Name: 多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: 学ぶ：レトロウイルス粒子を用いて蛍光タンパク質を哺乳類細胞に安定発現させ、遺伝バーコーディングを行う方法。FACSでクローン集団を分離し、フローサイトメトリーで解析することで、多重化ハイスループットアッセイを実現する。

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私たちは、レトロウイルス粒子の生産のためのフェニックスGPパッケージング細胞株を提供するためにスタンフォード大学から博士ギャリーノーランに感謝したいと思います。私たちは、TDトマトを提供するために、カリフォルニア州サンディエゴの大学の博士ロジャーツィンに感謝。我々はまた、彼らのサービスと助けをサンディエゴ州立大学フローサイトメトリーコアファシリティに感謝したいと思います。

遺伝バーコーディングのための哺乳動物細胞、ウイルス産生および形質導入の作製<ol><li> 10％ウシ胎児血清（FCS）を有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中にトランスフェクションの前に、プレート10cmプレート（または周囲の50〜60％コンフルエンシー）で2.5×10 6個の接着性細胞を一日。そのようなフェニックス-GP（ゲイリー·ノーラン、スタンフォード大学からの親切な贈り物）として選択したレトロウイルス生産用パッケージング細胞線に対する。 注：パッケージング細胞株を安定トランスにおけるレトロウイルス粒子形成のためのGagおよびPolタンパク質を発現する。細胞が健康と単層板に接着し、トランスフェクションの前にあることを確認してください。 </li><li> 24時間後、DNAトランスフェクション混合物を調製。 <ol><li>無血清DMEMの125μlに関心の蛍光タンパク質遺伝子を有するベクター（PCI-VSVG）及びトランスファーベクターの3μgの糖タンパク質3μgの水疱性口内炎ウイルスエンベロープを追加します。 2 mg / mlの（混ぜ、ポリエチ15μlのを追加）。 </li><li> 15分間室温で混合物をインキュベートし、滴ずつ細胞に添加する。 NOTE：ポリエチはポリプレックスを形成するためのトランスフェクション試薬として均質なDNA混合物に添加される。異なる蛍光タンパク質マーカーを担持するウイルス粒子を得るために、選択したマーカーでそれぞれ独立して、トランスフェクションを行う。レトロウイルス導入ベクターの長さは約7 KBで、10 KBを超える場合、パッケージ化することができないことに注意してください。 </li></ol></li><li> 37℃でプレートをインキュベートする。代わりに、30℃または32℃でのウイルスの生産地板を高めるために。 注：24時間後にトランスフェクション培地を新鮮な培地7mlを置き換えることができ、これは細胞の健康を改善することができるが、それは、上清中のウイルス負荷を減少させることができる。 </li><li> 48時間後にトランスフェクションを、0.45μmのポリテトラフルオロエチレンフィルターで上清を含むウイルス粒子とフィルタを集める。形質導入のために新鮮に収集したウイルス上清を使用してください。 OTHerwise -80℃でアリコートで上清を維持し、凍結融解を避ける。ウイルス力価は、それぞれの凍結融解サイクルで、おそらく最大50％に減少することを忘れないでください。 </li><li>非付着した場合付着する場合、またはすぐに形質導入​​する前に、形質導入の前に選択24時間のプレートの細胞株。シード2.0×10 5 10×3.0 5接着細胞（ここでのHuh 7.5.1およびHEK 293T）または5.0×10 5〜 1×10 6個の非接着細胞（ここでSupT1）あたり6ウェルプレートで。 注：細胞が形質導入時に60％程度の集密度を達成ので、特に接着細胞用ように、形質導入前に播種する細胞数を校正してください。 </li><li>播種した細胞に5μg/ mlのポリブレン（hexadimethreneブロマイド）を追加して、周りの20から40パーセントの感染（ここでは2ミリリットル）を得、以前に収集されたウイルス上清を追加します。 注：ソート任意subpopulatを増幅することを可能にするようにMOIまたは感染の割合は、主に任意である細胞のイオン。明らかに、感染のより高いレートが容易になり、増幅のプロセスをスピードアップ。 </li><li> 32℃で120分間1500×gで吊りバケットローターで遠心分離によって細胞を形質導入。インキュベーション前に新鮮な培地で非接着細胞を懸濁します。