線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価線虫（Caenorhabditis elegans）

この手順の全体的な目標は、線虫 C No Haitis elgan を使用して生殖細胞系の化学的毒性を包括的に評価することです。これは、まず、C Elgan PXOL one GFP株の混合期の線虫集団に希釈した漂白剤溶液を添加することにより、線虫を同期させることによって達成されます。このステップにより、卵殻によって漂白剤から保護された多数の胚が生成されます。

第2のステップは、胚を食物なしで液体中で孵化させることにより、同期したLワン幼虫の個体群を生成することです。次に、線虫は4番目の幼虫期またはL 4に成長し、その時点で、液体中の目的の化学物質に65時間さらされます。最後のステップは、線虫の子宮内の胚におけるGFPレポーターの発現を蛍光顕微鏡で可視化することです。

最終的に、DMSOコントロールと比較したGFP陽性胚の割合は、試験した化合物の抗原性を反映しています。この手法は、ロダンモデルや細胞培養アッセイなどの既存の方法と比較した場合の主な利点として、全動物モデルにおける化学物質の遺伝子性と生殖細胞毒性を評価できると同時に、この手順を実行するハイスループットアッセイを実施できることです。本日はポスドク研究員のダニエラ・ペロッティ博士です。

この手順のためのグラフィックワームは、添付のプロトコルテキストに記載されているように、以前に調製されており、線虫増殖培地またはNGMプレートからGRワームを1〜2ミリリットルのMナインで洗浄し、15ミリリットルの円錐管に移すことにより収集します。GRワームを15ミリリットルの円錐管の底に約5〜10分間沈殿させます。次に、ワームペレットを乱さずに上澄み液を取り除きます。

ワームペレットを2〜4本のマイクロ遠心チューブに移し、各チューブに1ミリリットルの希釈漂白剤溶液を追加します。室温で2〜3分間インキュベートします。実体顕微鏡で反応の進行を監視し、すべての線虫が死んでいることを確認します。

胚が死ぬ可能性があるため、5分以上漂白しないでください。1分間、遠心分離によってワームを収集します。3000 RPMで。

スーパーナットを取り出し、反応を中和するために滅菌M nineを1ミリリットル加えます。.漂白剤処理後にワームと接触するすべての材料が無菌であることを確認してください。Mナインメディアでワームを2回洗います。

上清を取り除き、M nineを100〜200マイクロリットルに加えます。ガラス製の牧草ピペットを使用して、ワームM nineミックスを一滴加えてNGMプレートを透明にし、摂氏20度で少なくとも24時間インキュベートして、胚が食物なしで孵化できるようにします。幼虫の成長は、L 1 ステージ 2 同期ステップで停止します。

漂白とLワード飢餓が使用されているのは、曝露に使用されるL 4幼虫の数を最大化するために、高度に同期した暖かい個体群を達成することが重要であるためです。同期したL one幼虫集団の確立から1日後、透明なNGMプレートからL one幼虫を採取します。プレートを1〜2ミリリットルのMナインで洗浄し、Lワンの幼虫を15ミリリットルの円錐管に移します。

死んだ成虫を15ミリリットルの円錐形チューブの底に約5分間沈殿させます。L oneワームが新しい15ミリリットルの円錐管にある上清を収集します。2, 600 RPMで2分間遠心分離によりワームを沈殿させます。

約500マイクロリットルを残して上清を取り除きます。10マイクロリットル滴中のワームの数を数えて、Mナイン溶液中のワームの濃度を決定します。実体顕微鏡を使用して、少なくとも5滴を数えます。

線虫の濃度をM nineで1マイクロリットルあたり20〜25線虫に調整し、次に50μlの線虫M nine混合物をNGMプレートに加えます。OP 50を装着し、摂氏15度で65時間インキュベートし、L one同期母集団がL 4ステージに到達するまで増殖させます。このスクリーニングは、蛍光転写レポーターを含む株に対するCLを利用して、生殖細胞系の破壊と胚異数性の誘導を検出します。

透明なNGMプレートからL型の幼虫を採取するには、1〜2ミリリットルのMナインでプレートを洗浄し、15ミリリットルの円錐管に移します。L 4ワーム沈殿物を15ミリリットルの円錐管の底に約5〜10分間置きます。次に、ワームペレットを乱さずに上澄みを取り除きます。

