Name: 新生児マウスの脳室下帯へのプラスミドDNAのトランスポゾン媒介統合は、神経膠芽腫の新規モデルを生成する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学ぶ新生児マウスへのトランスポゾン媒介プラスミドDNA注入による神経膠芽腫誘導法。側脳室注射と発光イメージングで腫瘍進行をモニタリングし、ヒト疾患を再現した新規モデルを構築する技術です。

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プラスミドの寛大な贈り物と、この方法を習得するためのトレーニングを提供してくださったJohn Ohlfest博士とStacey Decker博士13に感謝します。パラフィン包埋切片のヘマトキシリン-エオシン染色手順の標準化にご協力いただいたMarta Dzaman氏に感謝いたします。また、この原稿を熟読し、役立つ提案を提供してくれたMolly Dahlgrenにも感謝します。この研究は、MGCとPRLへのNIH/NINDSの助成金、MCGとPRLへのLeah's Happy Hearts Foundationの助成金によってサポートされています。アレックスのレモネード財団若手研究者賞とCKへのセントボールドリック財団フェローシップ。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この記事では、細部SBを使用したGBMの新たなモデルを生成するための汎用性と再現性のある方法は、新生児マウスの脳室下帯を周囲の細胞に発癌性プラスミドDNAの仲介統合をtransposase-。我々は、新たな注目遺伝子を有するトランスポゾンプラスミドを作製するためのプロトコルを提示し、生きた動物における腫瘍の進行を監視する方法、およびこれらの腫瘍の組織病理学的および免疫組織化学的特徴を特徴付ける方法を示す図である。 私たちの研究室として、 （ 図3）など13を示しているが、このモデルは確実に（1）疑似柵状壊死、（2）血管増殖、（3）核の異型、（4）異常 ​​な有糸分裂を含む、ヒトGBMの顕著な特徴を有する腫瘍を（作成5）血管周囲と拡散侵入。新生児マウスの使用は、最小限の機器とそれとの比較的容易な技術的手順を提供し、物流の観点から最適であるdation /回復時間、特定の遺伝的変化を伴う腫瘍の大きなサンプルサイズの急速な世代を可能に。これらの腫瘍は、動物が誘発される遺伝的変化に依存して予測可能...

