Name: グリコシダーゼ活性の検出のためのインドキシル配糖体の合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぶインドキシル配糖体の新規合成法。インドキシル酸エステルを中間体として用い、複雑な糖構造を高収率で合成可能です。グリコシダーゼ活性の検出に有用な発色性基質の調製に応用できます。

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デンマークのコペンハーゲンにあるGlycom A/Sによるこの作業への支援に感謝します。

一般的な備考:
すべての反応は、ドラフトと適切な個人用保護具を使用して行われました。すべての試薬および溶媒(p.a.;乾燥溶媒の含水率:MeCN <50 ppm;Et2O <0.01%;CH2Cl2 <0.003%;THF<0.005%)は商用ソースから購入され、受け取ったとおりに使用されました。TLC は、Merck シリカゲル 60 F254 プレートで行いました。化合物は、UVおよび/またはEtOH/H2SO4(9:1)による処理およびその後の加熱によって検出されました。カラムクロマトグラフィーは、Merck/Fluka シリカゲル 60(230-400 メッシュ)を使用して行いました。ろ過は、ビュヒナーファンネルとアスピレーターポンプを使用して行いました。ロータリーエバポレーター(40°C、~200 rmp)を使用して溶媒を除去しました。製品を高真空(ロータリーベーンポンプ)で乾燥させました。乾燥溶媒を必要とする反応は、アルゴン雰囲気下で行った。
>jove_content<以下では、5-ブロモ-4-クロロ-インドキシル酸アリルエステル(12)を用いたX-Gal(16)の合成について説明する。この合成配列に従って調製されたメチルエステルだけでなく、さまざまな置換パターンを持つその他の化合物については、参考文献17-19を参照してください。
1. アクセプター:5-ブロモ-4-クロロ-インドキシル酸アリルエステルの合成 18 (12)
<ol>
	<li>N-アセチル化:N-(4-ブロモ-3-クロロ-2-メチルフェニル)-アセトアミドの合成 (6)
	<ol>
		<li>10.0 g(45.7 mmol)の4-ブロモ-3-クロロ-2-メチルアニリンを30 mlのジクロロメタンに溶解します. 
		注意！ジクロロメタンは有害であり、氷浴で溶液を冷却します。</li>
		<li>6.50 ml(68.7 mmol)の無水酢酸を滴下し、混合物を室温まで温めます。混合物は、8時間または一晩攪拌することができます。注意！無水酢酸は腐食性で可燃性です。</li>
		<li>溶媒を除去し、9:1酢酸エチル/メタノール(収率:97%(11.6 g、44.2 mmol)、無色固体)から再結晶します。 
		注意！酢酸エチルは刺激性があり、可燃性です。注意！メタノールは有毒で可燃性です。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酸化:N-アセチル-5-ブロモ-6-クロロ-アントラニル酸の合成 (7)
	<ol>
		<li>2.30g(8.76mmol)の6(ステップ1.1から得られる製品)と2.10g(8.52mmol)のMgSO4•7H2Oの混合物を40mlの水に還流し、クーラーと滴下漏斗を備えた3ネックの丸底フラスコに入れます。</li>
		<li>水中の50 mlの飽和KMnO4溶液を3時間かけて反応混合物に滴下します。.その後、還流下でさらに2時間、約135°Cのオイルバスで加熱します。注意！過マンガン酸カリウムは有害で酸化性があります。</li>
		<li>室温まで冷却し、反応中に形成されるピロルサイト(MnO2)をろ過します 
		注意！ピロルサイトは有害です。</li>
		<li>塩酸(37%)をpH 1まで濾液に加え、次いで製品を濾過し、真空中で乾燥させる(収率:70%(1.80g、6.15mmol)、無色固体) 
		注意！塩酸は腐食性です。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱アセチル化:5-ブロモ-6-クロロ-アントラニル酸の合成 (8)
	<ol>
		<li>3.90 g(13.3 mmol)の7(ステップ1.2から得られた製品)を70 mlの1 N水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、約100°C(オイルバス)で5時間加熱します 
		注意！水酸化ナトリウムは腐食性です。</li>
		<li>室温まで冷却し、塩酸(37%)をpH 1まで加え、次にビュヒナー漏斗で製品をろ過し、真空中で乾燥させます(収率:88%(2.93 g、11.7 mmol)、無色固体)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>無水物の形成:5-ブロモ-6-クロロ-イサト酸無水物の合成(9)
