。次に、遠心分離によって凝集物を回収し、リン酸ナトリウム緩衝液に溶解させ、フィルター滅菌して細菌やカビを除去します。その後、最終的な濃縮溶出液をアフリカミドリザル腎細胞に接種し、ウイルスの複製を検出するために、14日間にわたって細胞の細胞変性効果（CPE）を観察します。細胞に関連するウイルス粒子を遊離させるため、14日が経過した時点、またはいずれかのフラスコにおけるCPEが75%以上に達した時点で、すべての細胞フラスコを凍結します。CPEがウイルスの複製によるものであることを確認するために2回目および3回目の継代を行い、その後、最確数（MPN）算出プログラムを用いて、分析した各サンプル1リットルあたりの最確数を決定します。最終的に、EPA Method 1615の総培養可能ウイルス酸成分によって、水サンプル中の感染性ウイルス粒子のレベルが測定されます。この全ウイルスアッセイは、EPA Method 1615の一構成要素に過ぎません。完全な手法では、飲料水および環境水中のエンテロウイルスおよびノロウイルスの発生を測定します。得られたウイルスの検出結果は、飲料水およびレクリエーション用水におけるこれらのウイルスへの曝露によるリスクを測定するための入力データとして利用できます。本プロトコルの主な利点は、水中のウイルスを測定するための単一の標準化されたアプローチを提供することです。このアプローチは、実際には1996年に発表された情報収集規則（Information Collection Rule）法に基づいています。この方法を初めて行う人が直面する主な問題は、BGM細胞株を汚染から守ることと、CPE（細胞変性効果）を判別することです。Shay Foutと私は、溶出および有機凝集の手順を実演し、続いて細胞培養の手法について説明します。最初の溶出を行うには、室温の緩衝1.5%ビーフエキス（pH 9.0）500 millilitersをメスシリンダーに入れます。次に、フィルターカートリッジハウジングを開き、正電荷フィルターが完全に浸るまで十分な量のビーフエキスを加えます。残りのビーフエキスをビーカーに入れます。フィルターハウジングの蓋を戻します。1分間の接触時間の後、ペリスタルティックポンプと滅菌チューブを使用して、ハウジング内およびビーカー内に残っているビーフエキス溶液を、ゆっくりとフィルターに通します。溶出液を滅菌済みの2リットルガラスビーカーに回収します。緩衝1.5%ビーフエキス500ミリリットルを用いてこれらの手順を繰り返しますが、この際は接触時間を15分としてください。2回目の溶出で得られたビーフエキスを、1回目の溶出液が入った2リットルビーカーに加え、ビーカーに滅菌済みの撹拌子を入れます。溶出液の入ったビーカーをスターラープレートの上に置きます。プレートの電源を入れ、渦ができるまで撹拌速度を上げます。1.2 Mの塩酸（HCl）を滴下し、溶出液のpHを3.5 ± 0.1にゆっくりと調整します。急速に添加するとウイルスが不活化するため、酸を滴下してください。この間、沈殿が生じ始めるため、溶出液は混濁します。攪拌速度を低速に下げ、室温で30分間、溶出液のpHが3.5 ± 0.1に維持されているかを継続的に監視してください。次に、沈殿したビーフエキス懸濁液を1本または数本の遠心管に注ぎ、4 °Cで2,500 ×gにて15分間遠心分離します。遠心機からチューブを取り出し、ペレット状の沈殿物が失われないよう、上清をゆっくりとデカンテーションします。上清は廃棄して構いません。5分以内に溶解するビーフエキスロットの場合、沈殿物が入った遠心分離ボトルに0.15 molarのリン酸ナトリウム（pH 9.0）を30 milliliters加えます。5分以内に溶解しない沈殿物の溶解手順については、テキストプロトコルを参照してください。沈殿物が完全に溶解した後、10分間撹拌します。次に、スターバーを取り出し、溶解した沈殿剤を4,000～10,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら、上清をガラスビーカーに carefully に注ぎます。ビーカーにスターバーを加え、ペレットを廃棄します。ビーカーをマグネチックスターラーの上に置き、溶液を攪拌します。1.2 M HCLを滴下し、pHを7.0から7.5の間に調整します。15 mLの緩衝1.5%ビーフエキス（pH 7.0〜7.5）で前処理したプレフィルター付き滅菌フィルターに通し、上清をフィルター滅菌します。テキストプロトコルを参照して、すべてのテストサンプルのアッセイサンプル量（S）を算出してください。次に、Sを10で割って、接種量を算出します。これらの計算に基づき、フィルター滅菌後に得られた最終濃縮サンプル量を、テキストプロトコルの記載通りに3つのサブサンプルに分けてください。各試験サンプルについて、BGM細胞の単層を含む10個の試験容器に、サブサンプル1を接種量と同量で接種し、同時に総培養可能ウイルス定量アッセイコントロールも接種します。ラボ強化ブランクおよびラボ強化サンプルマトリックスについては、サブサンプル3を希釈液として0.15 M リン酸ナトリウム（pH 7.0～7.5）を用い、5倍、25倍、125倍の希釈液を調製します。未希釈のサブサンプル1を接種した容器に加えて、各希釈系列について、洗浄済みの細胞培養試験容器10個に、それぞれ接種量分の液を接種します。