多形性膠芽腫（GBM）は、手術、放射線療法、および化学療法1で処理された15-21ヶ月の生存期間中央値で、成人における最も一般的な（60％）の原発性脳腫瘍である。 GBMのための新規治療法は不可欠である。実験的治療は十分にヒトの疾患の顕著な特徴を再現する動物モデルでのテストが必要。げっ歯類でGBMを誘導するための戦略は、神経膠腫細胞株2を用いた化学アルキル化剤誘発、生殖細胞または体細胞の遺伝的変化、または移植を含む。最も一般的に使用されるモデルは、脳内に、または皮下に同一の遺伝子型を有する動物における同系細胞を使用して、いずれかの同所、神経膠腫細胞株の注入を用いる。または異種細胞は、免疫に移植最も一般的ヒトGBM細胞株は、マウス3を損なわ。再現性の利便性、standa：異種移植片は、頭蓋内腫瘍の研究のための多くの利点を提供rdized成長率、死亡および腫瘍局在の時間。しかし、これらのモデルが原因注入し、正確に組織学的に再現する限られた能力のために使用される人工、侵襲的な外科的アプローチに限界がある人間のGBM（WHOグレードIV）の特性を備えています：擬似pallisading壊死、核atypias、びまん性浸潤、微小血管増殖とglomeruloid血管異常4-7の形成。ウイルスベクター8-12と、またはトランスポゾン媒介インテグレーション13のいずれかで、発癌性DNAでの体細胞のゲノムを変更することによってGBMの誘導は、より厳密にヒト疾患の病因を再現し、ヒトGBMの組織病 ​​理学的特徴を再現する。 歴史的には、CNSの腫瘍は生存14の予測因子となることが観察された起源の感知セルに基づいて分類されている。 GBMのは、プライマリとセカンダリに分類される。新たな証拠のTODAY主要神経膠芽15の非常に不均一な性質を指す。二次GBM（15％）、低悪性度星状細胞腫（WHOグレードI）およびanaplasic星状細胞腫（WHOグレードII）の悪性形質転換の結果は、疾患の初期発症、予後良好および遺伝子発現の「前神経」パターンに関連付けられている、原発性GBM（85％）のに対し、後期発症、予後不良とグリア（古典）、神経または間葉発現パターンを示している。遺伝子発現のこれらのパターンは、腫瘍の起源の実際のセルと相関するかどうかはまだ活発に研究されている。データを蓄積することのGBMに関連する遺伝子変異の組み合わせは生存のための予測であることを示しています。例えば、染色体1P / 19Qのヘテロ接合の消失（LOH）は、IDH1変異、PDGFRα増幅は、NFは、EGFRの過剰発現、Notchおよびソニックヘッジホッグ経路の活性化のに対し、二次性GBM、前神経発現パターンおよび良好な予後と関連している1およびPTEN損失およびp53の変異は、神経、古典的な、または間葉原発性GBMと悪い予後16,17と相関している。大規模な配列決定プロジェクトの出現とテストのために利用可能な多数の患者検体の蓄積は、GBMの病因および進行および治療法を具体的に合わせて調整することができる個別化医療の可能性に関与する遺伝子変異および経路に関して新しい情報を豊富にもたらし患者の遺伝的異常。最終的に、体系的な方法でこれらの突然変異および経路の予測値を評価するために、それぞれの場合において可能な治療を試験するために、予め決められた遺伝的変化でGBMの動物モデルを必要とする。ゲノムDNAのトランスポゾン仲介統合が実現可能なアプローチを提供しています。 眠れる森の美女トランスポゾンシステム、トランスポゾンのTc1が/ マリナークラスのメンバは、マルチステップproceで（構築）「覚醒」した休眠より10万年前に18,19となったサケトランスポザーゼ遺伝子、からサ ​​イト特異的変異のSS。本質的には、特定の配列（逆方向反復/ダイレクトリピート：IR / DR）に挟まれたDNAトランスポゾンは、眠れる森の美女トランスポザーゼの活動によって、「カット＆ペースト」の方法でゲノムに統合することができます。トランスポザーゼは、IRサイトの両端を認識しトランスポゾンを切除および塩基TとA、転置（ 図1a）の間にトランスポゾンの各末端に複製された塩基の間に別のDNA部位にランダムにそれを統合します。眠れる森の美女トランスポザーゼは、3つのドメイン、トランスポゾン結合ドメイン、核局在化配列および触媒ドメインから構成されている。四つトランスポザーゼ分子が一緒にトランスポゾンの両端をもたらし、転位を可能にするために必要とされるトランスポゼースのあまりに多くの分子が存在する場合、しかし、それらは二量体化を阻害するとtetramerizeでき転位反応20。効率的な転位反応は、トランスポゾンのトランスポザーゼの最適な比率を必要とする。トランスポザーゼをコードするDNAは、（シス）トランスポゾンと同じプラスミド上または（トランスで）別のプラスミド上に供給することができる。トランスポザーゼ及びトランスポゾンの間の最適な比率を確保するために、十分な活性を有するプロモーターは、（「シス」モデルの場合）トランスポザーゼの発現のために選択することができるか、注射液中のプラスミドの比は、のために（最適化することができる「トランス」モデル）。眠れる森の美女トランスポゾンシステムは、機能ゲノミクス、挿入突然変異、遺伝子導入および体細胞遺伝子治療の21のために成功裏に使用することができます。合成構築物は休眠サケバリアントから機能性分子に再設計され、眠れる森の美女トランスポザーゼは、ヒトまたは他の哺乳動物20内の他のトランスポゾンに結合しない。その発見以来、分子工学はenhancを持ってpT2をトランスポゾンで、その結果、IR配列及びトランスポゾンに隣接するTATAジヌクレオチドの追加の変化を通じてSBトランスポゾンシステムの転置有効性を編。これらのトランスポゾンは、IRサイトにSBの結合を最適化し、切除の有効性を増加している。 SBトランスポザーゼも大幅な改善を行った。本明細書に提示した実験で使用されるトランスポザーゼSB100X、哺乳動物細胞22の大規模遺伝子スクリーニングに続いてDNAシャッフリング戦略によって生成された機能亢進性トランスポザーゼである。 本報告書では、新生仔マウス23のサブ脳室帯の細胞へのプラスミドDNAの非ウイルス、トランスポゾン媒介統合を有するマウスにおいて本質的なGBMを誘導するために、迅速な汎用性と再現性のある方法を提示する。私たちは、眠れる森の美女のトランスポザーゼを用いてゲノム統合のための従順な新規遺伝子とトランスポゾンを作成し、プラスミドの取り込みを監視する方法を実証するための簡単​​な方法を提示し、生物発光を用いて、疾患の進行。我々はまた、このモデルで再現GBMの組織学的および免疫組織化学的な特徴を特徴づける。さらに、我々は、これらの腫瘍からの一次GBM細胞株を生成するために迅速な方法を提示する。腫瘍が動物に元の細胞から誘導されている眠れる森の美女モデルは、誘導及び腫瘍の進行中の候補GBM遺伝子の役割の機能的評価を可能にする。このシステムは、局所微小環境を変化させることができる侵襲性外科手術手順を必要とせず、免疫適格マウスにおける免疫療法を含めた新規GBM治療の試験のためにも適している。