	<ol>
		<li>8.17 g(32.6 mmol)の8(ステップ1.3から得られた製品)を33 mLの乾燥アセトニトリルに懸濁します。 
		注意！アセトニトリルは有害で可燃性です。</li>
		<li>室温で撹拌し、5.3 mlと3.22 g(10.8 mmol)のトリホスゲン溶液を18.5 mLの乾燥ジクロロメタンに30分間同時に滴下します。.その後、50°Cで3時間加熱します(オイルバス)。注意！ピリジンは有害で可燃性です. 
		注意！トリホスゲンは有毒であり、ホスゲンを放出する可能性があります。</li>
		<li>溶媒の約75%を除去し、100mlの蒸留水を加えて反応を急冷し、製品をろ過します。少量の冷たいジクロロメタンで洗ってください。</li>
		<li>製品を真空中で乾燥させます(収率:88%(7.53g、27.2mmol)、無色固体)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N-アルキル化:5-ブロモ-6-クロロ-N-[(メトキシカルボニル)アリル]-イサト酸無水物の合成 (10)
	<ol>
		<li>25 g(90 mmol)の9(ステップ1.4から得られた生成物)を250 mlの無水ジメチルホルムアミドに溶解し、氷浴で冷まします 
		注意！ジメチルホルムアミドは有害で可燃性です</li>
		<li>水素化ナトリウム(パラフィン中60%)の1.15相当量を部分ごとに追加します. 
		注意！水素化ナトリウムは腐食性で可燃性です。水/氷との激しい反応。</li>
		<li>0°Cで30分間攪拌した後、室温まで温め、1.2相当のアリルブロモ酢酸を滴下します。</li>
		<li>5時間攪拌した後、500mlの蒸留水を加えて反応を急冷し、製品をろ過します。</li>
		<li>水(3回、100ml)で洗浄し、製品を真空中で乾燥させます(収率:93%(31.5g、84.1mmol)、無色固体)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>無水物開口部:5-ブロモ-6-クロロ-N-(メトキシカルボニル)-アントラニル酸アリルエステルの合成 (11)
	<ol>
		<li>10 g(27 mmol)の10(ステップ1.5から得られる製品)を100 mlのアリルアルコールに溶解します 
		注意！アリルアルコールは環境に有害で危険です。</li>
		<li>350 mg(8.70 mmol)の水素化ナトリウム(パラフィン中60%)を部分ごとに追加します。.</li>
		<li>6.5時間または一晩撹拌した後、溶媒を取り除きます。</li>
		<li>粗生成物をカラムクロマトグラフィー(カラム30 x 6 cm、シリカ240 g)石油エーテル/酢酸エチル2:1にさらします。RF = 0.66)、(収率:80%(8.30 g、21.3 mmol)、黄色油). 
		注意！石油エーテルは可燃性で刺激性があり、環境に危険です。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ディークマン縮合:5-ブロモ-4-クロロ-インドキシル酸アリルエステルの合成 (12)
	<ol>
		<li>3.0 g(7.7 mmol)の11(ステップ1.6から得られる製品)と1.75 g(15.6 mmol)のカリウムtert-ブトキシドを100 mlの乾燥ジエチルエーテルに混合します 
		注意！カリウムtert-ブトキシドは腐食性で可燃性です. 
		注意！ジエチルエーテルは有害で、非常に引火性です。</li>
		<li>混合物を還流下(より低温)で40〜45°Cで2時間加熱します。</li>
		<li>溶媒を約75%除去し、希釈塩酸(100ml、1M)を加えます 
		注意！完全に乾かさないでください、分解を引き起こす可能性があります。</li>
		<li>製品をろ過し、真空中で乾燥させます(収率:84%(5.14g、15.5mmol)、無色からわずかに緑色の固体)。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. インドキシル配糖体:X-Gal17の合成
<ol>
	<li>相間移動糖鎖化:(5-ブロモ-4-クロロ-インドックス-3-イル酸アリルエステル)2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-ᴅ-ガラクトピラノシドの合成 (14)
	<ol>
