Name: 線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価線虫（Caenorhabditis elegans） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学ぶ線虫Caenorhabditis elegansを用いた生殖化学毒性評価法。GFP蛍光レポーターで胚の染色体異常を可視化し、高スループットで化学物質の毒性を検出する手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、この作業を可能にしてくれた以下の資金源、NIH ES020353、およびColgate-Palmolive Alternative Research Grant賞に感謝したいと思います。

摂食細菌の調製注：このセクションでは、給紙細菌（ 大腸菌株 OP50）の調製を記載する。 <ol><li> Eの単一コロニーを分離無菌的にLB培地（LB）寒天プレートとから大腸菌株 OP50は、オートクレーブしたLBブロス300mlに接種する。 </li><li>飽和状態に達するまでに接種培養は、200rpmで、37℃でシェーカーで一晩増殖させる。 </li><li> 6無菌、予め秤量した50ミリリットルコニカルチューブにOP50を転送します。 6000 RPM（5000 XG）で5分間遠心分離することによって細菌をペレット化。 </li><li>上清を捨て、滅菌したM9 50mlで細菌を洗う。二回繰り返します。 </li><li>第二回目の洗浄後何M9がチューブ内に残っていないことを確認して、残りのM9を削除します。 </li><li>細菌ペレットを含むチューブを計量することによってペレットの重量を測定し、50ミリリットルコニカルチューブの重量を差し引く。 </li><li>ペレットIを再懸濁nはM9に100mg / mlの濃度で。 </li><li>それはワーム培養に使用されるまで4℃でOP50ソリューションを保管してください。 </li></ol>線虫成長培地（NGM）ペトリ皿の調製注：このセクションでは、C.プレートであるNGMペトリ皿、の調製を記載elegansのワームは、日常的に研究室で維持されている。 <ol><li> NGM寒天培地をオートクレーブ。 </li><li>滅菌手順を使用して、蠕動ポンプを使用して6センチメートルペトリプレートにNGM寒天溶液17mlを分注する。 注：プレート内の寒天の一定量を別のプレートから切り替えるときに顕微鏡を再集束の必要性を低減。 </li><li>寒天が固化してみましょうと余分な水分を蒸発できるようにするため、使用前に2〜3日間室温でプレートにしておきます。 </li><li>無菌技術を用いたNGMプレートをシード。 OP50液体培養の1-2滴を適用し、ガラス棒を用いて拡散。ことを確認していないすべての道のプレートの端に細菌の芝生を広げます。 </li><li> OP50の芝生がワームを成長させるのプレートを使用する前に、室温で1〜2日間増殖することを許可する。 </li></ol>同期ワーム人口の調製注：Cのライフサイクル虫は胚段階、4幼虫期（L1-L4）と成人期から構成されている。このセクションでは、ワームの年齢同期人口の製造を記載し​​ている。漂白処理後の線虫と接触する全ての材料は、無菌でなければならない。 <ol><li> 1日目- 、妊娠ワーム人口の調製 <ol><li>ワームの人口の大半が飢餓のL1幼虫で構成されているNGMプレートを使用してください。 </li><li>滅菌ワームとのL1幼虫が選ぶ収集し、新鮮に6cm NGMプレートにそれらを転送するには、OP50を播種。ワームの大半は妊娠大人になるまで20℃で約65時間インキュベートする。へプレート過密を回避し、ワームは細菌を破壊することなく成長させる、各新鮮なNGMプレートにL1幼虫の1つまたは2つ以上のクラスタを転送しないでください。 </li></ol></li><li> 4日目-シンクロナイズドL1幼虫人口の確立 <ol><li> M9 1-2 mlのそれらを洗浄することにより、NGMプレートから妊娠ワームを収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。 </li><li>妊娠ワームは約5〜10分間15ミリリットルコニカルチューブの底に沈降してみましょう。ワームペレットを乱すことなく、上清を取り除きます。 </li><li> 2-4マイクロ遠心チューブにワームペレットを移し、漂白剤/ NaOH溶液1ミリリットルを追加します。 RTで2〜3分間インキュベートする。死んでいるすべてのワームを確認するために、実体顕微鏡下で反応の進行状況を監視します。胚が死ぬことができるようになりましたが5分を漂白しないでください。 </li><li> 3000 RPM（900 XG）で1分間遠心分離することにより、ワームを収集します。上清を除去し、滅菌M9の1ミリリットルを追加反応を中和する。 </li><li> 3000 RPM（900 XG）で1分間遠心分離することにより、二回のワームを洗ってください。 </li><li>上清を除去し、最大で100〜200μlにM9を追加。 </li><li>ガラスパスツールピペットを使用すると、NGMプレートをクリアして、胚が孵化することを可能にするために20℃で少なくとも24時間のためにそれらをインキュベートするワーム/ M9ミックスのドロップを追加。 注：食べ物がないと幼虫の成長がL1段階で停止されます。 </li></ol></li><li> 5日目-シンクロナイズドL4幼虫人口の確立 <ol><li> M9 1-2 mlのプレートを洗浄することにより明確なNGMプレートからのL1幼虫を収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。 </li><li>約5分間の15ミリリットルコニカルチューブの底に死んだ成虫の堆積物をしましょう​​。 </li><li>新しい円錐形​​の15ミリリットルチューブ内のL1虫である上清を、収集し、2600 RPM（1,000 XG）で2分間遠心分離することによりワームを沈殿させる。 </li><li>上清ルを削除約500μlのAVING。 </li><li>実体顕微鏡を使用してドロップ10μlのワームの数をカウントすることによりM9溶液中のワームの濃度を決定する。少なくとも5滴を数える。 </li><li> 20-25ワーム/μlにワームの濃度を調整し、NGMプレートにワーム/ M9ミックス50μlのを追加OP50を播種。 </li><li>彼らはL4段階に到達するまでに成長するL1同期化された人口を可能にするために（週末を通してインキュベーションのために）15℃で65時間インキュベートする。 </li></ol></li></ol> 96ウェルプレート中で化学物質へのワームの4暴露注：このセクションでは、Pxol1の使用が記載されている:: Cを含むGFP転写レポーターエレガンス株は、異数性の誘導のためにスクリーニングする。 <ol><li> M9 1-2 mlのプレートを洗浄することにより明確なNGMプレートからL4幼虫を収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。 </li><li> L4ワームの底に沈降してみましょう約5〜10分間15ミリリットルコニカルチューブ。ワームペレットを乱すことなく、上清を取り除きます。 </li><li> M9 3〜5 mlを加え実体顕微鏡を用いて10μlの滴でワームの数をカウントすることによりM9溶液中のワームの濃度を決定する。各サンプルについて少なくとも5滴を数える。 </li><li> M9 1000ワーム/ mlの濃度でワームを再懸濁する。 </li><li> M9でセクション1の10倍からOP50細菌を希釈する。より低い温度では、ワームの開発に影響を与えるために再懸濁させ、細菌が室温に達することを確認してください。 </li><li>マルチチャンネルピ ​​ペットを用いて、第一（ステップ8.8）ワーム/ M9ミックス100μlのを追加し、2ミリリットル深い丸底96ウェルプレートの各ウェルに（ ステップ4.5から）で希釈OP50細菌の400μlを添加する。最後に、各ウェルを500μlの100ワームを持つことになります。 </li><li>提案され、最終的なconcentrを達成するために、被験化学物質または所望のウェルに適切な制御のどちらかの0.5μLを追加します。100μMのationが、濃度は一般的にCの化学画面で使用虫 12。 0.1％の最終濃度でエタノールまたはDMSO溶媒対照を公開します。 注：我々は、陽性対照としてノコダゾール（100μM）の使用をお勧めします。 </li><li>接着フィルムを使用してプレートをシール。ウェル間のクロスコンタミネーションを防ぐためにウェルプレートをシールしてください。 </li><li>アルミホイルでプレートを包みます。 </li><li>時間の適切な長さのために適切な温度（24または65時間）のシェーカー（170〜180 RPM）にプレートを転送します。部屋の温度は、ワームの成長に影響を与えます。 20℃前後の温度を維持する。 </li></ol> 384ウェルプレート中で、妊娠ワームの5.画像取得注：このセクションでは、大人の雌雄同体の子宮内の胚におけるGFPの発現を可視化するために、画像さらさPxol1 :: GFPワームに高いコンテンツ顕微鏡の使用が記載されている。のためにスクリーニングされる各384ウェルプレートに、4×96ウェルプレートからワームを使用する。 <ol><li>シェーカー中の化学暴露後に、10〜15分間、96ウェルプレートの残りは成虫がプレートの底に沈降することを可能にすることができます。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて、プレートの底にワームを邪魔しないように非常に気をつけながら、M9の350μlのを削除します。 </li><li> M9の1ミリリットルを繰り返しステップ5.1でワームを洗ってください。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて、プレートの底にワームを乱さないVEYように注意しながら、M9の1ミリリットルを削除します。 </li><li>マルチチャンネルピペットを使用して、残りのM9にワームを再懸濁し、96ウェルプレートからワーム/ M9ミックス100μlのを収集し、黒壁/透明底384ウェルプレートのウェルにロードします。 384ウェルプレートの全てのウェルがロードされるまで、4×96ウェルプレートからワームを使用してプロセスを繰り返す。 注：すべてのウェルに増加させるために、同じ体積を有することが重要である画像取得プロセス中にオートフォーカスの効率と速度。各ウェルを80から100のワームとの間で含まれている必要があります。 </li><li>各ウェルにレバミゾール（100μM）の1μl加え、ワームは、約30分間インキュベートしましょう​​。 NOTE：レバミゾールアセチルコリン受容体アゴニストとして作用し、ワームを固定する。 </li><li>自動化されたイメージングを提供することが可能な広視野高含量顕微鏡にプレートに移す。 </li><li>画像取得のために、製造業者のガイドラインに従って高含量画像収集および解析ソフトウェアを使用します。ウェルあたり1画像を取得する4X対物レンズを選択する。 </li><li>画像取得を開始する前に、xは2160 2160への曝露と画像解像度の45ミリ秒にGFPの撮像パラメータを調整する。 </li><li>ウェル中のワームの総数で割ったGFP陽性虫の数などのデータを収集し、後者の指標は、ウェル間の比較的一貫している。 </li></ol>

