Name: 病における網膜障壁を研究するツールとしてアデノ随伴ウイルスを使用して、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学ぶAAVを用いた網膜疾患モデルにおける血液網膜関門透過性と内境界膜の完全性評価法。GFPトランスジェンを含むウイルス粒子を注射し、in vivoイメージングと免疫組織化学で解析することで、網膜障壁の機能を詳細に調べる手法を解説します。

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私たちはInstitut de la Visionのイメージングプラットフォームに感謝します。私たちは、O.V.とAllergan INCへの博士号フェローシップを提供してくれたフランス筋ジストロフィー協会(AFM)に感謝します。LABEX LIFESENSES[ANR-10-LABX-65参照]のフレームで行われたこの作業は、ANRが管理するフランスの国家資金によって支援されました。AAVの準備に技術支援を提供してくださったPeggy Barbe氏とMélissa Desrosiers氏に感謝します。共焦点顕微鏡法における優れた技術支援と、結果の解釈に関する彼の専門的な意見を提供してくださったStéphane Fouquet氏に感謝します。

本研究で用いたすべての動物は、眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVO声明によると世話と取り扱った。 HEK-293細胞17,18の一過性トランスフェクションによる組換えAAV（rAAVの）1。生産注：マクルーアC、Joveの（2011）19を参照してください。 <ol><li> AAVベクタープラスミドの大規模プラスミド調製を（少なくとも1 mg / ml）で精製する。 3プラスミドを使用してください。 AAV逆方向末端ことなく複製およびキャプシド遺伝子を保有するAAVヘルパープラスミドは、ITRは、AAV ITRを保有する導入遺伝子発現カセットは、転写プラスミドと呼ばれる、プラスミド、アデノウイルスヘルパー遺伝子の供給E2、E4、およびVA RNA遺伝子と呼ば繰り返すpHELPERとしての。 </li><li>ポリエチレンイミン（または他のトランスフェクション試薬）を用いて、これらの3つのプラスミドで293細胞をトランスフェクション。トランスフェクション効率の80％を超える良好なv​​iのために必要であるRAL利回り。 </li><li>イオジキサノール勾配で293細胞溶解物から組換えAAVを精製する。 15％、25％、40％、60％イオジキサノール勾配を得るために使用される。 、AAV粒子を含む40％イオジキサノール画分を収集し、1時間50万×gで超遠心分離した後に一部を集中し、0.001％プルロニックを含むPBS（リン酸緩衝生理食塩水）に対するバッファー交換。 </li><li>ウイルスゲノム力価20を決定するには、QPCRに続くDNA分解酵素プロテイナーゼダイジェストを行う。順方向および逆方向プライマーはAAV2 ITRに位置して62 bpの領域を増幅する。プラスミド標準のために、プローブは、FAMで標識し（BHQ）、ブラックホールクエンチャーを有している。 </li><li> ITRプライマー、100nMのフォワードITRプライマー、100nMのAAV2 ITRプローブ、0.4mMのdNTPを、2のMgCl 2、1×プラチナTaqポリメラーゼ緩衝液、1Uプラチナリバース340 nMのを使用して25μlの最終体積で定量PCR（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）を行うTaqおよび5μlのテンプレート（標準、サンプルおよび鋳型なしコントロール）。 </li><li>のために標準は、7×10倍連続希釈（5μlの10月10日から4月 10日までのゲノムの/ mlの最終濃度とした2×10 9 3 2×10ゲノム/ mlのそれぞれ）でのトランスフェクションのためのプラスミドを使用する。 </li><li> 1分で1分間の60℃でのアニーリング/伸長のために95℃での変性を40サイクル、続いて15分間95℃での初期変性ステップでプログラムを開始する。短期保存または長期保存期間のために-20℃で、4℃で保存する。 </li></ol> AAVの2.硝子体内注射<ol><li>ケタミン（50mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）でC57BL6Jマウスを麻酔し、正向反射の消失、適切な麻酔を示す引っ込め反射とテールピンチ応答を確認する。 neosynephrine 5％の角膜アプリケーションによって生徒を拡張し、点眼薬0.5％mydriaticum。