電界誘起リリースおよび測定によるエキソソームのバイオマーカーの検出（EFIRM）

本手順の全体的な目的は、生体試料からエクソソームを効率的に抽出し、その内部貨物を放出させ、迅速に分析することです。具体的には、まずエクソソームマーカー標的抗体を結合させた磁性微粒子を用いて生体試料からエクソソームを抽出し、抽出したエクソソームを電極表面にロードします。次に、電界を用いてエクソソームを溶解させ、放出された内部貨物を電極表面のプローブにハイブリダイズさせます。

レポーター分子も同様にシステムにハイブリダイズさせます。最終ステップとして、電極表面に基質溶液を加え、電流を測定することで読み取り値を得ます。最終的に、電流の電気化学的測定を用いて、エクソソーム試料中の核酸またはタンパク質の含有量を定量します。

超遠心分離法やリシン緩衝液を用いた既存の手法に対する本技術の主な利点は、エクソソーム成分の抽出および分析を簡便かつ迅速に行える点にあります。本技術に期待が集まっているのは、このefim技術により、疾患時または正常時に臓器から放出され、血管系を通じて口腔内に到達する情報を、初めて利用できるようになったためです。本技術によってこれらの情報を捕捉し、分子成分を放出させることで、柔軟な形式で同時に検出することが可能になります。

この疾患識別情報について、一般的に、本手法を初めて用いるユーザーは、注意深く行わないと磁性マイクロ粒子の取り扱いが困難であるため、苦労する可能性があります。さらに、生物学的試料分析における電気化学的手法の活用は、一部の人にとって斬新なパラダイムであるかもしれません。磁性マイクロ粒子と電気的なロード（担持）の習得は困難であるため、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。磁性マイクロ粒子を取り扱い、電極上にロードする際は、細心の注意を払う必要があります。

まず、10 µg/mLのストレプトアビジンコート磁性マイクロパーティクルを含むストック溶液を再懸濁し、5 µLを495 µLのPBSが入ったマイクロ遠心チューブに加えてビーズを洗浄します。最初に、チューブをマグネットラックに1分間静置し、ビーズを乱さないように注意してバッファーを除去します。

その後、チューブを非磁性ラックに移します。500 µLのPBSを加え、ビーズを洗浄します。最終洗浄後、この操作を計3回繰り返します。

ビーズを490 µLのPBSに懸濁させ、次に1 mg/mLストック溶液から5 µLのビオチン化マウス抗ヒトCD 63抗体を加えます。ピペッティングで溶液を混合し、サンプルローテーターを90度の往復回転で5秒間、5度の振動で1秒間というプログラムに設定します。チューブをローテーターにセットし、室温で30分間プログラムを実行します。

次に、チューブをマグネットラックに移し、5分間静置します。ビーズを500 µLのPBSで3回洗浄し、Caineを含む490 µLのPBSで再懸濁します。チューブにサンプル識別名をラベルし、サンプルの10 µLを加え、数回ピペッティングしてサンプルと抗体結合ビーズを混合させます。

次に、チューブをサンプルローテーターに移し、室温で2時間、同じプログラムで運転します。その後、1 molar Tris-HClバッファー 500 µLでビーズを3回洗浄します。マグネットラックを使用し、電極に固定する準備として、エクソソームを磁性ビーズに結合させます。

まず、プローブ、塩化カリウム、およびオレモノマーのストック試薬を蒸留水で希釈します。5'末端ビオチン化DNAプローブは、GADH mRNAに特異的です。モノマープローブ溶液をボルテックスミキサーで混合します。

各ユニット電極が裸金で構成される作用電極、対極、および参照電極からなる16センサー電極アレイを使用します。電極間の相互汚染を防ぐため、電極アレイの上にプラスチック製のウェルを配置します。モノマープローブ溶液60 µLを作業電極の表面に移し、作用電極、対極、および参照電極が液体で覆われるようにします。

モノマープローブを電解重合させるために、A-C-S-W-E電場として知られる周期的な方形波電場プロファイルを印加します。これにより、電極表面に導電性高分子層が形成されます。センサーを蒸留水で3回すすいだ後、窒素ガスで乾燥させ、電極表面から液体を除去します。

キャプチャープローブで電極をプレコートした後、1 µMの検出プローブ溶液 5 µLをビーズ・エクソソーム複合体溶液 495 µLに加え、ピペッティングで混合します。ここで、プローブはGA dhに特異的な3'末端フルオレセイン標識DNAプライマーです。プレコート済みの電極アレイを、センサーの作用電極に合わせて配置された16個の磁石からなる磁石アレイの上に配置しました。

次に、ビーズエクソソーム溶液60 µLを電極表面に滴下します。A-C-S-W-E電場を20サイクル印加します。放出されたエクソソーム貨物が電極表面のプローブにハイブリダイズします。

蒸留水で電極表面を3回すすいで未結合の分析物を除去し、窒素ガスで電極を乾燥させます。次に、Caseinを含むPBSを用いて、抗フルオレセインHRP標識抗体を1対1000に希釈します。その後、この抗体希釈液60 µLを電極表面に添加します。

電極表面にA-C-S-W-E電場を印加し、検出プローブに抗フルオレセインHRP抗体を結合させます。蒸留水でセンサー表面を3回洗浄して過剰な抗体を取り除き、その後、電極を窒素ガスで乾燥させます。次に、マルチチャンネルピペットを用いて各センサー表面にTMB基質を60 µL分注し、電気化学ポテンショスタットを用いて-200 mVで60秒間電極電流を測定します。

tricの読み取り値を得るため、透過電子顕微鏡を用いてエクソソームが磁気ビーズに結合しているかを確認した。ビーズに付着している70から100 nanometerサイズの顆粒は、電場または界面活性剤による溶解後のエクソソームの既知のサイズと一致している。ビーズの付近にエクソソームは見られない。

エクソソーム中のGA DH mRNAをアトリック読み出し法によって検出しました。電場または界面活性剤によるエクソソームの溶解に伴い、GA DHの量は予想通り時間とともに減少しており、これは唾液中のエクソソーム外環境にさらされたことを示しています。ヒトCD 63 GFPエクソソームマーカーを産生するヒト肺がん細胞を注入したマウスの血清および唾液中のエクソソーム含有量の測定には、Efimが使用されました。

20日後、がん細胞を注入したマウスの血清および唾液の両方においてCD 63 GFPの高レベルな発現が認められましたが、生理食塩水を注入したマウスでは認められませんでした。この手順を行う際は、ビーズを洗浄して電極表面を均一に洗浄する際に、十分な量の液体を抽出できるようビーズに触れないようにすること、および電極上の領域に適切にロードすることを忘れないでください。このEFIM技術は、全身性疾患において遠隔器官がいかにして情報を放出させ、それをエクソソームと呼ばれる実体の中で算出できるかという、これまで未充足であった重要な能力を提供しました。

これらがどのように唾液などの口腔内に流入し、エクソソームを捕捉して分子標的を放出させ、糖尿病や膵臓がん、その他の生命を脅かす疾患を同時に検出することが可能になるのかを解説します。このビデオを視聴することで、生体試料からエクソソームを迅速に抽出する方法、エクソソーム内のカーゴを放出させる方法、そして統合電極システムを用いてエクソソームの内容物を迅速に分析する方法について深く理解することができます。