<table><tbody><tr><td>ラットとマウスのアダプターを備えたStoeltingのラボスタンダード</td><td>Stoelting</td><td>51670</td><td>他の会社は同様のフレームを製造しており、小さなマウスアダプターを備えたもののいずれかが適しています&nbsp;</td></tr><tr><td>Quintessential Ligtaxic Injector (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Injectionsはそれなしで行うことができますが、&nbsp;&nbsp;&nbsp;自動インジェクターにより、再現性と利便性が向上します</td></tr><tr><td>10 &mu;l 700シリーズ手によって合うマイクロリットルのシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>モデル701</td><td>このシリンジモデルは解決の0.5から500のulから確実に供給する。他のsyrnges(例えば5 ul、モデル75)はまた30</td></tr><tr><td>ゲージの皮下注射針 (1.25"、15oベベル)&nbsp;</td><td>ハミルトン</td><td>S/O#197462</td><td>この針は、他の侵襲的な手順を必要とせずに、新生児マウスの皮膚と頭蓋骨を突き刺すのに理想的です。くすみがついてしまった(皮膚に入りにくい)場合は、交換が必要です。</td></tr><tr><td>in vivo-jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>201-10G</td><td>少量分注で -20 oC&nbsp;</td></tr><tr><td>D-ルシフェリン、カリウム塩</td><td>Goldbio.com</td><td>LuckK-1g</td><td>ホタルルシファーゼの他の供給源は</td></tr>、ちょうど適切な<tr><td>ヘマトキシリン溶液、ハリス修正</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>HHS128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT化合物</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>62550-01</td><td>凍結切片および免疫組織vhemistryのための脳の埋め込みのために</td></tr>高度な<tr><td>DMEM / F-12、グルタミンなし</td><td>生命技術</td><td>12634-010</td><td>ニューロスフィア</td></tr><tr><td>B-27&umlの培養のために。サプリメント(50倍)、無血清&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>17504-044</td><td>ニューロスフェア培養用無血清サプリメント</td></tr><tr><td>N2 サプリメント (100x)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 17502-048</td><td>ニューロスフィア培養用無血清サプリメント</td></tr><tr><td>Normocyn</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-1</td><td>ニューロスフェア培養用抗マイコプラズマ剤</td></tr><tr><td>組換えヒト EGF</td><td>PEPROTECH</td><td>AF-100-15</td><td>の文化のための成長因子サプリメント&nbsp;ニューロスフィア組</td></tr><tr><td>換えヒトFGF-基本</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td>の培養のための成長因子サプリメント&nbsp; ニューロスフィア<</td></tr><tr>td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase&nbsp;細胞剥離試薬&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3003001</td><td>ニューロスフェアの解離用</td></tr><tr><td>Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749510-0590</td><td>解剖したばかりの腫瘍の解離用</td></tr><tr><td>ファルコンセルストレーナー メッシュサイズ 70 um</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>解離したニューロスフェアの単一細胞懸濁液を生成するため</td></tr><tr><td>キシレン 組織学的グレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C8H10</td><td></td></tr><tr><td>プロトコル ハリス ヘマトキシリン 水銀遊離 (酸性化)</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>245-678</td><td></td></tr><tr><td>プロトコル Eosyn Y ソリューション (強化)</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>314-631</td><td></td></tr></tbody></table>

