Name: 電界誘起リリースおよび測定によるエキソソームのバイオマーカーの検出（EFIRM） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学ぶエキソソームの電気化学的検出法。磁気マイクロ粒子と電場を用いてバイオ流体からエキソソームを抽出・溶解し、RNAやタンパク質のバイオマーカーを迅速に定量分析する革新的なEFIRM技術を解説します。

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この作品は、（FW）のグラントUL1TR000124を通じて、トランスレーショナル科学、国立衛生研究所を進めるための研究資源のための国立センター、国立センターによってサポートされていました。フェリックス＆ミルドレッド·イップ寄附教授職と（DTWWへ）バーンズファミリー基金、（MT）の賞数T90DE022734下の国立衛生研究所の歯科·頭蓋顔面研究所研究所。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

1.磁気ビーズベースのエキソソームの抽出<ol><li>ビーズを再懸濁し微小遠心管にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）バッファーの495μlの中にストレプトアビジン被覆磁性微粒子を5μlのよく混合溶液をピペットで。磁気ラックを使用して3回洗浄し、500μlのPBSでビーズを懸濁します。ラックは、サンプル微小遠心管を保持することができる収納部側の磁石のアレイである。 <ol><li>各洗浄のために、最初のチューブは1分間のラックの上に座るし、その後慎重にビーズを乱すことなく上澄み液を除去するためのピペットチップを使用してみましょう。 </li><li>側の磁石せずに定期的なラックにチューブを置きます。チューブに500μlのPBSを追加し、一緒に解決し、ビーズを混合するために、ピペットを使用しています。その後、再び溶液からビーズを分離するための磁気ラック上に戻ってチューブを置く。 </li><li> PBS aの磁化と再懸濁を介してバッファのこの削除を実行します合計3回。これは、磁性粒子の最初の洗浄を行います。 </li></ol></li><li>磁気ラックの非磁化部分に配置されたチューブを、PBS緩衝液490μlの中にビーズを再懸濁する。ビーズの混合物中に1.0 mg / mlのストック濃度でビオチン化マウス抗ヒトCD63抗体のピペットで5μL。溶液中のビーズと抗体を混合するためにピペットを使用してください。 </li><li>サンプル回転子上のビーズとビオチン化抗体混合物を用いてマイクロチューブを置きます。 5秒間傾けると1秒間5℃で振動90°で相互の回転のためのサンプル回転子のための回転子のパラメータを設定します。 RTで30分間、これらのパラメータでサンプル·ビーズ混合管を回転させます。 </li><li>共役した後、未結合抗体を除去する。 <ol><li> RTで回転の30分に続いて、5分間のバック磁気ラック内のチューブを配置します。 </li><li>マイクロピペットを用いて、液相を除去することにより、ビーズの3回の洗浄を行い、500μで洗浄、PBSのリットル。トリプル洗浄後、490カゼイン-PBSのμLとラックの磁化されていない部分に所定の位置にビーズを再懸濁します。 </li></ol></li><li>抗体コートビーズを使用したエキソソーム抽出。 <ol><li>ターゲットを絞ったサンプルIDを各チューブにラベルを付けます。マイクロ遠心チューブに血清または唾液10μlのサンプルをピペットで。数回ピペッティングしてサンプルとした磁気ビーズを混合するためにピペットを使用してください。 </li><li>ローテーター上のサンプルと抗ヒトCD63抗体ビーズを有する管を配置し、室温で2時間回転させる。ステップ1.2で説明したのと同じ回転子パラメータを使用してください。 </li><li>回転サンプルの2時間に続いて、溶液からビーズを分離するために磁化するマイクロピペットで液相を除去し、トリス塩酸緩衝液500μlでビーズを再懸濁することにより、トリプル洗浄を行う。結果として得られるビーズは今エキソソームに結合させ、電界放出および測定のための準備ができているされている。 </li></ol></li></ol> 2.電界誘起リリースNDエキソソーム量の測定<ol><li> GADPHプライマーを有する電極の初期のプレコーティング<ol><li>プラスチックウェルに個別電極の交差汚染を防ぐために電極アレイを適用する。この実験では、裸の金製の作業、カウンタ、および基準電極からなるアレイ内のそれぞれの単位電極16センサ電極アレイを使用する。 </li><li>超純蒸留水でチューブに株式試薬をピペッティングすることにより100 nMのDNAプローブ、0.3 MのKCl、および10mMのピロールの原料混合物を準備します。ボルテックスで完全に混合。 注：この研究のために選択されたDNAプローブは、エキソソーム内に存在することが知られているGAPDHを参照遺伝子に対応する。使用したプローブ配列は5&#39;-ビオチンAGGTCCACCACTGACACGTTG-3 &#39;。すべての電極上でこの混合物を使用してください。 </li><li>ピペットで各金電極の表面にモノマー-DNAプローブ混合物を60μl。作業、cは適切な範囲があることを保証するために電極を調べる液体混合物によるounter、及び基準電極。 </li><li> Electropolymerizeモノマープローブの混合物は、電極表面に周期的な方形波（CSW）電界プロファイルを適用することにより、電極表面上に導電性高分子層を作成する。この電界は9秒350 mVのを適用すると、すぐに1秒間950 mVのへの切り替えで構成されています。印加電界の100秒、合計10サイクルの電極は、この環状の方形波プロファイルを適用する。 </li><li>電極の表面から液体を除去するために蒸留水および窒素ガスで乾燥して、センサ表面を3回すすぐ。液体が適切に電極から削除されていることを確認してください。 </li></ol></li><li>エキソソーム貨物アンロード<ol><li>ビーズ - エキソソーム複雑な混合物の495μLにロード検出プローブの1μMの5μlのと混合するピペットを使用しています。 注記：検出プローブは、3 &#39;末端にフルオレセイン分子に結合DNAプライマー配列である。検出器PROBこの研究のために使用される電子シーケンスはエキソソーム内にあるGAPDH mRNAに対応している。フルオレセイン結合検出プローブの配列は以下のとおりである：5&#39;-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-フルオレセイン-3 &#39;。 </li><li>ピペットの下に磁石アレイと金電極表面へのプローブとビーズ - エキソソーム複雑な混合物60μlの。この磁石アレイは、センサの作用電極に対応するように整列16 2.54ミリメートルの直径のネオジム磁石で構成されています。 図2（a）は、磁石とビーズエキソソームソリューションの配置を示している。 </li><li>サンプルは電極表面にロードされると、-300 Mvで9秒、200 MV（200秒の合計）で1秒でCSW電界の20サイクルを適用します。解放されるエキソソーム貨物は電極の表面にプライマーにハイブリダイズするであろう。エキソソームの表面マーカーは、調査の対象である場合、実験のこの部分をスキップする。 図2Bは、このプロセスを示している。 </li> &lt;李&gt;ウォッシュオフ三重蒸留水で電極表面を洗浄することにより、電極表面に結合していない分析物。窒素ガスで電極を乾燥させる。 </li></ol></li><li>レポーター抗体および読み出し<ol><li> （：1,000希釈1にHRP）カゼイン/ PBSで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに結合し150単位/ mlの抗フルオレセイン抗体60μlのを追加します。 </li><li>プローブサンドイッチに複雑な抗フルオレセインHRPに電界駆動型共役を使用してください。電極表面に5サイクルのために1秒1秒、500 mVのために-200 mVのを適用します。 図2（a）は、タンパク質および核酸システムの両方のための捕捉および検出プローブ複合体を示しています。 </li><li>蒸留水と窒素ガスとの乾燥を使用してトリプル洗浄センサー表面。 </li><li>未結合の過剰抗フルオレセイン抗体の洗浄除去に続いて、3,3 &#39;、5,5&#39;-テトラメチルベンジジン（TMB）基質の60μlを添加する。マルチチャンネルピペットを使用して、各センサー表面上に、この基板をロードします。 </li><li> 16チャネルの同時測定が可能な電気化学ポテンショスタットを用いて60秒間-200 Mvで電極電流を測定することにより、現在の電流測定読み出しを実行します。 図2Cは、読み出し時の電流プロファイルの一例である。 </li></ol></li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig2highres.jpg" /> EFIRM法の図2のコンポーネント。（A）抗ヒトCD63被覆した磁性微粒子を使用して、生体液からエキソソームを抽出した後、粒子-エキソソーム複雑に適用される周期的な方形波を用いたエキソソーム貨物をアンロードする方法。解放エキソソームからRNA / DNA /タンパク質標的を検出するために使用される電極バイオセンサーの（B）のスキーム。 （C）より大きい電流の大きさをtに対応EFIRM法、電流測定からの読み出しの代表例生体分子のより高いレベルoをこの図は、Wei らからである。14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+Sensor+for+Multiplex+Biomarkers+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection.</a> Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).</li>
<li>Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+exosomal+biomarker+by+electric+field-induced+release+and+measurement+%28EFIRM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM).</a> Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).</li>
</ol>