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。 </li><li>超微細な30のG disposabを渡すル赤道を通じて針と硝子体腔に、角膜縁の隣に（チウK、Joveの（2007年）21を参照）。硝子体腔（ 図1）の中央に針の直接観察にShH10-GFPまたはAAV5-GFPの1 11 10×4のVPを含む1μlの株式を注入。 ILM実験のコントロールとして片目を使用してください。 BRB実験のために両眼を注入。注入された目に​​、抗炎症、抗菌局所的処置を適用します。 </li><li> neosynephrineで生徒を拡張し、mydriaticum目は、撮影のために低下する。 GFP（緑色蛍光タンパク質）の発現は1週間、2週間、1ヶ月、および硝子体内注射後2ヵ月（ 図1）に従うように眼底カメラを眼底検査を行う。 CO 2吸入1から2ヶ月後に注射することによってマウスを生け贄に捧げる。 </li></ol> 3.免疫組織化学<ol><li>網膜凍結切片（ 図1）の場合は、Lを削除するには除核の目を解剖1時間、4％パラホルムアルデヒド中ではens角膜、浸漬修正。 <ol><li>室温で1時間、室温でさらに時間を20％スクロース、10％スクロース中で、以前に固定目をCryoprotect。一晩4℃で30％スクロース溶液中でCryoprotect。フリーズとそのようなクライオマトリックスとして樹脂を埋め込んでアイカップを埋め込む。 10μmの凍結切片を作成し、特別に凍結組織切片のために処理したスライドにマウントし、それは、染色中に組織の密着性を向上。 </li><li> 5分間PBS（pH7.4）中の0.1％トリトンX100を持つセクションを透過。洗浄PBSで2回、1％BSA、0.1％ツイーン20を含むPBS中で室温で1時間ブロック。 </li></ol></li><li>網膜のフラットマウント（ 図1）は、切開を容易にするために、15分間、4％パラホルムアルデヒド中で除核目を固定する。 <ol><li> 15〜30分で、角膜とレンズを削除するには、目を解剖。鋸状縁を中心に切断することにより、網膜色素上皮（RPE）と強膜から網膜を分離し、視神経。網膜と形質導入網膜細胞における蛍光タンパク質を（固定が24時​​間を超えてはならない）を固定するためにさらに30分間4％パラホルムアルデヒド中に浸し。滅菌PBS、pH7.4の中で5分間洗浄する。 </li><li> （1％BSA、2％正常ヤギまたはロバ血清を含むPBS、0.5％トリトンX-100）を、ブロッキング緩衝液をPBSに変更し、室温で4時間または4℃で一晩のいずれかのために、ブロッキング緩衝液中でインキュベートする。 </li></ol></li><li>室温または4℃で一晩のいずれか4時間、ブロッキング緩衝液中で一次抗体を有する組織をインキュベートする。 PBSで洗浄3X。 注：次のように使用される抗体は、以下のとおりです。抗ラミニン（1 / 1,000）ILM、抗ロドプシンクローン4D2（1/500）ラベリングロッド、抗グルタミンシンテクローンGS-6（1/1500）ラベリングミュラー細胞を標識し、PNAレクチン（1/40）ラベリングコーン。 </li><li>部屋テンペで1時間（凍結切片）または2時間（フラットマウント）用のブロッキング緩衝液中でアレクサフルオロ結合二次抗体の1：500希釈を有する組織をインキュベートrature、光から保護。 PBSで洗浄3X。 </li><li>網膜に切り込みを緩和行い、感光体または網膜神経節細胞（RGC）どちら側が上方に向けてスライドガラス上にflatmount。 4℃でカバーガラスとストアを適用し、水性のmountingmediumを追加します。 </li><li>レーザー走査型共焦点顕微鏡上で、共焦点顕微鏡を実行します。励起および発光のクロストークを低減するために、順次行ずつ画像を取得する。ナイキスト - シャノンのサンプリング定理によるとステップサイズを定義する。最終画像で過飽和のピクセルを最小限に露出設定を使用してください。 Zプロジェクトの機能の下に最大強度を使用して、最終的に8ビットRGBカラーモードに変換する単一平面上FIJIとプロセス12ビット画像、プロジェクトZ-セクション。 </li></ol>マウスの血液サンプルの4 PCR分析<ol><li>麻酔しC57BL6Jマウスの陰茎静脈にAAV-GFPの1〜10×4の11粒子を含有する100μlの株式（イソフルランの5％を注入超微細6mmの針をインスリンシリンジを用いて閉鎖室で誘導手術中、ノーズコーンを介してイソフルランの2.5％）である。この動物は、AAV粒子の循環の陽性対照として役立つ。 </li><li>注射と3時間、24時間、2日、3日ShH10硝子体内注射後またはintrapenile注射（ 図1）前後のマウスの尾からのサンプルの血液。約10〜20μlをヘパリンチューブに回収される。手続きの完了後にCO 2吸入によりマウスを生け贄に捧げる。 </li><li>お好みの抽出キットを用いて血液サンプルからゲノムDNAを抽出します。 </li><li>ゲノムDNAのPCR増幅を行う。このプロトコルの以下のプライマー対を使用します。GFPを、5&#39;-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 &#39;、アンチセンス5&#39;-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3&#39;を感じる。以下のPCRプログラムを実施した：95℃で2分（1サイクル）。 95℃45秒、55℃1分、72℃45秒（30サイクル）; 72℃5分（1サイクル）;4℃の保持。 </li></ol> 5.オプションエバンスブルー法注：エバンスブルー法10を用いて、網膜に血管からのアルブミン漏出を測定することにより、血管透過性を定量化する。 <ol><li> 5μmのフィルターを介して生理食塩水（6 mg / ml）で、超音波洗浄器で5分間超音波処理し、ろ過に溶解してエバンスブルー色素を準備します。 </li><li> （イソフルラン吸入、ステップ4.1を参照）C57BL6Jマウスを麻酔、適切な麻酔を示す引っ込め反射とテールピンチ応答を正向反射の消失を確認し、陰茎静脈（ 図1）を介した（45mg / kg）のエバンスブルーを注入する。マウスの足、銃口、耳は色素の取り込みと分布を確認し、エバンスブルー注射後、明らかに青になっていることを確認してください。 </li><li>ケタミン（50mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）での色素の注射後C57BL6Jマウスに3時間を麻酔しrightinの消失を確認適切な麻酔を示すGレフ。サンプルヘパリンチューブ中に血液を心臓内に約500μlのクエン酸塩緩衝液を用いて、左心室を介して2分間、マウスを灌流（0.05 M、pHを3.5;蒸留水1 Lクエン酸7.8gのクエン酸ナトリウムを3.8g溶解）血管収縮を防止するために、37℃に予め温めておいた。マウスは、灌流を経由して屠殺する。 </li><li>慎重に灌流、脱核とした後に網膜を収集するための手術用顕微鏡の下で両眼を解剖（3.2項を参照）。遠心エバポレーターで乾燥網膜は一晩中、重さ、および（100 XG）しながら65℃で18時間ホルムアミド100μlの網膜をインキュベートすることにより、エバンスブルー色素を抽出します。 4°Cで15分間20,798.5×gで4℃で遠心分離血液サンプルで2時間20,798.5×gで30Kオメガフィルタチューブ内の遠心網膜サンプル。 </li><li>吸光度を測定するために、両方の上清を使用してください。 foの最大吸光度を差し引くことにより、各試料の吸光度を決定する740 nmでの吸光度を最小に620nmの青色rのエバンス。ホルムアミド中のエバンスブルーの標準曲線から血漿および網膜のエバンスブルー濃度を計算します。時間当たりの乾燥網膜（血漿/ gの網膜の乾燥重量/時ずつ）のグラムあたりのエバンスブルーのマイクロリットルでBRB透過性を発現する。 </li></ol> 6.オプションフルオレセイン血管造影注：マウスにおける網膜血管からの漏出は、フルオレセインナトリウムの腹腔内注射することによって可視化することができる。 <ol><li> （neosynephrineとmydriaticum）をドロップしC57BL6Jマウスを麻酔（イソフルラン吸入、 ステップ4.1を参照）、目で瞳孔を拡張。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。 </li><li>フルオレセイン血管造影用の0.1ミリリットル滅菌生理食塩水で10％フルオレセインナトリウムの腹腔内に0.01〜0.02ミリリットルを注入。 </li><li>眼底カメラを用いて、注射後両目の画像を収集する。プロの後にCO 2吸入によりマウスを生け贄に捧げるcedure。 注：網膜の血管は血管造影に見えるようになるために20秒が必要です。画像は、フルオレセイン注射後3-10分最大の間に捕捉されなければならない。漏洩スポット（存在する場合）は2.5分後に観察可能である。後の時点で、画像品質がフルオレセインナトリウムまもなく分析のために使用された後に得られた硝子体、こうして画像のみに拡散するために失われる。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

