線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価

本手順の全体的な目的は、線虫C. elegansを用いて生殖細胞の化学物質毒性を包括的に評価することです。これはまず、C. elegans PXOL1 GFP株の混合ステージの個体群に希釈した漂白剤溶液を加えることで、線虫を同期させることにより達成されます。このステップにより、卵殻によって漂白剤から保護された大量の胚が得られます。

第2ステップは、胚を餌のない液体中で孵化させ、同期化したL1幼虫集団を作製することです。次に、線虫を第4幼虫期（L4）まで成長させ、その時点で目的の化学物質を含む液体中に65時間曝露させます。最終ステップは、線虫の子宮内にある胚におけるGFPレポーターの発現を、蛍光顕微鏡を用いて視覚化することです。

最終的に、DMSOコントロールと比較したGFP陽性胚の割合が、テストした化合物の抗原性を反映します。Rodinモデルや細胞培養アッセイなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、個体レベルの動物モデルで化学物質の遺伝性と生殖細胞毒性を評価できると同時に、ハイスループットなアッセイを実施できることです。本日は、博士研究員であるDaniella Perotti博士が担当します。

本手順で使用するグラフィカルワームは、付属のプロトコル本文に記載されている方法で事前に調製したものである。線虫成長培地（NGMプレート）からGRワームを1〜2 mLのM9で洗浄して回収し、15 mLコニカルチューブに移す。GRワームが15 mLコニカルチューブの底に沈殿するまで、約5〜10分間放置する。次に、ワームのペレットを乱さないように上清を除去する。

虫体のペレットを2〜4本のマイクロ遠心チューブに分注し、各チューブに1 mLの希釈漂白剤溶液を加えます。室温で2〜3分間インキュベートします。実体顕微鏡下で反応の経過を観察し、すべての虫体が死滅したことを確認してください。

胚が死滅する可能性があるため、漂白時間は5分を超えないようにしてください。3000 RPMで1分間遠心分離し、線虫を回収します。

上清を除去し、反応を中和させるために1 mLの滅菌M9バッファーを加えます。漂白処理後、線虫に接触するすべての材料が滅菌されていることを確認してください。M9培地で線虫を2回洗浄します。

上清を除去し、100～200 µLのM9バッファーを加えます。ガラスパステールピペットを使用して、線虫のM9混合液を1滴、餌のないNGMプレートに滴下し、20 °Cで少なくとも24時間インキュベートして胚を孵化させます。これにより、幼虫の成長はL1期で停止し、2段階の同期が行われます。

曝露に使用するL4幼虫の数を最大化するためには、高度に同調した웜集団を得ることが極めて重要であるため、漂白およびL1飢餓法を用います。同調させたL1幼虫集団を確立した1日後、透明なNGMプレートからL1幼虫を回収します。プレートを1〜2 mLのM9で洗浄し、L1幼虫を15 mLコニカルチューブに移します。

死滅した成虫を15 mLコニカルチューブの底に約5分間沈殿させます。L1幼虫を含む上澄み液を回収し、新しい15 mLコニカルチューブに移します。2,600 RPMで2分間遠心分離し、虫体を沈殿させます。

上清を除去し、約 500 µL を残します。10 µL の液滴に含まれる個体数を数えることで、M9 溶液中の線虫の濃度を決定します。実体顕微鏡を用いて、少なくとも 5 回の液滴でカウントを行ってください。

線虫の濃度をM9バッファー中で1µLあたり20～25匹に調整し、50µLの線虫M9混合液をNGMプレートに添加します。餌となる細菌であるOP50を播種し、15°Cで65時間培養して、L1同期個体群がL4段階に達するまで成長させます。このスクリーンでは、生殖細胞系の破壊および胚の異数性の誘導を検出するために、蛍光転写レポーターを含むCL対照株を利用します。

透明なNGMプレートから、1〜2 mLのM9でプレートを洗浄してL4幼虫を回収し、15 mLコニカルチューブに移します。L4ワームが15 mLコニカルチューブの底に沈殿するまで、約5〜10分間静置します。その後、ワームペレットを乱さないように上清を除去します。