デビッド·ウォンはRNAmeTRIX社、分子診断会社の共同創設者である。 PeriRx LLCはRNAmeTRIXから分子診断に関連する知的財産のサブライセンス。デビッド·ウォンはPeriRxにコンサルタントです。

結果が示すように、抗ヒトCD63被覆した磁性ナノ粒子は、具体的には70〜100ナノメートルの範囲のサイズを有する小さな粒子を捕捉することができる。この捕獲粒子は、エキソソームの以前に観察されたプロファイルと一致している。さらに、粒子の捕捉以下の低電圧CSWの使用は、ビーズ表面から削除し、貨物放出のための伝統的な溶解緩衝液ベースの方法と類似のDNAの分解プロフィールを引き起こすことが示されている。このデータは、エキソソーム貨物放出のワークフローがエキソソーム脂質膜の破壊のための環状の方形波の適用によって簡略化することができることを示している。この簡略化された方法に悪影響エキソソーム貨物に影響を与える可能性の緩衝液を溶解することを必要とせずに迅速な貨物の放出を可能にし、結果としてEFIRM方法は、超遠心分離、溶解の使用する従来の方法と比較してエキソソームコンテンツ研究のための好ましい方法であると思われるバッファ。感度、特異度、およびEFIRM方法の容易さは、生物流体からエキソソームを抽出し、急速に核酸およびタンパク質標的の両方の内部コンテンツをテストするために最適です。 EFIRM方...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>. The disclosures were updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>.

Errata: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

エキソソーム研究は、RNA 1、DNA 2、およびタンパク質3貨物を運ぶ脂質微小胞を調べ、調査の新興分野である。エキソソーム生物学の以前の研究は、血液4、尿5、母乳6、および唾液7などの生体液中のエキソソームの同定につながった。研究では、遠隔体8の異なるシステム間の通信を瞑想、エキソソームは、異なる細胞経路に役割を果たすことが実証されている。ロールのエキソソームは細胞間コミュニケーションにおいて役割を果たすので、それらは疾患状態と相関して生体分子標的（タンパク質、RNA、およびDNA）をパッケージ化することができると仮定される。 インビトロ 3および動物モデル9の研究は、この仮説を裏付けるように見える。バイオマーカー発見のためのエキソソームコンテンツを調査において、それは生体液から選択エキソソームを単離するための方法論を開発することが必要である、誘起expulsiエキソソームからの貨物、およびエキソソーム生体分子の定量化の上で。この作業の範囲では、エキソソームは、構造体は、約70~100ナノメートルの直径を有し、表面マーカーCD63を有するとして定義される。 研究者は、通常、最初の超遠心分離10によってエキソソームを精製した後、溶解バッファーキットの使用を通じてエキソソームコンテンツを処理する。溶解緩衝液法の使用は、数分から時間の範囲のインキュベーション時間を必要とする。このプロセスは、潜在的にエキソソーム貨物を害する劣化をサンプリングする可能性がある。例えば、周囲の細胞外環境への溶解緩衝液を介して放出唾液エキソソームRNAは、エキソソームRNA溶解後の測定が安定化試薬11を添加せずに、特に困難な作業バッファ作る、1分間の下での半減期を有している。溶解および安定化のための様々な試薬を加えるの配合効果が複雑にエージェントを導入し、ANALYを妨害する可能性がエキソソームコンテンツのSIS。別のアプローチは、迅速にエキソソームコンテンツをアンロードし、安全に特徴づけのために貨物を保持するのに役立つことができる。 本研究では、エキソソーム内容物の放出のために不均一な電界の使用を提案する。電気フィールドが分​​極し、細胞膜を構成する脂質二重層を破壊する能力を運ぶことが知られている。私たちの実験的な作品は、エキソソームの微小胞の構造を破壊し、運ば貨物を解放するために、不均一な周期的な方形波（CSW）の使用方法を探ります。この方法は、ほとんどの生体分子が中断されないことを意味し、数百ミリボルトの範囲で電圧を使用しています。我々は、環状方形波の使用は、周囲の流体環境に唾液エキソソームのmRNA内容物の放出を作動することができることを実証する。エキソソームコンテンツのこのリリースは、シームレスに、バイオマーカーの発現レベルを定量するために使用することができ、電極システムに統合されている12,13。この提案された方法は、エキソソームコンテンツの迅速、高感度、および溶解バッファー無料で分析することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig1highres.jpg" /> EFIRMワークフロー図1.概要。。EFIRM法が広くエキソソームを精製し、分析するために必要な三つの主要段階に分けられる。 このCSWベースエキソソームコンテンツ放出および分析方法は、エキソソームを単離するためのCD63特異的磁気ビーズと組み合わせて使用​​される。これらのCD63-親和性ビーズは、唾液サンプル（および他の生体液）からのエキソソームの選択的な単離を可能に。インキュベーションおよび磁化ビーズを使用してエキソソームの抽出に続いて、ビーズは、 図1を参照 。内容物の放出実験の分析部をベースCSWための電気化学センサーシステムに移行作業の概要を示しているEFIRM方法のフローチャート。