		<li>インド酸アリレスター12(ステップ1.7から得られた生成物)400 mg(1.21 mmol)、ドナー2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-ᴅ-galactopyranosyl bromide(α-acetobromogalactose)のインド酸アリレスター12(ステップ1.7から得られる生成物)、410 mg(1.21 mmol)を10 mlのジクロロメタンに混合します。.注意！硫酸水素テトラブチルアンモニウムは有害です。</li>
		<li>炭酸カリウム(1 M)の水溶液10 mlを加えます 
		注意！炭酸カリウムは腐食性です。</li>
		<li>ドナー(TLC:石油エーテル/酢酸エチル)が完全に消費されるまで室温で攪拌します。</li>
		<li>有機相(分液漏斗)を分離し、Na2SO4で乾燥させ、溶媒を除去します。</li>
		<li>粗生成物をカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル1:1;RF = 0.33)。(収率:86%(690mg、1.04mmol)、無色固体)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>エステル切断と脱炭酸:(N-アセチル-5-ブロモ-4-クロロ-インドール-3-イル)2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-ᴅ-ガラクトピラノシドの合成 (15)
	<ol>
		<li>600 mg(0.908 mmol)の14(ステップ2.1から得られた製品)を15 mlの乾燥テトラヒドロフランに溶解します 
		注意！テトラヒドロフランは有害で可燃性です。</li>
		<li>800 μlのモルホリンと105 mg (9.09 μmol) tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0)を加え、室温で一晩攪拌します 
		あぶない!モルホリンは可燃性で腐食性があります。</li>
		<li>溶剤を取り除きます。</li>
		<li>400 mg(2.40 mmol)酢酸銀、800 mg(5.79 mmol)炭酸カリウム、および10 mlの無水酢酸を加えます><。
		注意！酢酸銀は刺激性があり、環境に危険です。</li>
		<li>90-100°Cで20分間加熱します。</li>
		<li>室温まで冷却した後、ジクロロメタンで希釈します。</li>
		<li>混合物を水で2回、希釈したNaHCO3溶液(10%)で1回洗浄します 
		注意！重炭酸ナトリウムは腐食性です。</li>
		<li>有機相をNa2SO4(フィルター)で乾燥させ、溶媒を除去します。</li>
		<li>粗生成物をカラムクロマトグラフィー(PE / EA 1:1;RF = 0.24)、(収率:88%(495mg、8.00mmol)、無色固体)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zemplén Deacetylation: (5-ブロモ-4-クロロ-インドール-3-イル)-β-ᴅ-ガラクトピラノシドの合成 (16)
	<ol>
		<li>396 mg(0.436 mmol)15(ステップ2.2から得られた生成物)を10 mLのメタノールに溶解します。</li>
		<li>触媒量のメタノール酸ナトリウムを加え、室温で一晩攪拌します. 
		注意！メタノール酸ナトリウムは可燃性で腐食性です。</li>
		<li>Amberlite IR-120 H+(フィルター)で中和し、濃縮します. 
		注意！アンバーライトIR-120 H +は刺激性があります。</li>
		<li>製品を真空中で乾燥させます(収率:87%(170mg、0.416mmol)、無色固体)。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. モデル実験の図解:X-Galを用いたβ-ガラクトシダーゼの活性証明
<ol>
	<li>500 μLのバッファー (Tris-HCl 20 mM; pH 7.4; 50 mM NaCl, 0.1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid; or any other suitable buffer for your enzyme) に0.5 mMのX-Gal溶液を調製します。これは、X-Galを数μlのジメチルスルホキシドに溶解できます)。</li>
	<li>1 μl β,1-3-ガラクトシダーゼ (EC 3.2.1.23 10,000 U/ml; またはその他の適切なβ-ガラクトシダーゼ) を加え、37 °C で振とう (600 rps) します。</li>
	<li>反応を追います。インディゴタイプの染料は、短期間で形成されます。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