新生児マウスの脳室下帯へのプラスミドdnaのトランスポゾン媒介統合は、神経膠芽腫の新規モデルを生成する

Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

予後が悪い成人の最も一般的な原発性脳腫瘍であるヒト神経膠芽腫（GBM）の病因と進行に対する新しい遺伝子の寄与をテストすることが緊急に必要です。新たな治療法の可能性が急速に生まれており、ヒトの疾患の顕著な特徴を厳密に再現する実験モデルでの体系的な試験が必要です。ここでは、新生仔マウスの脳室内領域の細胞にプラスミドDNAをトランスポゾン媒介的に組み入れるGBMの新しいモデルを誘導する方法について詳しく説明します。Sleeping Beautyトランスポゾンシステムを使用してゲノム統合に適した新しいトランスポゾンをクローニングする簡単な方法を提示し、生物発光、組織学、免疫組織化学を使用してプラスミドの取り込みと疾患の進行を監視する方法を示します。また、新しい初代GBM細胞株を作成する方法についても説明します。理想的には、このレポートにより、脳腫瘍研究者の間で眠れる森の美女トランスポゾンシステムがさらに普及し、GBMの病因と進行を深く理解し、患者に効果的な治療法をタイムリーに設計およびテストできるようになります。

SB-誘発性神経膠芽の組織病 ​​理学的特徴を特徴づけるために、C57 / BL6新生児マウスは、発癌性DNAとトランスポゾンをコードするプラスミドと組み合わせてルシフェラーゼをコードするプラスミド（pT2を/ SB100xリュック）とP1で注入した、 すなわち 、NRAS（PT / CAGGS NRAS（ 図3d）との組み合わせで-NRASV12）およびSV40 LGT（PT / CMVSV40-LGT）（ 図3c）またはPDGFβと短いヘアピンp53およびGFPレポーターをコードするプラスミド（pT2shp53 / GFP4 /mPDGFβ）。動物は、注射（ 図2a）の後に、定期的にそれらを安楽死させたときに瀕死段階に達するまで毎日生物発光をモニターした。瀕死のステージは、動物が症候上映減損モビリティ、猫背の姿勢、だらしない毛皮、体重減少となった臨床病期として定義されている。時々、動物は円や突然のジャンプで歩いているような、発作または動きの異常パターンを開発。実験動物の終了時sが麻酔した。脳を灌流し、パラフィンに...

ここでは、新生児マウスの心室に注入されたトランスポゾンDNAを使用して、新規神経膠芽腫(GBM)を誘導、監視、分析するための効率的で汎用性の高いプロトコルについて説明します。プラスミドを取り込む脳室内領域の細胞は、ヒトGBMの組織病理学的特性を有する腫瘍を形質転換、増殖および生成する。

新生児マウスの脳室下帯へのプラスミドDNAのトランスポゾン媒介統合は、神経膠芽腫の新規モデルを生成する

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary ...

この手順の目的は、マウスにおいて特定の遺伝子変異を持つ膠芽腫の形成を誘導することにより、膠芽腫の新しいモデルを作成し、最終的に新しい治療アプローチを開発することです。これは、まず目的の特定の遺伝子をコードするトランスポゾンプラスミドを作成することで達成されます。次のステップでは、トランスフェクション試薬を用いてプラスミドを調製し、新生子マウスの側脳室に注入します。腫瘍進展における取り込みは、ルミネッセンスによってモニタリングします。腫瘍が十分に大きくなった時点で、動物を犠牲にして組織学的および免疫組織化学的な解析を行います。このようにして、野生型または標的遺伝学的背景において、特定の遺伝子変異を持つ新たな神経膠芽腫を誘導します。これらの腫瘍はin vivoで研究するか、あるいはin vitroで使用して、生化学的解析や化学療法剤を用いた細胞毒性試験に適した新しい細胞株を樹立させることができます。膠芽腫細胞株の正位注入などの他の方法に対する本手法の主な利点は、非常に特異的に選択された遺伝子改変を用いて、免疫能を有する個体内の内因性細胞を悪性転換させることで腫瘍を誘導する点にあります。このプロセスは、ヒト疾患の病因をより密接に再現し、ヒトGBMの顕著な組織病理学的特徴を再現します。この手法は、成人または小児の腫瘍において、古典的（classical）、前神経（proneural）、神経細胞（neural）といった異なるタイプの膠芽腫（glioblastoma multiforme）を誘発する原因となるドライバー変異は何かという、神経腫瘍学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。この技術の意義はGBMの治療にも及び、新しい化学療法剤、放射線療法、免疫療法、あるいはそれらの併用療法の効果を、このモデルを用いてin vivoまたはin vitroで比較的迅速に検証することが可能です。この手法を着想したのは、ミネソタ大学の同僚であるDr.Johnと議論した時でした。彼は、Sleeping Beautyトランスポゼースを介してオンコジーン（腫瘍抑制遺伝子の阻害剤）を宿主ゲノムDNAに組み込むことで、初期の脳腫瘍モデルを開発していました。私は、この手法が腫瘍の進行における新規変異の影響を研究し、脳がんの標的治療法の開発を促進するために非常に有用であると考えました。実験の3〜4週間前に、オス1匹とメス1匹をマウスの繁殖ケージに入れ、環境を豊かにして交配率を高めるために色付きのプラスチック製イグルーを設置します。妊娠が確認されたらオスをどけ、交配日から18日後にメスの分娩監視を開始します。分娩の時期に合わせて、代理母を確保しておきます。出生後1日目に、脳室内注入を行います。注入液の調製は、まず、最終濃度が0.5 µg/µLとなるように、プラスミド上のトランスポゼースを含む