<table><tbody><tr><td>Helios 16チャネルリーダーシステム(チップインターフェース付き)&nbsp;</td><td>Genefluidics社(米国</td><td>)&nbsp;RS-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>16x センサーチップ、ベアゴールド、5チップパック</td><td>Genefluidics、米国</td><td>SC1000-16X-B</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗ヒトCD63抗体</td><td>Ancell、米国</td><td>215-030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne ストレプトアビジンT1</td><td>Invitrogen、米国</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Neodynium Magnetics(直径1/10インチ x 厚さ1/32インチ)</td><td>K&J Magnetics, USA</td><td>DH101</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Distilled Water</td><td>Life Technologies, USA</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Mettler Toldeo 3 M KCl Solution</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>1911512</td><td></td></tr><tr><td>Pyrrole</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>W338605-100g</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td><td>Roche, Germany</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;,5,5&prime;-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)</td><td>Neogen, Usa</td><td>330175</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Solution Life Technologies, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Casein/PBS</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>37532</td><td></td></tr></tbody></table>

電界誘起リリースおよび測定によるエキソソームのバイオマーカーの検出（efirm）

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

エキソソームは、細胞間コミュニケーションにおける仲介の役割を果たして微小胞構造体である。彼らは病気差別バイオマーカーを運ぶかどうかを決定するエキソソームの内部の貨物を研究するために重要である。エキソソーム分析を行うためには、内部コンテンツに損傷を与えることなく、標的生体液からエキソソームを抽出し、分析するための方法を開発する必要がある。 電界誘起放出および測定（EFIRM）は、特に、生体液からのエキソソームを抽出し、その積荷を降ろして、その内部RNA /タンパク質含有量を試験するための方法である。抗ヒトCD63特異的抗体磁性微粒子を用いて、エキソソームは、まず生体液から沈殿させる。抽出後、低電圧電気サイクリック方形波（CSW）は、小胞膜を破壊し、貨物搬出を引き起こすために適用される。エキソソームの内容は、資格でのために電極表面上に固定化されたDNAプライマーまたは抗体とハイブリダイズさせる分子コンテンツのntification。 EFIRM方法は、エキソソームを抽出し、溶解緩衝液なしの分析のために貨物をアンロードするために有利である。この方法は、エキソソームの両方のRNA及びタンパク質バイオマーカー標的の特異的な検出を行うことができる。サイズベースの技術とは対照的にEFIRMは、具体的には、それらの表面マーカーに基づいて、エキソソームを抽出する。 透過型電子顕微鏡（TEM）およびアッセイは、エキソソームキャプチャおよび分析のための方法の機能性を実証する。 EFIRM法は、生理食塩水コントロールを受けた11匹のマウスに対して彼らエキソソームプロファイルをテストするために、ヒト肺癌H640細胞を注射した9匹のマウス（エキソソームマーカー、ヒトCD63-GFPを発現するようにトランスフェクト細胞株）の分析をエキソソームに適用した。エキソソームのバイオマーカーのレベルの上昇（参照遺伝子GAPDHおよびタンパク質表面マーカーのヒトCD63-GFP）は、H640の両方の血清および唾液サンプルをマウスに注射するために見出された。さらに、SalIでvaの血清試料を、直線性（R = 0.79）を有することが実証された。これらの結果は、遠位疾患の検出のための唾液エキソソームのバイオマーカーの生存のために示唆している。