特にグルコース型構造やより複雑な糖類の収率が低く、限界があるため、インドキシル配糖体に対する新しい合成アプローチが開発されました。インドキシル酸エステルは貴重な重要な中間体であることが証明され、モジュール式でスケーラブルな経路で得られました。すべてのステップは高収率であり、安価な出発原料と簡単な精密検査により、マルチグラムの合成が可能です。アリルエステルアプローチの利点は、反応性2位の遮断です。したがって、収率低下の副反応が抑制されます。アリルエステルを採用することで選択的な開裂が可能になり、これはカルボキシル官能基を含む基質で特に重要です。
これらのアクセプターの相間移動グリコシル化は、それぞれの過アセチル化ハロゲン化グリコシルで行い、一般的な条件下で高収率に成功しました。その後、アリルエステルをパラジウム触媒で選択的に切断し、粗生成物を穏やかな銀媒介脱炭酸にかけた。これが合成の重要なステップです。特に、反応時間を短くし、温度をできるだけ低くすることが重要でした。酢酸銀を使用した場合、最良の条件が見つかりました。最後に、アセチル保護基は、ゼンプレンの条件に従って通常どおり除去され...

長い間、インジゴの製造は経済的に非常に重要なプロセスでした。大規模な化学合成によって安価にインジゴを入手できるようになる前は、キリスト教以前の時代から天然資源から前駆体が得られていました。インドのインジゴ植物に含まれるインジゴ前駆体の量（0.2-0.8 %）は約30倍も多いため、17th世紀になると、ヨーロッパでのインジゴ提供植物（天然インジゴ）の栽培は採算が合わなくなりました。19世紀末には、インジゴの化学合成が普及し、従来の栽培は衰退しました1,2。
植物に天然に存在するインジゴ前駆体には、インディカン (1)、インサタンA (2)、およびイサタンB (3) があります（Figure 1）。これらはすべて、インドキシル部位に配糖体残基が結合した構造をしています。例えば酵素加水分解によるグリコシド結合の切断により、インドキシル (4) が放出されます。インドキシル自体はほぼ無色ですが、速やかに酸化されてインジゴ染料 (5) を形成します。この高感度な反応は、酵素活性のモニタリングのために、生化学、組織化学、細菌学、および分子生物学に応用されてきました。酵素の単離や精製を行わないin vivoでの活性スクリーニングや、アガロースプレートまたは溶液中での迅速テスト（e.g., ブルーホワイトスクリーニング、マイクロウェル）が可能です。インドキシル部位に結合している残基（e.g., エステル、配糖体、硫酸基）に応じて、さまざまな酵素クラス（e.g., エステラーゼ、グリコシダーゼ、スルファターゼ）に適した基質が開発されています3。以下では、インドキシル配糖体の生成と応用について重点的に解説します。
<img alt="インドール誘導体とインジゴ染料の生成を示すインジカン加水分解プロセスの図。" src="/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図1"> 
図1：天然インジゴ前駆体と、加水分解によるインジゴ染料の生成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
インドキシル部位の置換パターンによって、得られるインジゴ染料の色と物理的性質が決まります。最も一般的な置換パターンは、5-bromo-4-chloro（Xと略記；緑がかった青）、5-bromo（青）、および5-bromo-6-chloro（マゼンタ）です。これらは染料粒子が最も小さく、顆粒を形成せず、加水分解部位からの拡散が最小限であるためです。後者の特性は、特にin vivo実験において重要となります3。
エステラーゼ活性検出のためのインジゴ生成法の最初の報告は、1951年にBarrnettとSeligmanによってなされ、彼らはインドキシル酢酸および酪酸を用いました4。約10年後、このインジゴ生成の原理が哺乳類のグルコシダーゼの局在化に適応されました5。これまで、合成が困難であることが判明しているものの、いくつかのインドキシル配糖体が開発されてきました。ほとんどの合成は、アクセプターとしてN-アセチル化インドキシルを、ドナーとして対応するグリコシルハライドを用いる方法に基づいています6-14。グリコシル化は、水酸化ナトリウム存在下のアセトン中で行われます。これらの条件下では多くの副反応が起こり、収率が著しく低下します。特にグルコース型構造では、非常に低いグリコシル化収率が報告されています（例えば、(N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranosideでは15%6、より最近の例である(N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,2',3',4'-penta-O-acetyl-β-ᴅ-xylobiosideでは26%14）。インドキシル酸エステルを用いるという新しいアプローチを通じて、かなりの数のインドキシル配糖体が良好な収率で調製されました（例えば、(N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranosideの収率は57%）。
以下のプロトコルでは、インドキシル酸アリルエステル（5-bromo-4-chloro）の簡便な合成と、それに基づくインドキシル配糖体（X-Gal）の合成について説明します。また、シンプルなモデル実験を用いて、X-Galを用いたβ-ガラクトシダーゼの酵素反応性を示します。