<ol><li>Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T">http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T</a> (2009).</li>
<li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trisomy+in+humans%3A+incidence%2C+origin+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Trisomy in humans: incidence, origin and etiology.</a> Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).</li>
<li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths%3A+final+data+for+2006%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Vital+Stat+Rep%22%5BJournal%5D)">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li>
<li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+mammals%3A+recombination%2C+non-disjunction+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li>
<li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li>
<li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li>
<li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxicity+Testing+in+the+21st+Century%3A+A+Vision+and+a+Strategy%22">Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy</a>. , The National Academies Press. (2007).</li>
<li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで説明する方法は、生殖系列の毒物を同定するための最初の大規模な戦略を構成する。それは忠実に生殖細胞機能障害のためのプロキシとして使用されている初期胚で異数性の誘導を報告したGFPトランスジェニックPxol-1 :: GFP含む株を使用する必要があります。この方法は、Cの慎重な同期を伴う虫ワームの人口と自動化ハイコンテンツ顕微鏡によってGFP陽性ワームの撮影に続いて、96ウェルフォーマットでの化学物質へのワーム&quot;暴露。 このプロトコルのいくつかのステップは、結果の一貫性に重要である。適切に露光に使用されるL4幼虫を上演したの数を最大としてまず、ワーム集団はに非常に同期している必要があります。このため、ここで説明する方法論は、L1飢餓によるワームの人口の漂白による最初と、2つの同期ステップを含む。第二の重要なパラこの方法のメーターは露出の長さです。ワームは、日常的に24時間または65時間のどちらかのために露出されている。減数分裂のようにCの継続的なプロセスである虫は 、これら2つの露...

