新生児マウスの脳室下帯へのプラスミドDNAのトランスポゾン媒介統合は、神経膠芽腫の新規モデルを生成する

この手順の目標は、神経膠芽腫の新規モデルを作成し、最終的にはマウスに特定の遺伝子変異を持つ神経膠芽腫の形成を誘導することにより、新しい治療アプローチを開発することです。これは、まず、目的の特定の遺伝子をコードするトランスポゾンプラスミドを作成することによって達成されます。次のステップは、トランスフェクション試薬でプラスミドを調製し、新生児マウスの側脳室に注入することです。

その後、腫瘍の進行の取り込みは発光によって監視されます。動物がより豊富になると、組織学的および免疫組織化学的分析のために犠牲になります。したがって、特定の遺伝的変化を伴う新しい神経膠芽腫は、野生型または標的遺伝的背景で誘発されます。

これらの腫瘍は、in vivoで研究することも、in vitroで使用して、化学療法剤を使用した生化学的分析や細胞毒性実験に適した新しい細胞株を作製することもできます。この技術が他の方法、例えば膠芽腫細胞株の同所注射よりも優れている主な利点は、非常に特異的に選択された遺伝子改変を使用して、内因性細胞の1つの免疫適格動物への悪性形質転換によって腫瘍が誘発されることです。このプロセスは、ヒト疾患の病因をより密接に再現し、ヒトGBMの顕著な組織病理学的特徴を再現します。

この方法は、成人または小児腫瘍におけるさまざまな種類の多形性、古典的、神経前、神経性カイの誘発に関与するドライバー変異は何かなど、神経腫瘍学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、新しい化学療法以来、GPMの治療にまで及びます。放射線免疫療法またはそれらの組み合わせは、このモデルを使用して、in vivoまたはin vitroで比較的迅速に試験することができる。

私がこの方法を思いついたのは、同僚のミネソタ大学のジョン博士と話し合ったときで、彼は宿主ゲノムDNAへの腫瘍抑制遺伝子の阻害剤である「眠れる森の美女」の転移を介した統合を使用して、初期の脳腫瘍モデルを開発した人でした。この方法論は、腫瘍の進行における新しい突然変異の影響を研究し、脳腫瘍の標的療法の開発を支援するために非常に強力であると考えました 実験の3〜4週間前に、オスとメス1匹のマウス繁殖ケージを設置し、色付きのプラスチックイグルーを含めて環境を豊かにし、交配の可能性を高めます。妊娠が確認されたらオスを連れ去り、交尾日から18日後にメスの出産監視を開始します。

代理母が配達の頃に利用可能であることを確認してください。出生後最初の日に、脳室内注射を行います。まず、Aliによって注射液を調製し、プラスミド上の転位を含むDNA混合物の20マイクロリットルを、最終濃度が1マイクロリットル当たり0.5マイクログラムのDNA

次に、20マイクロリットルのPEI溶液をDNA溶液に添加し、室温で20分から1時間インキュベートした後、混合物を氷上に保存する必要があります。注射針には、12.5度に面取りされた30ゲージの皮下注射針に10マイクロリットルの注射器を取り付けます。.次に、シリンジを自動注入でマイクロポンプに取り付けます。

10マイクロリットルの水でセットアップをテストし、シリンジを空にしてください。次に、ドライアイスとアルコールのスラリーで新生児定位固定装置期を冷却します。摂氏2度から8度に冷却したら、注射を続行します。

まず、子犬を氷の上に2分間置いて麻酔をかけます。子犬が氷の上にいる間に、注射器に注射液をロードします。麻酔をかけたら、子犬をフレームに移し、ガーゼで覆われた耳のバーの間に頭を固定します。

頭蓋骨の背側が水平で、フレーム表面と平行であることを確認してください。また、頭蓋縫合糸ははっきりと見える必要があります。子犬の頭が十分にしっかりと固定されていないと、注射中に動きます。

一方、フレームのイヤーバーの間にしっかりと押し込まれすぎると、ラムダが見えず、頭内の圧力で注入された溶液が漏れます 子犬をフレームにしっかりとつかんだ状態で、70%エタノールで頭を拭き取り、針を下げてラムダに接触するように位置を調整します。次に針を立てて、横に0.8ミリ、タリヤ1.5ミリ動かします。次に、皮膚がわずかにくぼむまで再度下げます。