<table><tbody><tr><td>無水酢酸</td><td>Gr&uuml;ssing</td><td>10298</td><td>腐食性、可燃性</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608-001-00-3</td><td>有害、可燃性</td></tr><tr><td>アリルアルコール</td><td>Aldrich</td><td>453021</td><td>有害で環境に危険</td></tr><tr><td>アンバーライト IR-120 H+</td><td>Fluka</td><td>06428</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>ブロモ酢酸</td><td>メルク</td><td>802260</td><td>腐食性、毒性、危険環境のために4</td></tr><tr><td>-ブロモ-3-クロロ-2-メチルアニリン</td><td>ABCR</td><td>AB</td><td>171687刺激性</td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>ACROS</td><td>326850010</td><td>有害な</td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>Gr&uuml;ssing</td><td>10274</td><td>有害で非常に可燃性</td></tr>の<tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td>ACROS</td><td></td><td>348430010 有害で可燃性</td></tr><tr><td>のジメチルスルホキシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>607-022-00-5</td><td>刺激性、可燃性</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>AppliChem</td><td>A1103.0500</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>&ベータ;1,3-ガラクトシダーゼ、組換え、大腸菌</td><td>Calbiochem</td><td>345795</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>VWR</td><td>20252.290</td><td>腐食性</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム水和物</td><td>メルク</td><td>105885</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>ACROS</td><td>326950010</td><td>有毒、可燃性</td></tr><tr><td>モルホリン</td><td>ヤンセン チミカ</td><td>15.868.57</td><td>腐食性、可燃性</td></tr><tr><td>Peroleumエーテル</td><td>Azelis</td><td>111053</td><td>可燃性、刺激性、環境に危険</td></tr><tr><td>炭酸カリウム</td><td>Gr&uuml;ssing</td><td>12005</td><td>腐食性</td></tr><tr><td>過マンガン酸カリウム</td><td>Gr&uuml;ssing</td><td>12056</td><td>有害で酸化性</td></tr><tr><td>カリウム tert-ブトキシド</td><td>メルク</td><td>804918</td><td>腐食性、可燃性</td></tr><tr><td>ピリジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>613-002-00-7</td><td>有害で可燃性</td></tr><tr><td>酢酸銀</td><td>フルーカ</td><td>85140</td><td>刺激性、環境に危険</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Gr&uuml;ssing</td><td>12144</td><td>腐食性</td></tr><tr><td>水素化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>814552</td><td>腐食性、可燃性</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Riedel-de H&auml;en</td><td></td><td>S181200 腐食性</td></tr>メタ<tr><td>ノール酸ナトリウム</td><td>メルク</td><td>806538</td><td>腐食性、可燃性</td></tr><tr><td>の硫酸ナトリウム</td><td>Gr&uuml;ssing</td><td>12175</td><td></td></tr><tr><td>テトラブチルアンモニウム硫酸水素</td><td>ランカスター</td><td>5438</td><td>有害な</td></tr><tr><td>テトラヒドロフラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87371</td><td>有害で可燃性</td></tr><tr><td>のテトラキス (トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216666</td><td></td></tr><tr><td>Triphosgene</td><td>Fluka</td><td>15217</td><td>有毒</td></tr><tr><td>なトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩</td><td>Sigma</td><td>T-3253</td><td>刺激物</td></tr></tbody></table>