接着細胞の場合は、新鮮な培地24時間後伝達に交換してください。 注：これは、波及回避するために、パラフィルムで遠心分離に先立って、プレートをシールすることをお勧めします。遺伝的にバーコードのセルダイバーシティを増加させるために、（ステップ1.4から得られた）異なる蛍光タンパク質を担持するウイルス粒子を細胞に形質導入​​する。蛍光マーカーを選択するとき、彼らは計装と互換性があり、それらが識別可能な蛍光パラメータを持っていることを確認してください。 </li></ol>遺伝的にバーコード細胞の選択および増幅<ol><li>形質導入の割合率を定量するために、フローサイトメトリーにより、少なくとも72時間後に形質導入​​し、形質導入哺乳類細胞を分析する。陰性対照として比較可能な非形質導入細胞株を使用してください。 注：ソートが、個々のバーコードの細胞集団は、最初の形質導入の割合が高い率を精製するために使用されるように必要ではないが、増幅のプロセスをスピードアップする必要がある。 </li><li>目的のタンパク質を発現する細胞を得るために選択した細胞ソーターを利用する。 <ol><li>そのために、ゲートが適切に左右のチャンネルに設定されていることを確認。 <ol><li>負の人口は各蛍光軸に10 3の値以下になるように、そのためにはネガティブコントロールと同じナイーブ細胞株を使用し、パラメータ/チャンネル電圧を設定します。各蛍光チャンネルの陰性対照のそれの上に表示されるイベントなどの正の蛍光をゲーティングを決定します。 </li></ol></li><li>各楽器は変更になる場合がありますので注意してくださいとゲーティングを決定するための正しい電圧は、すべてのexpの中で不可欠ポジティブとネガティブコントロールを作る、それに応じて調整する必要がありますerimentalセットアップ。 <ol><li>この実験における蛍光検出のためにtdのトマトのためのeGFPのためのFITCチャネル（502ロングパスフィルタによって進行530/30バンドパスフィルタ）、PEチャネル（556ロングパスフィルタによって進行585/42バンドパスフィルタ）を使用するE2クリムゾンため、及びAPCチャネル（20分の660バンドパスフィルタ）。 注：E2クリムゾンが633nmのレーザーによって励起されなが​​ら488nmのレーザーのeGFPおよびtdのトマトを励起する。 </li></ol></li></ol></li><li> 100パーセントFCSの1ミリリットルと並びに15ミリリットルコニカルチューブ。 NOTE：一つは、直接個々のクローン（下記参照）のようなものを進めることができるように、蛍光細胞集団を選別する工程​​が必須ではない。選ばれた蛍光に基づいてタイトな集団をソートする個々のクローンの将来の選択のためのバックアップ集団を保証します。細胞の大集団が簡単に凍結され、その後、後の段階で解凍し、増幅することができるしながら、個々の細胞が倍で成長することが困難であることに留意してください。 </li><li> SP5分間32℃で524グラムで吊りバケットローター遠心機でソートされた集団ダウンで細胞をペレットに。再懸濁細胞集密度が少なくとも2日間増殖および分裂を可能にするために60％以下になるように、新鮮な培地、および再プレート細胞1ml中。 <ol><li>例えば、6ウェルプレート中のウェルあたり2mlの培地で約3×10 5細胞を6cmプレート中の培地2ml中で2×10 6細胞でプレート接着細胞。 （必要な場合、または指定した任意の媒体）非接着細胞用接着細胞およびRPMIためのDMEMを使用してください。増幅を可能にするために、数日間37℃のインキュベーター中で平板培養した細胞を配置します。 </li></ol></li></ol> 3.異なる強度での遺伝的にバーコード細胞のクローン集団を得る<ol><li>もともと形質導入細胞からクローン集団を取得し（ステップ1.7）、またはソートされた人口（ステップ2.3）から。 注：これは、すべての細胞の中で蛍光タンパク質発現の同等または類似のレベルを確保する集団内の（最大40％の平均蛍光強度の小さいCVとの緊密な集団）。 <ol><li>その目的のために、自動細胞沈着ユニット（ACDU）を有する96ウェルプレート中に並べ、単セル。興味のある集団に応じてソートするためのゲートを設定します。確認ゲートは、異なる蛍光強度でセルを選択する際に識別可能な集団を得るために離れて、少なくとも1対数スケールを設定している。ここに示す手順については、ステップ2.2で説明した1のように設定、実験サイトメトリ同じフローを使用しています。 </li></ol></li><li>少なくとも2週間、37℃のインキュベーター内の個々のクローンを増幅する。