TEMを用いてビーズのエキソソームキャプチャの検証 抗ヒトCD63磁気ビーズを使用して、唾液からのエキソソームの単離は、透過型電子顕微鏡（TEM）画像を用いて抽出プロトコールに従って検証した。 TEMはすぐに、（ 図3A、および3B参照 ）は、隣接するエキソソームの既知のプロファイルと一致して70〜100 nmの顆粒とした磁気ビーズを示しています。いいえ70-100 nmの顆粒は、以前にそれらに結合させた抗ヒトCD63抗体を持っている（ 図3Cおよび3Dを参照）しませんでした唾液中の磁気ビーズのために認められなかった。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig3highres.jpg" /> 磁...

エクソソームは、重要な疾患識別バイオマーカーを潜在的に運ぶ生体液内に見られる微小胞構造です。ここでは、エキソソームを特異的に抽出し、不均一な電気環状矩形波を使用してエキソソームの破壊後に両方のRNA/タンパク質標的のエキソソームカーゴを迅速にテストするための新しい方法が使用されます。

電界誘起リリースおよび測定によるエキソソームのバイオマーカーの検出（EFIRM）

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

本手順の全体的な目的は、生体試料からエクソソームを効率的に抽出し、その内部貨物を放出させ、迅速に分析することです。具体的には、まずエクソソームマーカー標的抗体を結合させた磁性微粒子を用いて生体試料からエクソソームを抽出し、抽出したエクソソームを電極表面にロードします。次に、電界を用いてエクソソームを溶解させ、放出された内部貨物を電極表面のプローブにハイブリダイズさせます。レポーター分子も同様にシステムにハイブリダイズさせます。最終ステップとして、電極表面に基質溶液を加え、電流を測定することで読み取り値を得ます。最終的に、電流の電気化学的測定を用いて、エクソソーム試料中の核酸またはタンパク質の含有量を定量します。超遠心分離法やリシン緩衝液を用いた既存の手法に対する本技術の主な利点は、エクソソーム成分の抽出および分析を簡便かつ迅速に行える点にあります。本技術に期待が集まっているのは、このefim技術により、疾患時または正常時に臓器から放出され、血管系を通じて口腔内に到達する情報を、初めて利用できるようになったためです。本技術によってこれらの情報を捕捉し、分子成分を放出させることで、柔軟な形式で同時に検出することが可能になります。この疾患識別情報について、一般的に、本手法を初めて用いるユーザーは、注意深く行わないと磁性マイクロ粒子の取り扱いが困難であるため、苦労する可能性があります。さらに、生物学的試料分析における電気化学的手法の活用は、一部の人にとって斬新なパラダイムであるかもしれません。磁性マイクロ粒子と電気的なロード（担持）の習得は困難であるため、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。磁性マイクロ粒子を取り扱い、電極上にロードする際は、細心の注意を払う必要があります。まず、10 µg/mLのストレプトアビジンコート磁性マイクロパーティクルを含むストック溶液を再懸濁し、5 µLを495 µLのPBSが入ったマイクロ遠心チューブに加えてビーズを洗浄します。最初に、チューブをマグネットラックに1分間静置し、ビーズを乱さないように注意してバッファーを除去します。その後、チューブを非磁性ラックに移します。500 µLのPBSを加え、ビーズを洗浄します。最終洗浄後、この操作を計3回繰り返します。ビーズを490 µLのPBSに懸濁させ、次に1 mg/mLストック溶液から5 µLのビオチン化マウス抗ヒトCD 63抗体を加えます。ピペッティングで溶液を混合し、サンプルローテーターを90度の往復回転で5秒間、5度の振動で1秒間というプログラムに設定します。チューブをローテーターにセットし、室温で30分間プログラムを実行します。次に、チューブをマグネットラックに移し、5分間静置します。ビーズを500 µLのPBSで3回洗浄し、Caineを含む490 µLのPBSで再懸濁します。チューブにサンプル識別名をラベルし、サンプルの10 µLを加え、数回ピペッティングしてサンプルと抗体結合ビーズを混合させます。次に、チューブをサンプルローテーターに移し、室温で2時間、同じプログラムで運転します。その後、1 molar Tris-HClバッファー 500 µLでビーズを3回洗浄します。