グリコシダーゼ活性の検出のためのインドキシル配糖体の合成

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

インドキシル配糖体は、グリコシダーゼ活性をモニタリングするための貴重で汎用性の高いツールであることが証明されました。インドキシルは酵素加水分解によって放出され、例えば大気中の酸素によって急速に酸化され、インジゴタイプの染料になります。この反応は、酵素の単離や精製を行わずにin vivoでの迅速かつ容易なスクリーニングを可能にし、寒天プレートや溶液中での迅速な試験(青白スクリーニング、マイクロウェルなど)を可能にし、生化学、組織化学、細菌学、分子生物学で使用されています。残念ながら、このような基質の合成は、さまざまな副反応とインドキシルヒドロキシル機能の反応性が低いため、困難であることが証明されました。特にグルコース型構造では、低収率が観察されました。私たちの新しいアプローチは、主要な中間体としてインドキシル酸エステルを採用しています。さまざまな置換パターンを持つインドキシル酸エステルをスケーラブルな経路で調製しました。これらのアクセプターと過アセチル化ハロゲン化グリコシルによる相間移動グリコシル化は、一般的な条件下で高収率で行うことができます。エステル切断とそれに続くマイルドな銀媒介グリコシル化により、過アセチル化インドキシル配糖体が高収率で得られます。最後に、Zemplénに従って保護解除が行われます。

indicaneおよび5-bromo-indicaneの最初期の合成は、すでに1927年および1929年にRobertsonによって報告されている15,16。アクセプターとしてindoxylic acid methyl esterを用いることで、反応性の高い2位をブロックし、副反応を部分的に抑制した。脱保護と脱炭酸（160 °C、無水酢酸、1時間）に続き、アセトン/水酸化ナトリウム中での配糖化、そして最終的な脱アセチル化を行うことで、Indicaneおよび5-bromo-indicaneが得られた。この概念に基づき、我々はindoxylic acid allyl esterをアクセプターとして用いる、改善されたindoxyl glycosideの合成法を開発した17-19。アクセプターの合成は、対応する置換アニリン誘導体(5)から開始する（Figure 2）。アミノ基のアセチル化(6)の後、過マンガン酸カリウムで酸化することにより、N-アセチル化アントラニル酸誘導体(7)を得た。次にアセチル保護基を除去し(8)、トリホスゲンとの反応により、対...

インドキシル配糖体は、酵素スクリーニングと酵素活性モニタリングのための確立された広く使用されているツールです。特にグルコースタイプの構造では、以前の合成は困難で低収率であることが証明されました。私たちの新しいアプローチは、インドキシル酸エステルを貴重な中間体として採用し、かなりの数のインドキシル配糖体を良好な収率で生成します。