BRBは、血液および網膜の間の分子の交換を調節する。その内訳は、糖尿病性網膜症または加齢性黄斑変性症（AMD）などの種々の疾患と関連している。我々は最近、透過BRBを表示ジストロフィンノックアウトマウスにおいて、網膜は、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）によって媒介される遺伝子送達に対してより寛容になることを示した。しかし、BRB透過性AAV粒子にもかかわらず、眼内に、このモデルにおける眼の区画に閉じ込め滞在を注射。我々の結果は、透過性のBRBを表示する疾患に対する遺伝子治療は、全身性の副作用の追加のリスクを表していないことを示している。さらに、それらは、ILMのような他の障壁は、ウイルス粒子へのより良いアクセスを許可する網膜疾患の間に妥協になるという事実を支持している。我々の調査結果は、AAVコード化レポーター遺伝子は網膜疾患の動物モデルにおいて、BRB透過性とILMの整合性を研究するための優れたツールであることを考えるように私たちを導く。 Particularly、特にミュラーグリアにラベルを付けるAAV変種ShH10は、網膜のグリアにラベルを付け、疾患に応じて、網膜の状態を報告するためのツールと​​して使用することができます。...

ミュラー細胞は網膜の主要なグリア要素である。形態学的には、彼らが放射状に網膜にまたがるとそのエンドフィートは、硝子体に接触して、ILMと後者の秘密のコンポーネントに直面しています。 ILMは、約10種類の細胞外マトリックスタンパク質（ラミニン、アグリン、パールカン、ニドジェン、コラーゲン、いくつかのヘパリン硫酸プロテオグリカン）からなる基底膜である。開発中、その存在は、網膜組織発生、視神経軸索のナビゲーション、および神経節細胞1-3の生存のために不可欠である。しかし、ILMは、成体網膜において本質的でないし、外科的網膜損傷4を引き起こすことなく、特定の病状を除去することができる。遺伝子治療では、この膜は、硝子体内注射5のAAVを用いて網膜の効率的な伝達のための物理的障壁となる。 彼らのプロセスの豊富な樹枝状分岐を経て、ミュラー細胞は、栄養や規制スッポを提供網膜ニューロンおよび血管細胞の両方に室温。ミュラー細胞は、BRB 6の形成および維持において、網膜の恒常性の調節に関与する。網膜毛細血管内皮細胞、ミュラー細胞、星状細胞および周皮細胞間のタイトジャンクショ​​ンはBRBを形成する。 BRBは、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、呼吸器疾患などのretina.In多くの疾患に入るの特定の物質を防ぎ、網膜の低酸素症は、BRB 7-9を通る漏れの原因となる。この破裂は血管原性浮腫、網膜剥離や網膜損傷につながる血管透過性の増大と関連している。 ミュラー細胞は緊密BRBとILMの完全性の両方において重要な役割を果たし、血管および基底膜に関連している。その結果、ミュラーグリア細胞を標識すると、これらの網膜障壁の物理的状態の研究に特に関連する。 クラシック味方、BRB透過性は血漿アルブミンに非共有結合し、エバンスブルー色素の全身注射からなるエバンスブルーアッセイを用いて測定される。このアッセイは、網膜への血管10（プロトコルセクション5を参照）からのアルブミン漏出（中間サイズのタンパク質、〜66 kDaの）を測定する。また、血管漏出は、フルオレセインの漏れを証明する蛍光眼底血管造影により可視化することができる（小分子、〜359ダ、プロトコル第6節参照）11。それにもかかわらず、両方の方法は、小分子およびタンパク質へBRB透過性の評価を可能にするが、それらは、ILMの整合性についての情報を提供していません。 したがって、BRB透過性を研究するために、我々は、より大きな分子（ 例えば、AAV粒子、25 nmの直径）へBRB透過性に関する情報を提供するAAVベースのメソッドを使用していました。確かに、私たちの方法はそれを示唆している、血液中のAAV導入遺伝子の存在を検出することができる〜25nmの直径の粒子だろう血流に浸透させることができる。この方法はまた、病理学的状態におけるILM及び細胞外マトリックスタンパク質の構造に関する情報を提供する。 2つのAAV変異体は、そのような研究のために有用である：AAV5とShH10。網膜下に注入された、AAV5は、光受容体と網膜色素上皮12のための自然な指向性を持っていますが、完全なILM 5,13と、野生型網膜における硝子体内に投与した場合には、外側の網膜に渡って取得することはできません。 ShH10は、具体的には、ニューロン14,15の上にグ ​​リア細胞を標的とするように操作されているAAV変異体である。 ShH10は選択的に損なわれた障壁16と網膜の効率化と健康と病気の両方の網膜でミュラー細胞を標識する。 immuhistochemistry及び血液DNAの分析と結合され、これらのウイルスのツールは、網膜障壁の状態および疾患におけるそれらの関与（ 図1）に関する情報を提供する。

