病における網膜障壁を研究するツールとしてアデノ随伴ウイルスを使用して、

この手順の全体的な目的は、網膜疾患の動物モデルにおいて、血液網膜関門の透過性と内境界膜の完全性を調査することです。これは、まずGFP導入遺伝子を含むAAV粒子を硝子体または血流に注入し、次に注入後の異なる時点で血液サンプルを採取することによって達成されます。

血液サンプリングに加え、週1回のin vivo眼底イメージングを実施します。最終ステップとして、網膜フラットマウントおよび網膜凍結切片の免疫組織化学染色を行います。最終的に、共焦点顕微鏡観察とPCRを用いて、ILMの完全性を示す導入パターンを可視化し、血流中のAAV粒子を検出することで、血液網膜関門の透過性を実証します。

本手法および我々の既存の手法の主な利点は、AAVペースト法によって、他の細胞では得られない血液網膜関門の透過性に関する情報が得られることです。この技術の意義は、AAV粒子に対する血液網膜関門の透過性を確認し、望ましくない副作用を回避できるため、AAVを介した遺伝子治療へと展開されます。また、本手法は、糖尿病ラットなどの他の網膜疾患の動物モデルにおける内境界膜の完全性に関する知見を提供することが可能です。

血液網膜関門の破綻を示すDP 71ヌルマウスモデルの網膜が、野生型の網膜よりも効率的に導入されることを確認した際、私たちはこの手法の着想を得ました。

まず、C-57 black-six Jマウスを麻酔します。右立反射、逃避反射、および尾つまみ反応の3つの反射が消失していることを確認してください。

これらの反射の消失により、麻酔状態であることを確認します。次に、点眼器を用いて5%neosynephrineと0.5%mydriaticumを角膜に投与し、瞳孔を散大させます。その後、眼球が過度に乾燥しないよう、動物用軟膏で潤滑させます。ここで、1〜4×10¹¹ particlesのAAV-GFPを含むストック溶液を、超極細の30ゲージ使い捨て針に充填します。

一般的に、この手法を初めて行う方は、水晶体や網膜に触れることなく、最も安全な硝子体内注射を行う必要があるため、習得に苦労します。まず、30ゲージの超極細使い捨て針を、赤道部および角膜輪部付近から硝子体腔へと刺入します。針を眼内に導入した後、針先が硝子体腔の中央にあることを確認しながら、溶液1µLを注入します。

内境界膜の実験では一方の目を対照群とし、血液網膜関門の実験では両眼に注入を行います。注入後、注入した各眼に抗炎症剤および抗菌剤の外用治療を施します。1週間後、ネオスネフリンと散瞳薬で瞳孔を散瞳させ、眼底カメラを用いて眼底検査を実施します。

注入後1週間、2週間、1ヶ月、および2ヶ月の時点で観察を行い、GFP発現を追跡します。安楽死させた注入動物から眼球を採取した後、眼球を解剖して水晶体と角膜を除去します。次に、解剖した眼球を4%パラホルムアルデヒドに1時間浸漬固定します。1時間後、室温で10%スクロースを用いて眼球をさらに1時間凍結保護します。その後、室温で20%スクロースに20分間浸漬させます。

最後に、眼球を30% sucrose溶液に入れ、4°Cで一晩静置します。翌日、眼杯をcryo-matrixなどの包埋樹脂で包埋し、凍結させます。その後、クリオスタットを用いて10 micronの切片を作成し、凍結組織用スライドグラスに貼り付けます。

次に、スライド上の切片を界面活性剤で5分間透過処理します。その後、PBSで2回短時間洗浄します。続いて、眼球組織を室温で1時間ブロッキングします。

網膜のフラットマウントを行う際は、摘出した眼球を4%パラホルムアルデヒドで15〜30分間固定し、解剖しやすくします。GFPの蛍光を保持するためには、この固定および解剖後の固定を適切に行うことが極めて重要です。固定後15〜30分以内に眼球を解剖し、角膜と水晶体を除去します。

鋸歯縁と視神経の周囲を切除し、網膜を網膜色素上皮および強膜から分離します。解剖後、網膜を4% Para formaldehydeにさらに30分間浸し、組織および導入された網膜細胞内の蛍光タンパク質を固定します。固定後、検体をpH 7.4の滅菌PBSで5分間洗浄します。

次に、PBSをブロッキングバッファーに交換し、網膜を室温で4時間、または4°Cで一晩インキュベートします。標識ステップとして、サンプルをブロッキングバッファーで希釈した一次抗体とともに、室温で4時間または4°Cで一晩インキュベートします。一次抗体を適用した後、組織をPBSで3回洗浄し、次いでブロッキングバッファーで1:500に希釈したAlexa Fluor結合抗体中で組織をインキュベートします。

凍結切片の場合は1時間、フラットマウントの場合は2時間インキュベートします。室温で、遮光して行ってください。二次抗体を適用した後、前述と同様にPBSで3回洗浄して除去します。

次に、網膜にリリーフカットを施し、光受容体または網膜神経節細胞のいずれかが上を向くようにして、ガラススライド上に平坦に固定できるようにします。水溶性の封入剤を塗布し、カバーグラスをかけます。スライドは、共焦点顕微鏡での撮像まで4 °Cで保存可能です。

まず、血中AAV粒子のポジティブコントロールを作成します。最初に、AAVを注入する前に10～20 µLの血液サンプルを採取します。次に、麻酔後、100 µLのウイルスストック溶液を血流に注入します。

血流に物質を注入するより簡単な方法は、陰茎静脈への注入です。このビデオキャプチャでは、注入の視覚的コントロールとして青色色素を注入しています。その後3日間にわたり、定期的に少量の血液サンプルを採取し、その後マウスを安楽死させます。組織サンプルから、市販のキットを用いてゲノムDNAを抽出します。抽出したDNAを用いて、GFPに対するプライマーペアでPCR増幅を行います。伸長時間を45秒、アニーリング温度を55 °Cとして、30サイクル実行します。SHH 10ベクターの導入パターンは、DP 71ヌルマウスで増加することが予想されました。動物モデルにおいて内境界膜の構造に摂動が見られた場合、DP 71ヌルマウスは網膜バリアが損なわれており、したがって有用な比較となります。DP 71ヌルマウスへのSHH 10の硝子体内注入は、ミュラーグリア細胞をより効率的に標的とします。

これは、野生型コントロールと比較して、このトランスジェニックマウス系統において内境界膜の不安定化が起きていることを示しています。AAV5-GFPの注入によっても、内境界膜の透過性が証明されました。野生型マウスでは、AAV5の硝子体内注入は効果がありませんでしたが、DP 71ヌルマウスのように網膜バリアが損なわれているマウスでは、光受容器への遺伝子導入に非常に有効となりました。

PCR解析により、DP 71欠損マウスの血液網膜関門はAAV粒子に対して選択性を維持していることが示されました。これは、硝子体内注射後に血液サンプルからAAVの痕跡が検出されなかったためです。このビデオを視聴することで、網膜の導入パターンや血流中へのAAV粒子の存在を解析し、内境界膜の完全性または血液網膜関門の透過性を試験するために、アデノ随伴ウイルスをどのように使用するかを十分に理解できるはずです。