容器を前後に傾け、接種物を細胞単層の表面全体に分散させます。試験容器を室温で80～120分間、機械的なロッキングプラットフォームを用いて毎分1～5回の振動でインキュベートするか、あるいは15～20分ごとに容器を揺らし、存在するウイルスが細胞に吸着するようにします。その後、あらかじめ温めておいた維持培地を試験容器に加え、36.5 ± 1 °Cでインキュベートします。顕微鏡を用いて、最初の3日間は毎日、その後は14日目まで2〜3日ごとに各試験容器における細胞変性効果の出現を確認します。細胞変性効果が75%を超えた試験容器は、-70°C以下に設定したフリーザーに移します。最終日の検査後、残りのすべての培養液および総培養可能ウイルス定量アッセイコントロールを-70°C以下で冷凍保存します。次に、すべての培養物を融解し、CPE陽性のすべての試験容器から培地の15%以上を0.2 µmの滅菌フィルターでろ過します。次のステップは、洗浄したBGM腎細胞試験容器を用いて、すべての第1継代試験容器の第2継代を行うことです。そのためには、すべての陰性試験容器および陽性容器のろ過培地から得られた融解培地の10%に相当する接種量を、新しい試験容器に接種します。第1継代で行った手順を繰り返し、第1継代で陰性で第2継代で陽性となった試験容器をすべて凍結保存します。次に、陰性アッセイコントロールおよび、第1継代で陰性で第2継代で陽性となった細胞培養物のみを用いて、第2継代と同様の手順で第3継代を行います。第1継代と第2継代の両方で細胞変性効果（CPE）が認められた試験容器、または、第2継代まで細胞変性効果が現れず、第2継代と第3継代の両方で認められた試験容器を、ウイルス陽性と判定します。テキストプロトコルに記載されているデフォルトのプログラム設定を用いて、米国環境保護庁（U.S. Environmental Protection Agency）の最確数（MPN）計算機を使用し、すべての試験サンプルのウイルス力価を算出します。次に、得られた1 mLあたりの感染単位の最確数、および1 mLあたりの上限・下限信頼限界の値を用いて、テキストプロトコルに記載されている通り、1 Lあたりの感染単位の最確数および対応する信頼限界を算出します。土壌および試薬グレードの水サンプルからのポリオウイルスの平均回収率を示します。地下水試料からのポリオウイルスの平均回収率は58%であり、変動係数は79%であった。ウイルスを添加していない重複地下水フィールド試料からは、培養可能なウイルスは検出されなかった。また、2つの異なる添加レベルを用いて修正したラボ添加ブランク試料を用い、手法の性能を測定した。12個の試薬グレードの水試料には、300 MPNの感染単位を添加した試料6個と、1,000 MPNのポリオウイルス感染単位を添加した試料6個が含まれていた。これらのコントロールは同様の結果を示し、平均回収率は111%、変動係数は100%でした。本手順を実施する際は、サンプルの汚染を防ぐために、無菌操作および良好な実験室習慣（GLP）を遵守することが重要です。また、ウイルス病原体を扱う際は、本手順の実施時に常に手袋を着用するなど、適切な予防策を講じる必要があります。このビデオを視聴することで、ウイルスの希釈と正電荷フィルターの使用、および有機凝集と細胞培養アッセイの実施方法について十分に理解することができたはずです。この手順に加えて、分子アッセイを行うことで、さらに他のウイルス型を同定および検出することが可能です。

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

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JoVE Journal

Environment

環境

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

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タバココナジラミの迅速同定のループ介在増幅法 (LAMP) アッセイ

このプロトコルは、RT-PCR の方法論を利用したティラピア生体ティラピア湖ウイルス (TiLV) を診断します。全体の方法は、総 RNA の抽出、続いて cDNA を合成して、従来の PCR またはバインディングの蛍光色素を結合 dsDNA を使用して量的な PCR によって TiLV...

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15窒素分析のためのマイクロプロット設計と植物および土壌サンプル調製

学ぶ、水試料中の感染性ウイルス粒子を測定する標準化手法。BGM細胞を用いた培養可能ウイルスアッセイにより、飲料水と環境水のウイルス汚染を評価する。公衆衛生上のリスク評価に貢献する。

エンテロウイルスと文化とRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615計測。 II。総培養可能なウイルスアッセイ

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