米国では商業用に登録さ約87000薬品、これらは潜在的な健康への影響1のためにテストされたのまだごく少数があります。テストされたもののうち、一部のみ、特に女性の生殖細胞の発生および分化の間、哺乳動物における早期の生殖イベントの変更を決定する際の困難さに一部起因生殖健康への影響について評価された。確かに、最初の減数分裂事象は、雌の哺乳類における胚発生の初期段階で行われ、スクリーニング目的に適した番号にアクセスして収集することは困難である。 生殖細胞は、世代間の重要なリンクを提供し、その適切な機能は、細胞の染色体分裂の複雑なプログラム減数分裂と呼ばれるの正確な実行に依存している。減数分裂プロセスの調節不全が減少生殖能力との産生をもたらす可能性染色体の異常な数の配偶子および胚は、条件が異数性と呼ばれる。減数分裂における染色体の分離エラーが人間の健康に非常に関連しています。染色体異常は1〜150で出生の頻度、21トリソミー、18と13だけでなく、最も一般的なタイプ2,3であるXとY染色体のエラーで、共通している。さらに、染色体の起源のものを含め先天性奇形は、環境の影響は、染色体分離や行動に影響を与えることができるという考えは5新しいものではないが、それでも十分に理解されていない米国4で乳児死亡の主要な原因である。それは人間の生殖能力、初期の開発および全体的な生殖に関する健康に干渉している私たちの環境に導入された化学物質のどの調査することが重要である。 哺乳動物モデルのこれらの制限に照らして、我々は、回虫生殖毒性を試験するためのハイスループットスクリーニングアッセイを開発した&lt;EM&gt; C。エレガンス。我々は、その小さなサイズ、低コスト、短い再生サイクル、生殖細胞の割合が高いと操作6の容易として一般的に使用される遺伝モデルシステムによって提供されるいくつかの重要な機能を動員している。ワームは、96ウェルプレートに、または大量の液体培養で増殖することができ、それらの透明性を直接蛍光レポーターを検出するためにプレート上に結像することができる。以下に記載のアッセイは、これらの特性を利用して、蛍光レポーターPxol-1を含むウォーム株を活用:: GFPの胚の異数性の生殖細胞を破砕した誘導を検出すること。 このレポーター株の使用は、主に雌雄同体のワームの人口の男性の一般的まれな出来事に基づいています。これらの男性（&lt;0.2％）が自然にX染色体7の分離の誤差に由来する。しかし、生殖細胞系列の中断などの頻繁に常染色体の分離におけるエラーにつながるそしてheterochromosomesのではなく、男性の表現型（Xの分配異常）ならびに胚性致死（常染色体の分配異常）の高められた発生率との両方を相関させる。胚の致死性の問題を回避しながら、容易に雄の誘導を検出するために、雄特異的プロモーター（XOL-1）は、依然としてワームの子宮内に含まれる初期胚におけるGFPの発現を駆動するために使用される。このように、GFPを発現する胚の外観は、異数性胚の存在のためにプロキシとして使用される。この方法は、以前に生殖細胞維持および分裂8,9に関与する遺伝子を同定するために使用されている。化学物質のスクリーニングに適合し、この菌株は、ハイスループットスクリーニングに媒体中で使用される。重要なことは、株は忠実に化学物質のaneugenicityを報告し、そのための哺乳動物の生殖エンドポイント10に関連している。ここに記載のアッセイは、見て、製薬および化学産業の設定で毒物学者に特に有用であろう急速生殖エンドポイントに向かっての化学物質の毒性を評価した。さらに、このアッセイは、完全に21世紀のレポート11に毒性で強調表示政府の優先事項と整合する。

<table><tbody><tr><td>60 mm 通気孔付き、シャープエッジ ペトリ皿</td><td>Tritech</td><td>T3315</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>Apex</td><td>20-274</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 96 ウェル クリア ラウンド ボトム 2 ml ポリプロピレン ディープ ウェル プレート</td><td>コーニング</td><td>P-DW-20-C-S</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>Apex</td><td>20-261</td><td></td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>クロロックス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>VWR</td><td>AA12316-A1</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>ICN10138225</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>IC19018680</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td><a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc" target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>エタノール 200 プルーフ</td><td>VWR</td><td>EM-4455S</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384 ウェルプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1937-32EA</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS System</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩酸レバミゾール</td><td>Fluka</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム無水物(MgSO4)</td><td>VWR</td><td>97061-438</td><td></td></tr><tr><td>MetaXpressハイコンテント画像取得&解析ソフト</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性(KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>生物培養用レーヨンフィルム</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性 (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ 745</td><td>この顕微鏡は、3.35倍から300倍までの合計倍率を持っています。同様の特性を持つ顕微鏡であれば、どれでも機能します。</td></tr><tr><td>TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP レポーター株</td><td>Caenorhabditis 遺伝学センター</td><td></td><td><a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc" target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>酵母抽出</td><td>物 ベクトン・ディキンソン</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価<em&gt;線虫（caenorhabditis elegans）</em