<table><tbody><tr><td>C57BL6Jマウス</td><td>JANVIER LABS</td><td></td><td>マウス</td></tr><tr><td>ケタミン500</td><td>Virbac フランス</td><td></td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>キシラジン ロンプン 2%</td><td>、バイエルヘルスケア</td><td></td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>ネオシネフリン 5%、フォーレ</td><td>ユーロフタ</td><td></td><td>拡張剤</td></tr><tr><td>Mydriaticum 0.5%</td><td>、テア</td><td></td><td>ジラタント</td></tr><tr><td>Sterdex</td><td>Novartis</td><td></td><td>抗炎症</td></tr><tr><td>クライオマトリックス包埋樹脂</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 接着スライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143352</td><td>スライド</td></tr><tr><td>抗ラミニン</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗ロドプシンクローン 4D2</td><td>ミリポア</td><td>MABN15</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗グルタミン合成酵素クローン GS-6</td><td>ミリポア</td><td>MAB302</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗グリア線維性酸性タンパク質</td><td>Dako</td><td>334</td><td>抗体</td></tr><tr><td>PNA レクチン</td><td>Invitrogen</td><td>L32459</td><td>プローブ</td></tr><tr><td>Alexa fluor 標識二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>抗体</td></tr><tr><td>Fluorsave 試薬</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td>封入培</td></tr>地 <tr><td>QIAmp DNA マイクロキット</td><td>QIAGEN</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNAポリメラーゼ</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>Evansブルー染料</td>シ<td>グマ</td><td>E2129</td><td>染料</td></tr><tr><td>5 &micro;mフィルター</td><td>ミリポア</td><td></td><td></td></tr>ク<tr><td>エン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S1804</td><td></td></tr>ク<tr><td>エン酸</td><td>シグマ</td><td>C1909-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド分光光度</td><td>シグマ</td><td>295876-2L</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン</td><td>シグマ</td><td>F2456</td><td>染料</td></tr><tr><td>ミクロンIII</td><td>フェニックス研究所</td><td></td><td>3-CCDカラーカメラ、フレームグラバー、および既製のソフトウェアに基づく顕微鏡システムにより、研究者はマウスの網膜をイメージングできます。</td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>テルモ</td><td>SS30M3109</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ 10 & マイクロ;l ハミルトン</td><td>・ダッチャー</td><td>74487</td><td>セレンゲ 1701</td></tr><tr><td>ニードル RN G33、25 mm、PST 2</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>11530332</td><td>硝子体内注射</td></tr><tr><td>UltraMicroPump UMP3</td><td>ワールド プレシジョン インスツルメンツ</td><td>UMP3</td><td>汎用性の高いインジェクターは、マイクロシリンジを使用してピコリットルの容量を供給</td></tr><tr><td>UltraMicroPump (UMP3) (1) SYS-Micro4 コントローラー</td><td>UMP3-1</td><td>デジタル コントローラー</td><td></td></tr><tr><td>双眼拡大鏡 SZ76</td><td>ADVILAB</td><td>ADV-76B2</td><td>ズーム 0.66 x 5 x LED スタンド付き エピと直径 / 網膜解剖</td></tr><tr><td>春のはさみ ストレート - 8.5 cm</td><td>Bionic France S.a.r.l</td><td>15003-08</td><td>網膜解剖</td></tr><tr><td>湾曲 バンナはさみ</td><td>15004-08</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont 5</td><td>11254-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Thermal Cycler</td><td>Life テクノロジー</td><td>4375786</td><td>サーモサイクラー</td></tr><tr><td>超音波洗浄機</td><td>実験室用品</td><td>G1125P1T</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 30k オメガチューブ</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>SC 110 A</td><td></td></tr><tr><td>分光蛍光光度計</td><td>TECAN</td><td>無限 M1000</td><td></td></tr></tbody></table>