この位置の座標を記録します。次に、針を皮膚と頭蓋骨を通って1.5ミリメートル下げ、そこの側脳室の皮質に下げます。0.75マイクロリットルを90秒かけて注入し、待っている間に溶液が分散するまで1分間待ちます。

次に注射する子犬は麻酔をかけることができます。ウェイトがかかった後、針をゆっくりと上げてから、子犬を暖房ランプの下の回復場所に移します。麻酔から温めまでの時間は10分未満でなければなりません。

早ければ早いほど、その呼吸をより適切に監視し、必要に応じて、手足を優しくこすって呼吸を刺激します。子犬が温められ、バラ色で安定した息をしているときは、母親に戻します。これには通常、注射から5〜7分かかります。

数匹の子犬を注射した場合は、母親に戻す前にすべての子犬を回収する必要があります。30分経ってもすべての子犬の準備ができていない場合は、その半分を彼女に戻し、手順の最後に残りを戻して、ダムを監視します。子犬を返した後。

彼女が子犬に反応しない場合は、代理母をケージに加えます。注射の24〜72時間後に、プラスミドの取り込みを監視し、すべての子犬をウェルごとに1匹の6つのウェル組織培養皿に移します。次に、1ミリリットルの注射器に生理食塩水またはPBS中のルシファー1ミリリットルあたり30ミリグラムをロードし、30ゲージの皮下注射針を取り付けます。

子犬を傷つけないように、各子犬の肩甲骨の間に30マイクロリットルの溶液を皮下注射し、皮膚の小さなひだの下に溶液を注入します。直ちに子犬をin vivo生物発光イメージングシステムに移します。1分間隔で4つの連続画像を取得するシーケンスを、自動露出、大きなベニング、絞り1で取得するように設定します。あとで。

約17日後、動物は生物発光と組織学によって検出可能な巨視的腫瘍を形成し始める可能性があります。また、腫瘍のモニタリングに最大6週間かかる場合があります。26ゲージの針で100マイクロリットルのルシフェリアン溶液を腹腔内に注入します。

3分後、ISOフッ素酸素麻酔室で動物を麻酔し、ISOフッ素を分散させるためのコーンが取り付けられたイメージングチャンバーに動物を置きます。自動露光時間、中程度のビニング、1つの開放絞りFストップで、2分間隔で一連の6枚の画像を取得します。関心領域は通常、頭の上の楕円形であり、SB誘発性膠芽腫の組織病理学的特徴を特徴付けるために同じ設定を使用して各動物の発光強度を測定しました。

C 57 black 6 新生児マウスを、プラスミドおよびコーティングルシフェラーゼを NRA S および SV 40 ラージ T プラスミド Inod トランスポゾンと組み合わせた P one に注射しました。あるいは、短いヘアピンP53をPDGFベータでコードするプラスミド、およびGFPレポーターをNRASと組み合わせて注入した。偽性パリス壊死は、血管周囲および脳内へのびまん性と同様に明らかであった。

実質膠芽腫も生物発光でモニターした。動物は通常、腫瘍の負荷に屈します。発光が10の強度に達したとき、7番目から10番目から9番目のキャリブレーション単位。

動物の生存期間の中央値は、新生児の脳に注入された発がん性トランスポゾンの組み合わせに予想通り依存していました。最も侵攻性の高い腫瘍はNRSで誘発され、SV 40大きなT抗原de novo腫瘍は特徴的な分子の発現によって特徴付けられました。SHP 53およびnrasで誘導されたGFPを発現するように作られた新生腫瘍は、神経幹細胞マーカーnestonを発現し、一部はグリオ線維酸性タンパク質も発現した。

56日後、多数のGFAP陽性星状細胞に囲まれた腫瘍が見つかりました。これらの腫瘍細胞はneinを発現したが、GFAPは発現しなかった。このビデオを見た後、神経膠芽腫の形成を誘発する方法、新生児マウスへの脳室内注射による特定の遺伝子変異の保持方法、および生物発光による疾患の進行のモニタリング方法についてよく理解できるはずです。

この記事では、目的の遺伝子をコードする新しいトランスプロプラスミドを簡単にクローニングする方法、および腫瘍をモニタリングし、組織学と免疫組織化学で分析する方法について詳しく説明します。さらに、遺伝子操作腫瘍を持つ動物から新しい膠芽腫細胞株を生成する方法についての詳細な方法を見つけることができます。この記事が、この壊滅的なヒトの病気に対する新しい治療法の発見を加速するのに役立つことを願っています。