3〜5ミリリットルのMナインを加え、10マイクロリットルの滴中のワームの数を数えて、Mナイン溶液中のワームの濃度を決定します。実体顕微鏡を使用して、サンプルごとに少なくとも5滴を数えます。M9で1ミリリットルあたり1ワームの濃度でワームを再懸濁します。

以前に調製したOP50細菌をMナインで10倍に希釈します。低温は線虫の発生に影響を与えるため、再懸濁した細菌が室温に達することを確認してください マルチチャンネルピペット まず、2ミリリットルの深さの丸底96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのワームM nineミックスを追加します。次に、希釈したOP50バクテリアを400マイクロリットルを最後に各ウェルに加えます。

各ウェルには、500マイクロリットルに100匹のワームが入っています。0.5マイクロリットルの試験化学物質を目的のウェルに加えて、最終濃度100マイクロモルを達成します。CL elganの化学スクリーニングで一般的に使用される濃度は、ポジティブコントロールとして0.1%の最終濃度でエタノールまたはDMSO溶媒コントロールを露光します。

100マイクロモルのコソルなしを使用してください。粘着フィルムを使用してプレートを密封します。ウェル間の相互汚染を防ぐために、プレートをしっかりと密閉してください。

プレートをアルミホイルで包みます。プレートを適切な温度のシェーカーに適切な時間移し替えます。シェーカーでの化学物質への曝露が完了したとき、温度がワームの成長に影響を与えるため、部屋の温度を摂氏約20度に保ちます。

96ウェルプレートを10〜15分間休ませて、成虫がマルチチャンネルピペットを使用してプレートの底に沈殿するのを待ちます。プレートの底にあるワームを邪魔しないように注意しながら、各ウェルから350マイクロリットルのMナインを取り出します。1ミリリットルのMナインでワームを洗い、プレートを再び10〜15分間休ませて、成虫が底に沈殿するのを待ちます。

プレートの底にあるワームを邪魔しないように細心の注意を払いながら、各ウェルからMナインの1ミリリットルを取り出します。Resus、残りのMナインにワームを一時停止します。100ウェルプレートから96マイクロリットルのワームMナインミックスを収集し、黒い壁の透明なボトム384ウェルプレートのウェルにロードします。

384ウェルプレートのすべてのウェルがロードされるまで、4 96ウェルプレートのウォームを使用してこのプロセスを繰り返します。画像取得プロセス中のオートフォーカスの効率と速度を向上させるためには、すべてのウェルの容量が同じであることが重要です。次に、各ウェルに1マイクロリットルのラールを加え、ワームを約30分間インキュベートします。

Laleはアセチルコリン受容体アゴニストとして作用し、ワームを固定化し、プレートを自動イメージングを提供できる広視野のハイコンテント顕微鏡に移します。メーカーのガイドラインに従って、ハイコンテント画像取得および分析ソフトウェアを使用してください。4 x 対物レンズを選択すると、1 つにつき 1 つの画像を取得できます。

GFPイメージングパラメータを45ミリ秒の露光に、画像解像度を2160年までに2160に調整します。画像取得の開始 ばく露したワームは、384ウェルプレートに直接イメージングされます。少なくとも1つのGFP陽性胚を含む線虫の数は、ここに示すように、各ウェルについてカウントされ、その井戸内の線虫の総数によって正規化されます。

微小管毒ノーコードAOLなどの化学物質への曝露は、DMSOコントロールと比較して、GFP発現胚の誘導を高い割合で誘導することにつながります。GFP陽性胚は、他の胚で観察される弱いバックグラウンド蛍光や、動物の腸で観察される自家蛍光よりも大幅に明るいです。赤い矢印は、ノーコードAOL処理された線虫の子宮内にはっきりと見えるGFP陽性胚を示しています。

この手順に続いて、生殖細胞系に対する化学物質の影響をより詳細に調べるために、線虫のDNA染色などの他の方法を実行できます。この技術により、毒物学の分野の研究者は、化学物質の生殖毒性と生殖細胞毒性を迅速に評価することができます。