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

本手順の全体的な目的は、複雑な糖鎖構造を持つものを含むエンド配糖体（Endo Glycosides）に対する、良好な収率での新規な合成アプローチを提示することです。これは、まずメチルレンを出発原料として、イニック酸アロエステルアクセプターを合成することで達成されます。第二のステップでは、このアクセプターをアセチル化糖供与体（glycosyl hali donor）で配糖化（glycosyl）します。次に、パラジウム触媒を用いてアリルエステルを切断し、続いて銀介在性の脱炭酸反応を行うことで、アセチル化されたinoxグリコシドを合成します。最終ステップとして、ゼプラン脱アセチル化を行い、保護基のないinoxグリコシドを得ます。最終的に、調製した発色基質を酵素活性の定性試験に使用します。既存の手法に対する本手法の主な利点は、複雑で不安定な炭水化物構造を持つ配糖体を容易に生成できる点にあります。この手法の着想は、1927年にAlexander Robertsonが行った、最初となるInca employ inic acid methyl etaの合成に関する論文を読んだことがきっかけでした。後続の手法では、入手しやすさからocci inox cellアクセプターが使用されましたが、収率の低さや精製上の問題がありました。合成を開始するには、テキストプロトコルに記載されているハロゲン置換leneをサテライトとして使用します。次に、3口丸底フラスコを用い、得られたハロゲン化メチルオールアセトアミド2.3 gと水40 mL、および硫酸マグネシウム七水和物2.1 gを3時間還流させる。飽和過マンガン酸カリウム水溶液50 mLを滴下し、その後、オイルバスを用いて約135 °Cでさらに2時間混合物を還流させる。混合物を室温まで冷却し、ろ過して副生成物のパイロサイトを除去し、37%塩酸を用いて溶液のpHを1に調整する。次に、溶媒から生成物をろ過し、真空下で乾燥させます。乾燥後、テキストプロトコルに従って生成物を単離し、得られた生成物 8.17 g を 33 mL の脱水アセトニトリルに懸濁させます。30 分かけて、5.3 mL のピリジンと、3.22 g のトリスチンを 18.5 mL の脱水ジクロロメタンに溶解させた溶液を、この溶液に滴下しながら同時に加えます。その後、オイルバスを用いて反応液を 50 °C まで加熱します。3時間後、溶媒の約75%を除去し、100 millilitersの蒸留水を加えて反応を停止させます。生成物をろ過し、その後、5から10 millilitersの冷クロロメタンでフィルターを洗浄します。洗浄後、生成物を真空乾燥させ、この中間体をアルキル化し、テキストプロトコルに従って得られた酸無水物を開環させます。カラムクロマトグラフィーにより、得られた生成物を単離します。次に、生成物3 gと酸化カリウム1.75 gを、乾燥させたジエチルエーテル100 mLに溶解し、40～45 °Cで2時間還流してディックマン縮合を行います。続いて、溶媒の約75%を真空下で除去し、1 M塩酸100 mLを加えて生成物を沈殿させます。生成物をろ過し、真空下で乾燥させる。XGの合成を開始するには、indoc clic acid allyl ester 400 mg、TBAs 410 mg、およびalpha xto bromo galactose 500 mgを、chloro methane 10 mLに加える。その後、1 Mの炭酸カリウム水溶液 10 mLを反応系に加える。室温で約3時間攪拌し、石油エーテルと酢酸エチルの1:1溶液を用いて、薄層クロマトグラフィーでα-アセトブロモガラクトースの消費をモニターします。α-アセトブロモガラクトースが完全に消費された後、分液漏斗で溶液の有機相を単離します。次に、硫酸ナトリウムで有機相を乾燥させて残存水分を除去し、テキストプロトコルに従ってカラムクロマトグラフィーを用いて生成物を精製します。アロエステルを脱離させるために、600 mgのガラクトプリン酸物を15 mLの脱水テトラヒドロフランに溶解します。真空状態で溶媒を除去した後、生成物に酢酸銀 400 mg、炭酸カリウム 800 mg、および無水酢酸 10 mLを加え、反応液を約 95 °Cで 20 分間加熱します。反応液を室温まで冷却し、ジクロロメタン 50 mLで希釈します。この反応をワークアップするため、混合物を水で2回、次いで 10% 炭酸水素ナトリウム溶液で1回洗浄します。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後、溶液を濃縮します。カラムクロマトグラフィーを用いて、得られたアセチル化ガラクトプリン側鎖を精製します。次に、精製した物質396 mgを10 mLのメタノールに溶解します。スパチュラの先端に少量のナトリウムメチラートを加え、その後、反応液を一晩撹拌する。陽イオン交換樹脂を用いて反応液を中和し、次いで溶液を真空下で濃縮する。最後に、生成物を真空下で乾燥させ、合成ルートの妥当性を確認するためにxalを得る。まず、xalを数µLのジメチルスルホキシドに溶解します。次に、適切なバッファーを用いてxalの0.5 mMストック溶液を調製します。続いて、beta galactoを1 µL加え、混合物を600 rpsで振盪します。37 °Cで、鮮やかなインジゴ染料が形成されるまで反応を視覚的にモニタリングします。溶液中に青色の染料が形成されることは、doxylにおける酵素活性を明確に示しています。配糖体はグリコサート酵素活性のモニタリングに重要ですが、合成が困難です。ここで提示する合成アプローチにより、最終的なendo galacto puric側を66%の総合収率で得ることができます。これは、収率がわずか28%であった従来の手法から大幅に改善されたものです。得られたdoxyl glycosidesは、純粋または不純な酵素溶液の活性試験に使用できます。この例では、β-ガラクトシダーゼを含むウェルでのみインジゴ色が見られ、0.1 mMという少量のXGで生成されました。indoc細胞受容体が構成されれば、適切に実施することで、indoc細胞配糖体を生成するためのこの合成経路は2日以内に完了できます。このビデオを視聴することで、inial配糖体の合成と利用について十分に理解できるはずです。この合成経路では、構造が複雑であるにもかかわらず、これらの化合物を高収率で生成できます。

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化学

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