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

我々の環境中に存在する化学物質の何千もの生殖毒性を識別することは環境衛生の分野で最も食欲をそそる課題の一つとなっている。これは、（1）正確に生殖過程のキーの機能を再現し、（2）脊椎動物の多数を必要とせず、ハイスループット様式に、中で行うことができ、モデル系の不足に一部起因する。 ここでは、線虫C.でのアッセイを説明異数性胚の誘導を監視することにより、生殖細胞系の毒物の迅速な同定を可能にする虫 。 GFPレポーターラインを利用することにより、生殖細胞の破壊に起因する染色体分離におけるエラーは、容易に自動化蛍光顕微鏡により可視化し、定量化される。したがって、その毒性のための化合物の特定のセットのスクリーニングは、数日のうちに96の384ウェルプレート形式で実施することができる。正hの二次分析その染色体異常が減数分裂の破壊または初期胚染色体分配誤差に由来するかどうかを決定するために行うことができる。要するに、このアッセイは、化学物質曝露後の生殖細胞系の機能障害を迅速に評価するための迅速な初回通過戦略を表す。

このような微小管毒ノコダゾールなどの化学剤に対するPxol-1 :: GFPレポーター株の曝露（ 図1）は、DMSO対照と比較して露出した成体雌雄同体の子宮におけるGFP発現胚の高い割合の誘導を導く。 GFP陽性胚は、他の胚だけでなく、動物の腸内で観察された自家蛍光で観察弱いバックグラウンド蛍光よりも有意に明るい。露出されたワームは、直接384ウェルプレート上に結像された少なくとも1つのGFP陽性胚を含む虫の数は、各ウェルについてカウントし、そのウェル内のワームの総数によって正規化される。化学画面から正のヒットは、DMSO 10よりも高い周波数1.7倍でワーム集団におけるGFP陽性胚の割合を誘発した化合物を意味する。しきい値の最適化、高含量画像解析（ 材料ファイルを参照してください）に続いて、自動化されたカルクことができます正のオブジェクトの数のulation（ すなわち、胚）ウェル内のワームの総数で割って、アッセイの大規模な適応のための最適な方法である。 <table border="0" cellpa...

生殖細胞毒性を評価するために使用された線虫Caenorhabditis elegansにおけるハイスループット化学アッセイの詳細な手順を説明します。このアッセイでは、異数性胚に特異的な蛍光レポーターを使用して、化学物質曝露後の生殖細胞機能の破壊をモニターします。