病における網膜障壁を研究するツールとしてアデノ随伴ウイルスを使用して、

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

ミュラー細胞は網膜の主要なグリア細胞である。彼らのエンド足は外側と内側の制限膜（ILM）での網膜の限界を形成し、アストロサイト、周皮細胞および内皮細胞と一緒に彼らは血液網膜関門（BRB）を確立。 ILMは、組織学的に網膜と硝子体腔の境界を定義する基底膜として機能している間BRBは、血流と網膜の間で物質輸送を制限します。ミュラー細胞にラベルを付けると、これらの細胞はBRBとILMの不可欠な部分であるように、網膜障壁の物理的状態を研究するために特に関連しています。 BRBとILMの両方が頻繁に網膜疾患に変更され、病気の症状の原因であるされている。 そのようなエバンスブルーアッセイまたはフルオレセイン血管造影などのBRBの完全性を研究するためのいくつかのよく確立された方法があります。しかしこれらの方法は、BRB透過tの程度についての情報を提供しないナノメートル範囲の大きな分子、O。さらに、それらは、ILMのような他の網膜の障害の状態に関する情報を提供していません。網膜のILMと一緒BRB透過性を研究するために、我々は、疾患状態におけるILM及び細胞外マトリックスタンパク質の状態を示しているが、より大きな分子にBRBの透過性に関する情報を提供するAAVベースの方法を使用する。 2つのAAV変異体は、そのような研究のために有用である：AAV5とShH10。 AAV5は、光受容体のための自然な指向性を持っていますが、ILM（ すなわち、野生型の網膜に）完全である硝子体内に投与した場合には、外側の網膜に渡って取得することはできません。 ShH10は、グリア細胞に対して強い親和性を有しており、選択的に、健康と病気の両方の網膜にミュラーグリアにラベルを付けます。 ShH10はILMが侵害された網膜におけるより効率的な遺伝子送達を提供しています。免疫組織化学および血液DNA分析と相まってこれらのウイルスのツールは、疾患における網膜の障害の状態に光を当てる。

私たちは、動物モデルは、ILM（ - B図2A）の構造における変動を示している場合ShH10を使用してミュラーグリア細胞の網膜の伝達を増加期待しています。例えば、我々は野生型マウス16（ - F図2C）と比較して、このマウス系統におけるILMの透過性の増加を示す、硝子体内注射によって、そのDP71、ShH10標的の非存在下で特異的に、より効率的にミュラーグリア細胞を示している。 AAV5もILM透過性の指標として使用することができる。野生型マウスにおける硝子体内注射による効果のないAAV5は、このようなDP71ヌルマウス16として、または他の網膜変性22（ - H図2G）、侵入した網膜の障害を持つマウスにおける光受容体への遺伝子送達において強く有効となる。これはさらに、ILMの解体と潜在的な透過性increasを確認網膜神経細胞の周囲の細胞外マトリックスの電子。 <p class="jove_content...

網膜疾患の動物モデルにおける血液網膜関門透過性と内部制限膜の完全性を調査するために、我々は網膜ニューロンとグリアを標識するためのツールとしていくつかのアデノ随伴ウイルス(AAV)変異体を使用しました。その後、ウイルス媒介レポーター遺伝子発現を網膜バリア透過性の指標として使用します。