M9溶液を3〜5 mL加え、10 µLのドロップ内の個体数を数えることで、M9溶液中の線虫濃度を決定します。実体顕微鏡を用い、各サンプルについて少なくとも5滴のドロップをカウントしてください。その後、M9溶液を用いて線虫を1 worm/mLの濃度に再懸濁します。

あらかじめ準備したOP 50細菌をM9で10倍に希釈します。低温では線虫の発育に影響が出るため、再懸濁した細菌が室温に達していることを確認してください。まず、マルチチャンネルピペットを用いて、2 mL深型ラウンドボトム96ウェルプレートの各ウェルに線虫用M9ミックスを100 µLずつ加えます。次に、最後に希釈したOP 50細菌を各ウェルに400 µLずつ加えます。

各ウェルに500 µLの液量で100匹の虫を入れます。最終濃度が100 µMとなるように、目的のウェルに被験化学物質を0.5 µL添加します。これはCL elganにおける化学スクリーニングで一般的に使用される濃度です。陽性対照として、最終濃度0.1%のエタノールまたはDMSO溶媒コントロールを曝露させます。

100 µMのno cosolを使用します。プレートを粘着フィルムで密封してください。ウェル間のクロスコンタミネーションを防ぐため、確実に密封してください。

プレートをアルミホイルで包みます。プレートを適切な温度に設定したシェーカーに移し、適当な時間振盪させます。シェーカー内での化学物質曝露完了後、室温が線虫の成長に影響するため、室温を20°C前後に維持してください。

マルチチャンネルピペットを用いて、成虫がプレートの底に沈殿するまで、96ウェルプレートを10〜15分間静置します。プレート底部の虫を乱さないように注意しながら、各ウェルから350 µLのM9を抜き取ります。1 mLのM9で虫を洗浄し、再び10〜15分間静置して、成虫を底に沈殿させます。

各ウェルから、プレート底部の線虫を刺激しないよう細心の注意を払いながら、M9溶液を1 mL除去します。残ったM9溶液中で線虫を再懸濁させます。96ウェルプレートから線虫とM9溶液の混合液を100 µL採取し、黒壁クリア底の384ウェルプレートの各ウェルに分注します。

384ウェルプレートのすべてのウェルに充填されるまで、4枚の96ウェルプレートから線虫を用いてこの工程を繰り返します。画像取得プロセスにおけるオートフォーカスの効率と速度を向上させるため、すべてのウェルの液量を同一にすることが重要です。次に、各ウェルに1 µLのlaleを加え、線虫を約30分間インキュベートします。

Laleはアセチルコリン受容体アゴニストとして作用し、線虫を不動化させます。プレートを、自動イメージングが可能な広視野ハイコンテンツ顕微鏡に移します。製造者のガイドラインに従い、ハイコンテンツ画像取得・解析ソフトウェアを使用してください。4倍対物レンズを選択し、1枚ずつ画像を撮影します。

GFPイメージングのパラメータを露光時間45ミリ秒、画像解像度を2160×2160に調整します。画像取得を開始します。露光された線虫は384ウェルプレート上で直接イメージングされます。ここに示すように、各ウェルについて、少なくとも1つのGFP陽性胚を持つ線虫の数をカウントし、そのウェル内の線虫の総数で正規化します。

微小管阻害剤であるno-code AOLなどの化学剤に曝露させると、DMSOコントロールと比較して、GFPを発現する胚が高い割合で誘導されます。GFP陽性の胚は、他の胚で観察される弱い背景蛍光や、動物の腸管で観察される自家蛍光よりも有意に明るい輝度を示します。赤色の矢印は、no-code AOL処理した線虫の子宮内で明確に確認できるGFP陽性胚を示しています。

この手順に続き、生殖細胞への化学物質の影響をより詳細に観察するために、線虫のDNA染色などの他の手法を実施することができます。この技術により、毒性学分野の研究者は、化学物質の生殖毒性と生殖細胞毒性を迅速に評価することが可能になります。