線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

本手順の全体的な目的は、線虫C. elegansを用いて生殖細胞の化学物質毒性を包括的に評価することです。これはまず、C. elegans PXOL1 GFP株の混合ステージの個体群に希釈した漂白剤溶液を加えることで、線虫を同期させることにより達成されます。このステップにより、卵殻によって漂白剤から保護された大量の胚が得られます。第2ステップは、胚を餌のない液体中で孵化させ、同期化したL1幼虫集団を作製することです。次に、線虫を第4幼虫期（L4）まで成長させ、その時点で目的の化学物質を含む液体中に65時間曝露させます。最終ステップは、線虫の子宮内にある胚におけるGFPレポーターの発現を、蛍光顕微鏡を用いて視覚化することです。最終的に、DMSOコントロールと比較したGFP陽性胚の割合が、テストした化合物の抗原性を反映します。Rodinモデルや細胞培養アッセイなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、個体レベルの動物モデルで化学物質の遺伝性と生殖細胞毒性を評価できると同時に、ハイスループットなアッセイを実施できることです。本日は、博士研究員であるDaniella Perotti博士が担当します。本手順で使用するグラフィカルワームは、付属のプロトコル本文に記載されている方法で事前に調製したものである。線虫成長培地（NGMプレート）からGRワームを1〜2 mLのM9で洗浄して回収し、15 mLコニカルチューブに移す。GRワームが15 mLコニカルチューブの底に沈殿するまで、約5〜10分間放置する。次に、ワームのペレットを乱さないように上清を除去する。虫体のペレットを2〜4本のマイクロ遠心チューブに分注し、各チューブに1 mLの希釈漂白剤溶液を加えます。室温で2〜3分間インキュベートします。実体顕微鏡下で反応の経過を観察し、すべての虫体が死滅したことを確認してください。胚が死滅する可能性があるため、漂白時間は5分を超えないようにしてください。3000 RPMで1分間遠心分離し、線虫を回収します。上清を除去し、反応を中和させるために1 mLの滅菌M9バッファーを加えます。漂白処理後、線虫に接触するすべての材料が滅菌されていることを確認してください。M9培地で線虫を2回洗浄します。上清を除去し、100～200 µLのM9バッファーを加えます。ガラスパステールピペットを使用して、線虫のM9混合液を1滴、餌のないNGMプレートに滴下し、20 °Cで少なくとも24時間インキュベートして胚を孵化させます。これにより、幼虫の成長はL1期で停止し、2段階の同期が行われます。曝露に使用するL4幼虫の数を最大化するためには、高度に同調した웜集団を得ることが極めて重要であるため、漂白およびL1飢餓法を用います。同調させたL1幼虫集団を確立した1日後、透明なNGMプレートからL1幼虫を回収します。プレートを1〜2 mLのM9で洗浄し、L1幼虫を15 mLコニカルチューブに移します。死滅した成虫を15 mLコニカルチューブの底に約5分間沈殿させます。L1幼虫を含む上澄み液を回収し、新しい15 mLコニカルチューブに移します。2,600 RPMで2分間遠心分離し、虫体を沈殿させます。上清を除去し、約 500 µL を残します。10 µL の液滴に含まれる個体数を数えることで、M9 溶液中の線虫の濃度を決定します。実体顕微鏡を用いて、少なくとも 5 回の液滴でカウントを行ってください。線虫の濃度をM9バッファー中で1µLあたり20～25匹に調整し、50µLの線虫M9混合液をNGMプレートに添加します。餌となる細菌であるOP50を播種し、15°Cで65時間培養して、L1同期個体群がL4段階に達するまで成長させます。このスクリーンでは、生殖細胞系の破壊および胚の異数性の誘導を検出するために、蛍光転写レポーターを含むCL対照株を利用します。透明なNGMプレートから、1〜2 mLのM9でプレートを洗浄してL4幼虫を回収し、15 mLコニカルチューブに移します。L4ワームが15 mLコニカルチューブの底に沈殿するまで、約5〜10分間静置します。その後、ワームペレットを乱さないように上清を除去します。M9溶液を3〜5 mL加え、10 µLのドロップ内の個体数を数えることで、M9溶液中の線虫濃度を決定します。実体顕微鏡を用い、各サンプルについて少なくとも5滴のドロップをカウントしてください。その後、M9溶液を用いて線虫を1 worm/mLの濃度に再懸濁します。あらかじめ準備したOP 50細菌をM9で10倍に希釈します。低温では線虫の発育に影響が出るため、再懸濁した細菌が室温に達していることを確認してください。まず、マルチチャンネルピペットを用いて、2 mL深型ラウンドボトム96ウェルプレートの各ウェルに線虫用M9ミックスを100 µLずつ加えます。次に、最後に希釈したOP 50細菌を各ウェルに400 µLずつ加えます。各ウェルに500 µLの液量で100匹の虫を入れます。最終濃度が100 µMとなるように、目的のウェルに被験化学物質を0.5 µL添加します。これはCL elganにおける化学スクリーニングで一般的に使用される濃度です。陽性対照として、最終濃度0.1%のエタノールまたはDMSO溶媒コントロールを曝露させます。100 µMのno cosolを使用します。プレートを粘着フィルムで密封してください。ウェル間のクロスコンタミネーションを防ぐため、確実に密封してください。プレートをアルミホイルで包みます。プレートを適切な温度に設定したシェーカーに移し、適当な時間振盪させます。シェーカー内での化学物質曝露完了後、室温が線虫の成長に影響するため、室温を20°C前後に維持してください。マルチチャンネルピペットを用いて、成虫がプレートの底に沈殿するまで、96ウェルプレートを10〜15分間静置します。プレート底部の虫を乱さないように注意しながら、各ウェルから350 µLのM9を抜き取ります。1 mLのM9で虫を洗浄し、再び10〜15分間静置して、成虫を底に沈殿させます。各ウェルから、プレート底部の線虫を刺激しないよう細心の注意を払いながら、M9溶液を1 mL除去します。残ったM9溶液中で線虫を再懸濁させます。96ウェルプレートから線虫とM9溶液の混合液を100 µL採取し、黒壁クリア底の384ウェルプレートの各ウェルに分注します。384ウェルプレートのすべてのウェルに充填されるまで、4枚の96ウェルプレートから線虫を用いてこの工程を繰り返します。画像取得プロセスにおけるオートフォーカスの効率と速度を向上させるため、すべてのウェルの液量を同一にすることが重要です。次に、各ウェルに1 µLのlaleを加え、線虫を約30分間インキュベートします。Laleはアセチルコリン受容体アゴニストとして作用し、線虫を不動化させます。プレートを、自動イメージングが可能な広視野ハイコンテンツ顕微鏡に移します。製造者のガイドラインに従い、ハイコンテンツ画像取得・解析ソフトウェアを使用してください。4倍対物レンズを選択し、1枚ずつ画像を撮影します。GFPイメージングのパラメータを露光時間45ミリ秒、画像解像度を2160×2160に調整します。画像取得を開始します。露光された線虫は384ウェルプレート上で直接イメージングされます。ここに示すように、各ウェルについて、少なくとも1つのGFP陽性胚を持つ線虫の数をカウントし、そのウェル内の線虫の総数で正規化します。微小管阻害剤であるno-code AOLなどの化学剤に曝露させると、DMSOコントロールと比較して、GFPを発現する胚が高い割合で誘導されます。GFP陽性の胚は、他の胚で観察される弱い背景蛍光や、動物の腸管で観察される自家蛍光よりも有意に明るい輝度を示します。赤色の矢印は、no-code AOL処理した線虫の子宮内で明確に確認できるGFP陽性胚を示しています。この手順に続き、生殖細胞への化学物質の影響をより詳細に観察するために、線虫のDNA染色などの他の手法を実施することができます。この技術により、毒性学分野の研究者は、化学物質の生殖毒性と生殖細胞毒性を迅速に評価することが可能になります。