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

この手順の全体的な目的は、網膜疾患の動物モデルにおいて、血液網膜関門の透過性と内境界膜の完全性を調査することです。これは、まずGFP導入遺伝子を含むAAV粒子を硝子体または血流に注入し、次に注入後の異なる時点で血液サンプルを採取することによって達成されます。血液サンプリングに加え、週1回のin vivo眼底イメージングを実施します。最終ステップとして、網膜フラットマウントおよび網膜凍結切片の免疫組織化学染色を行います。最終的に、共焦点顕微鏡観察とPCRを用いて、ILMの完全性を示す導入パターンを可視化し、血流中のAAV粒子を検出することで、血液網膜関門の透過性を実証します。本手法および我々の既存の手法の主な利点は、AAVペースト法によって、他の細胞では得られない血液網膜関門の透過性に関する情報が得られることです。この技術の意義は、AAV粒子に対する血液網膜関門の透過性を確認し、望ましくない副作用を回避できるため、AAVを介した遺伝子治療へと展開されます。また、本手法は、糖尿病ラットなどの他の網膜疾患の動物モデルにおける内境界膜の完全性に関する知見を提供することが可能です。血液網膜関門の破綻を示すDP 71ヌルマウスモデルの網膜が、野生型の網膜よりも効率的に導入されることを確認した際、私たちはこの手法の着想を得ました。まず、C-57 black-six Jマウスを麻酔します。右立反射、逃避反射、および尾つまみ反応の3つの反射が消失していることを確認してください。これらの反射の消失により、麻酔状態であることを確認します。次に、点眼器を用いて5%neosynephrineと0.5%mydriaticumを角膜に投与し、瞳孔を散大させます。その後、眼球が過度に乾燥しないよう、動物用軟膏で潤滑させます。ここで、1〜4×10¹¹ particlesのAAV-GFPを含むストック溶液を、超極細の30ゲージ使い捨て針に充填します。一般的に、この手法を初めて行う方は、水晶体や網膜に触れることなく、最も安全な硝子体内注射を行う必要があるため、習得に苦労します。まず、30ゲージの超極細使い捨て針を、赤道部および角膜輪部付近から硝子体腔へと刺入します。針を眼内に導入した後、針先が硝子体腔の中央にあることを確認しながら、溶液1µLを注入します。内境界膜の実験では一方の目を対照群とし、血液網膜関門の実験では両眼に注入を行います。注入後、注入した各眼に抗炎症剤および抗菌剤の外用治療を施します。1週間後、ネオスネフリンと散瞳薬で瞳孔を散瞳させ、眼底カメラを用いて眼底検査を実施します。注入後1週間、2週間、1ヶ月、および2ヶ月の時点で観察を行い、GFP発現を追跡します。安楽死させた注入動物から眼球を採取した後、眼球を解剖して水晶体と角膜を除去します。次に、解剖した眼球を4%パラホルムアルデヒドに1時間浸漬固定します。1時間後、室温で10%スクロースを用いて眼球をさらに1時間凍結保護します。その後、室温で20%スクロースに20分間浸漬させます。最後に、眼球を30% sucrose溶液に入れ、4°Cで一晩静置します。翌日、眼杯をcryo-matrixなどの包埋樹脂で包埋し、凍結させます。その後、クリオスタットを用いて10 micronの切片を作成し、凍結組織用スライドグラスに貼り付けます。次に、スライド上の切片を界面活性剤で5分間透過処理します。その後、PBSで2回短時間洗浄します。続いて、眼球組織を室温で1時間ブロッキングします。網膜のフラットマウントを行う際は、摘出した眼球を4%パラホルムアルデヒドで15〜30分間固定し、解剖しやすくします。GFPの蛍光を保持するためには、この固定および解剖後の固定を適切に行うことが極めて重要です。固定後15〜30分以内に眼球を解剖し、角膜と水晶体を除去します。鋸歯縁と視神経の周囲を切除し、網膜を網膜色素上皮および強膜から分離します。解剖後、網膜を4% Para formaldehydeにさらに30分間浸し、組織および導入された網膜細胞内の蛍光タンパク質を固定します。固定後、検体をpH 7.4の滅菌PBSで5分間洗浄します。次に、PBSをブロッキングバッファーに交換し、網膜を室温で4時間、または4°Cで一晩インキュベートします。標識ステップとして、サンプルをブロッキングバッファーで希釈した一次抗体とともに、室温で4時間または4°Cで一晩インキュベートします。一次抗体を適用した後、組織をPBSで3回洗浄し、次いでブロッキングバッファーで1:500に希釈したAlexa Fluor結合抗体中で組織をインキュベートします。凍結切片の場合は1時間、フラットマウントの場合は2時間インキュベートします。室温で、遮光して行ってください。二次抗体を適用した後、前述と同様にPBSで3回洗浄して除去します。次に、網膜にリリーフカットを施し、光受容体または網膜神経節細胞のいずれかが上を向くようにして、ガラススライド上に平坦に固定できるようにします。水溶性の封入剤を塗布し、カバーグラスをかけます。スライドは、共焦点顕微鏡での撮像まで4 °Cで保存可能です。まず、血中AAV粒子のポジティブコントロールを作成します。最初に、AAVを注入する前に10～20 µLの血液サンプルを採取します。次に、麻酔後、100 µLのウイルスストック溶液を血流に注入します。血流に物質を注入するより簡単な方法は、陰茎静脈への注入です。このビデオキャプチャでは、注入の視覚的コントロールとして青色色素を注入しています。その後3日間にわたり、定期的に少量の血液サンプルを採取し、その後マウスを安楽死させます。組織サンプルから、市販のキットを用いてゲノムDNAを抽出します。抽出したDNAを用いて、GFPに対するプライマーペアでPCR増幅を行います。伸長時間を45秒、アニーリング温度を55 °Cとして、30サイクル実行します。SHH 10ベクターの導入パターンは、DP 71ヌルマウスで増加することが予想されました。動物モデルにおいて内境界膜の構造に摂動が見られた場合、DP 71ヌルマウスは網膜バリアが損なわれており、したがって有用な比較となります。DP 71ヌルマウスへのSHH 10の硝子体内注入は、ミュラーグリア細胞をより効率的に標的とします。これは、野生型コントロールと比較して、このトランスジェニックマウス系統において内境界膜の不安定化が起きていることを示しています。AAV5-GFPの注入によっても、内境界膜の透過性が証明されました。野生型マウスでは、AAV5の硝子体内注入は効果がありませんでしたが、DP 71ヌルマウスのように網膜バリアが損なわれているマウスでは、光受容器への遺伝子導入に非常に有効となりました。PCR解析により、DP 71欠損マウスの血液網膜関門はAAV粒子に対して選択性を維持していることが示されました。これは、硝子体内注射後に血液サンプルからAAVの痕跡が検出されなかったためです。このビデオを視聴することで、網膜の導入パターンや血流中へのAAV粒子の存在を解析し、内境界膜の完全性または血液網膜関門の透過性を試験するために、アデノ随伴ウイルスをどのように使用するかを十分に理解できるはずです。