マグネットラックを使用し、電極に固定する準備として、エクソソームを磁性ビーズに結合させます。まず、プローブ、塩化カリウム、およびオレモノマーのストック試薬を蒸留水で希釈します。5'末端ビオチン化DNAプローブは、GADH mRNAに特異的です。モノマープローブ溶液をボルテックスミキサーで混合します。各ユニット電極が裸金で構成される作用電極、対極、および参照電極からなる16センサー電極アレイを使用します。電極間の相互汚染を防ぐため、電極アレイの上にプラスチック製のウェルを配置します。モノマープローブ溶液60 µLを作業電極の表面に移し、作用電極、対極、および参照電極が液体で覆われるようにします。モノマープローブを電解重合させるために、A-C-S-W-E電場として知られる周期的な方形波電場プロファイルを印加します。これにより、電極表面に導電性高分子層が形成されます。センサーを蒸留水で3回すすいだ後、窒素ガスで乾燥させ、電極表面から液体を除去します。キャプチャープローブで電極をプレコートした後、1 µMの検出プローブ溶液 5 µLをビーズ・エクソソーム複合体溶液 495 µLに加え、ピペッティングで混合します。ここで、プローブはGA dhに特異的な3'末端フルオレセイン標識DNAプライマーです。プレコート済みの電極アレイを、センサーの作用電極に合わせて配置された16個の磁石からなる磁石アレイの上に配置しました。次に、ビーズエクソソーム溶液60 µLを電極表面に滴下します。A-C-S-W-E電場を20サイクル印加します。放出されたエクソソーム貨物が電極表面のプローブにハイブリダイズします。蒸留水で電極表面を3回すすいで未結合の分析物を除去し、窒素ガスで電極を乾燥させます。次に、Caseinを含むPBSを用いて、抗フルオレセインHRP標識抗体を1対1000に希釈します。その後、この抗体希釈液60 µLを電極表面に添加します。電極表面にA-C-S-W-E電場を印加し、検出プローブに抗フルオレセインHRP抗体を結合させます。蒸留水でセンサー表面を3回洗浄して過剰な抗体を取り除き、その後、電極を窒素ガスで乾燥させます。次に、マルチチャンネルピペットを用いて各センサー表面にTMB基質を60 µL分注し、電気化学ポテンショスタットを用いて-200 mVで60秒間電極電流を測定します。tricの読み取り値を得るため、透過電子顕微鏡を用いてエクソソームが磁気ビーズに結合しているかを確認した。ビーズに付着している70から100 nanometerサイズの顆粒は、電場または界面活性剤による溶解後のエクソソームの既知のサイズと一致している。ビーズの付近にエクソソームは見られない。エクソソーム中のGA DH mRNAをアトリック読み出し法によって検出しました。電場または界面活性剤によるエクソソームの溶解に伴い、GA DHの量は予想通り時間とともに減少しており、これは唾液中のエクソソーム外環境にさらされたことを示しています。ヒトCD 63 GFPエクソソームマーカーを産生するヒト肺がん細胞を注入したマウスの血清および唾液中のエクソソーム含有量の測定には、Efimが使用されました。20日後、がん細胞を注入したマウスの血清および唾液の両方においてCD 63 GFPの高レベルな発現が認められましたが、生理食塩水を注入したマウスでは認められませんでした。この手順を行う際は、ビーズを洗浄して電極表面を均一に洗浄する際に、十分な量の液体を抽出できるようビーズに触れないようにすること、および電極上の領域に適切にロードすることを忘れないでください。このEFIM技術は、全身性疾患において遠隔器官がいかにして情報を放出させ、それをエクソソームと呼ばれる実体の中で算出できるかという、これまで未充足であった重要な能力を提供しました。これらがどのように唾液などの口腔内に流入し、エクソソームを捕捉して分子標的を放出させ、糖尿病や膵臓がん、その他の生命を脅かす疾患を同時に検出することが可能になるのかを解説します。このビデオを視聴することで、生体試料からエクソソームを迅速に抽出する方法、エクソソーム内のカーゴを放出させる方法、そして統合電極システムを用いてエクソソームの内容物を迅速に分析する方法について深く理解することができます。

detection-exosomal-biomarker-electric-field-induced-release

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