comprehensive-assessment-germline-chemical-toxicity-using-nematode

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、急性毒性の治療や、毒性状態に対する耐性について遺伝的株をテストする短期生存アッセイを紹介しています。このプロトコル例は、パラコート (PQ)...

C.エレガンスサバイバルアッセイ:短期毒性試験

ここでは、有機体がよく摂食された状態から飢えた栄養状態に進行するにつれて、銅回避行動の変化および共通の食物源を見つける能力を評価するために設計されたCaenorhabditis elegans特異的アッセイを提示する。...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;栄養状態ベースの銅回避アッセイ

本発明者らは、集団ベースアッセイにおいて可溶性化合物に対するCaenorhabditis elegansの選好を自動的に分析することができる行動記録設定およびプロトコルを提示する。この記事では、ビヘイビアチェンバーの構築、ビヘイビアアッセイプロトコル、およびビデオ分析ソフトウェアの使用について説明します。...

線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析

モデル動物、線虫、化学物質の毒性を評価する基本的なプロトコルを説明します。メソッドは、便利で様々...

成長および線虫の繁殖に対する薬剤の効果を測定

環境有害物質への暴露鋭く、長期的な効果との開発に影響を与えます。詳しいプロトコルは早期萌芽期ビスフェノール A 曝露の影響を検討するため効果的な lab...

低線量の毒性に萌芽期の露出の長期的な行動および生殖の影響

定量法は識別し、線虫の表現型プロファイリングを自動的に分析することによって化学物質の急性毒性を予測しました。このプロトコルでは、384 ウェル...

線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

永続的な化学物質のトランスおよび多世代の影響は、環境と人間の健康に対する長期的な影響を判断する上で不可欠です。我々は、自由に生きている線虫カエノルハブ炎エレガンスを用いて、トランスおよび多世代の効果を研究するための新しい詳細な方法を提供する。...

毒性物質のトランスおよび多世代効果の研究のためのカエナルハブ炎エレガンスの使用

ここでは、ポリグルタミン凝集、神経細胞死、および化学回避行動を含む Caenorhabditis...

ポリグルタミン媒介性神経毒性に対する生理活性化合物を発見するためのモデルシステムとしてのCaenorhabditis elegans

若年成人 のCaenorhabditis elegans 線虫は、異なる濃度の市販の農薬または他の毒性物質に2〜24時間曝露される。次いで、蛍光発現株を用いて異なるニューロンを視覚化することができる。この論文は、線虫を農薬にさらし、ニューロンの損傷を評価する方法を実証する。...

カエノルハブディティス・エレガンス神経細胞に対する農薬の効果の検討

プロトコルは、ヒト胚性幹細胞およびトランスクリプトーム研究に基づいて、2つのin vitro発生毒性試験システム（UKKとUKN1）を記述します。試験系は、ヒトの発生毒性の危険性を予測し、動物実験、コストおよび化学安全性試験のために必要な時間を短縮するために寄与することができます。...

化学物質安全性のスクリーニングおよびシステム生物学データの生成のために発生毒性アッセイベースのヒト多能性幹細胞

学ぶ線虫Caenorhabditis elegansを用いた生殖化学毒性評価法。GFP蛍光レポーターで胚の染色体異常を可視化し、高スループットで化学物質の毒性を検出する手法です。

線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価

さらに動画を探す