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Medicine

医学

培養一次マウス胚線維芽細胞におけるシグナル伝達分子のアデノウイルス媒介遺伝子除去

このビデオは、蛍光カルシウムインジケーターを持つアデノ随伴ウイルスにマウスの中脳初代ニューロンを感染させる様子を示しています。インジケーターの蛍光は感染の成功を確認し、ニューロン感染のリアルタイムモニタリングを可能にします。...

マウス中脳初代ニューロンへの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスへの感染

出典: Grames, MS, et al.ラットへのアデノ随伴ウイルスの静脈内投与の方法とヒントと中枢神経系形質導入の評価J. Vis.

ラットモデルにおける組換えアデノ随伴ウイルスベクターの静脈内投与

網膜下注射は、マウスの眼の網膜色素上皮に効果的な遺伝子送達を行うための外科的技術です。...

マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射

ラットにおける広域中枢神経系遺伝子導入法を説明します。この例では目的は脊髄全体に影響を与える疾患を模倣するためです。広範な伝達は一時、周辺の管理からして中枢神経系治療用タンパク質を提供する使用できます。...

メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

ここでは、出生後のマウス網膜外植体における神経突起形態形成をタイムラプス共焦点顕微鏡により調べる方法を提示する。我々は、膜標的蛍光タンパク質を Cre依存的に発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた網膜細胞型の疎標識および取得およびそれらの微細プロセスのためのアプローチを説明する。...

遺伝子標的網膜細胞集団のスパースアデノ随伴ウイルス標識を用いた神経樹木化のタイムラプスイメージング

このプロトコルは、小さなAAV産生、ビトリアル内注射、遺伝子画像化、および遺伝子ゲノムDNA分離と共に、デジタル液滴PCR(dd-PCR)を用いてマウスの遺伝子のAAVトランスダクション効率を定量化する方法を示しています。...

マウスレチナにおけるAAVトランスダクション効率の定量化のためのデジタル液滴PCR法

本稿では、マウスの眼組織に対する有効なベクター送達法として、輸液/離脱シリンジポンプと気密着式シリンジとマイクロインジェクション針を組み合わせた注射システムを用いて結膜下注射を実証しています。この注射システムは、他の眼内投与経路にも適応可能である。...

小動物モデルにおけるアデノ随伴ウイルスベクターの結膜下投与

アデノ随伴ウイルスは浮遊細胞培養で産生され、二重ヨージキサノール密度勾配遠心分離によって精製されます。ウイルスの総収量を増やし、ウイルス沈殿のリスクを低減し、最終的なウイルス生成物をさらに濃縮するためのステップが含まれています。予想される最終力価は10,12 ウイルス粒子/mLに達し、前臨床 in vivo...

In vivoアプリケーションのためのヨジキサノール密度勾配遠心分離によるアデノ随伴ウイルスの浮遊培養産生と精製

この原稿では、最適化されたヘパリンベースのアフィニティークロマトグラフィー法を使用して、アデノ随伴ウイルスベクターを生成および精製するための詳細なプロトコルについて説明します。シンプルでスケーラブル、かつ費用対効果の高いアプローチを提供し、超遠心分離の必要性を排除します。得られたベクターは、高い純度と生物学的活性を示し、前臨床試験でその価値を証明しています。...

シングルステップおよび半自動ヘパリンアフィニティークロマトグラフィープロトコルによるアデノ随伴ウイルスベクターの単離

学ぶAAVを用いた網膜疾患モデルにおける血液網膜関門透過性と内境界膜の完全性評価法。GFPトランスジェンを含むウイルス粒子を注射し、in vivoイメージングと免疫組織化学で解析することで、網膜障壁の機能を詳細に調べる手法を解説します。

病における網膜障壁を研究するツールとしてアデノ随伴ウイルスを使用して、

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