transposon-mediated-integration-plasmid-dna-into-subventricular-zone

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このビデオでは、新生児マウスの心室にトランスポゾンDNAを注入して神経膠芽腫(GBM)を効率的に誘発する技術について説明しています。プラスミドを取り込む脳室下領域の細胞は、ヒトGBMの組織病理学的特徴を持つ腫瘍を形質転換、増殖、および生成します。...

SB媒介転位を用いた膠芽腫誘導:トランスポゾンを介したSBプラスミドの新生児マウス脳への統合を用いた新規マウスモデル作製技術

我々は、新生児の脳室下帯のエレクトロポレーションと呼ばれる低侵襲技術を実証した。テクニックは、新生児の仔の側脳室にプラスミドDNAを注入し、提供し、遺伝的に神経幹細胞を操作するために電流を印加することで構成されています...

新生児の脳室下帯のエレクトロ

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。...

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

我々は、腫瘍の成長の間の遊びで、通常の生物物理学的な制約を再現生体2光子顕微鏡用マウスにおける皮質同所神経膠芽腫モデルを確立している。腫瘍の上に頭蓋骨を交換慢性ガラス窓は、2光子顕微鏡による経時的な腫瘍進行のフォローアップを可能にします。...

同所神経膠芽腫モデルマウスは、脳実質細胞の物理的制約を維持し、生体内二光子顕微鏡に適し

この手順は、子宮内エレクトロポレーションによって、発生中のマウス前脳の介在ニューロンを標的にする方法を示しています。この技術は、皮質の表層に向けられた介在ニューロンサブタイプで選択的な遺伝子発現を達成するのに特に効率的でした。...

皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション

ここでは、新生児マウスの脳へのアデノ随伴ウイルスの脳室内注射による広範なニューロン伝達の技術を示しています。...

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

脳における遺伝子の細胞の自律的機能損失を誘導することによって学ぶことができるまたは細胞のまばらな人口の機能を得る。ここでは、関数の vivoの損失を引き起こす floxed の遺伝子を持つ皮質ニューロンの開発のまばらな人口に Cre...

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

レーザーマイクロディション(LMD)は、グリオーマの不均一性と侵入を媒介する経路を明らかにするために使用できる、敏感で再現性の高い技術です。ここでは、レーザーLMDを用いて、トランスクリプトーム解析を用いて、グリオーマ組織から離散領域を分離するための最適化されたプロトコルについて述べている。...

腫瘍性異種性、オンコストリーム、および浸潤の空間・分子特性解析のための神経膠腫部分領域のレーザー捕捉微小切除

免疫療法試験には、一般的な患者の変異によって駆動される免疫能のある自家腫瘍モデルを前臨床試験に利用することが不可欠です。従ってこのプロトコルは共通の忍耐強い突然変異を表すプラスミッドDNAのelectroporationベースの配達を使用して脳腫瘍マウス モデルを発生させる方法を記述し、正確で、再生可能で、一貫したマウス モデルを提供する。...

患者の突然変異シグネチャーを表すプラスミドDNAのエレクトロポレーションベースの送達を使用した in vivo での脳腫瘍のモデリング

敗血症は、細菌感染に起因する全身性炎症反応症候群を指し、盲腸結紮穿刺（CLP）と呼ばれる手術法によってシミュレートすることができます。ここでは、治療薬のために薬草をスクリーニングするためのCLP-誘導動物モデルを使用する方法を説明します。...

新しいハーブ治療法を評価するために敗血症の動物モデルの使用

学ぶ新生児マウスへのトランスポゾン媒介プラスミドDNA注入による神経膠芽腫誘導法。側脳室注射と発光イメージングで腫瘍進行をモニタリングし、ヒト疾患を再現した新規モデルを構築する技術です。

新生児マウスの脳室下帯へのプラスミドDNAのトランスポゾン媒介統合は、神経膠芽腫の新規モデルを生成する

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