増幅の工程を経て成長した集団は、複数の個々の細胞から発生していないことを確認するために顕微鏡下で細胞を分析する。 注：ソーターは、平均してウェル当たり1セルを配置して、いくつかのウェルはまったく任意のセルを持っていない可能性がありながら、他の人が複数あることを覚えておいてください。 <ol><li> POことを確認するために、pulationは、1つの細胞から生じる、プレートと非常に穏やかである、ピペッティングにより井戸を乱すことはありません。顕微鏡下で、ウェルによって、プレートを観察します。 注：個々の細胞は時間にそれらが容易に認識できるであろう除し始めると、識別することは困難かもしれないが。 </li><li>エッジに沿って、多くの場合、細胞の塊」があることに注意してください。複数のクローン集団を観察することができるこれらのウェルを破棄し、1タイトな人口を持つものを残し。 注：それは増幅のためのより大きなプレートにそれらを転送することをお勧めします。 </li></ol></li><li>フローサイトメトリーによってそれらを分析することによって、推定上のクローン集団をスクリーニングする。実験のセットアップサイトメトリ同じ流れを利用し、陰性対照と比較します。 <ol><li>サンプルの唯一の割合を分析し、バックアップとして残りを保つ。人口の平均強度と気密性に基づいて、最もはっきりと独立した集団を選択してください。必要に応じてそれらを増幅またはで株式を凍結より長い時間液体窒素の短い期間のために-80℃で20％グリセロールを含む培地を凍結する。 注：「本当の」クローン集団は、非常にタイトな蛍光パターンを持っている必要があることを覚えておいてください。 </li></ol></li></ol> 4.（HTS）のハイスループットスクリーニングのための多重化機能を確認してください<ol><li>さらに、多重化フォーマットで利用できるように、必要な数の異なるクローン集団を組み合わせる。識別可能な吸収/発光スペクトルおよび/または異なる強度を有するクローンを選択してください。 96ウェルプレートフォーマットをHTSに適している、使用される場合、ウェル当たり200μl中50,000個の細胞を播種する。 注：細胞の数はあくまでも目安であり、細胞型に基づいて変更される可能性があり、それが付着しているか否かということを覚えておいてください。 </li><li>独立した確立された蛍光細胞株のそれぞれは、互いに区別できることを保証するために、フローサイトメトリーを用いて試料を分析する。分析の前に、負の準備単色パラメータと補正値を設定するように制御する。 注：明瞭にそれらを可能にする混合集団を区別するために、パラメータの設定は、さらに、多重化フォーマットで利用される。 </li></ol> 5.選択した生物学的応用に遺伝的にバーコード付き細胞株を適応<ol><li> Stolp ら 、ここで説明したように、任意のアッセイ要素を含むウイルス粒子を確立し、遺伝的バーコードの細胞株を形質導入。、2013 59。選択したアッセイは、追加および識別可能な蛍光チャネルを占有する必要があることを覚えているので、それが適切なバーコード化細胞株に転送される。 注：各バーコード細胞株は、異なるアッセイを負担することができます。 </li><li>アッセイの要素を含むもののソート遺伝的に蛍光バーコード細胞。 注：アッセイ要素はfの（融合または内部リボソーム侵入部位を介して）タグまたは蛍光タンパク質に結合操作することができるまたはウェスタンブロッティングを通じて直接的な検出は、フローサイトメトリーまたは顕微鏡。このプロトコルで利用されるシステムは、HA単独エピトープ表面発現に依存している、または追加のFLAGエピトープ発現と。 <ol><li> HAとAPC-、蛍光結合した抗体を用いたアッセイを含むクローン集団を染色する。その後、抗FLAGおよびFITC結合抗体染色とのクローン集団を分析。 </li><li>アッセイをバックトラッキングするには明確な遺伝的にバーコードの細胞株は区別することができる適切なチャネルで集団を、分析したり、「復号」。ここで、tdはトマトの検出のためのPEチャンネルで分析することにより、基板の性質を復号する。 </li></ol></li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

ここでは、2つのよく確立された手順がまとめられました。レトロウイルス技術、フローサイトメトリーを用いて蛍光タンパク質を検出することにより遺伝子工学。ユニークな細胞株の生産のための蛍光タンパク質ベースの遺伝的バーコードは、多重化されたアプリケーションのための堅牢かつ簡単な方法を提供します。レトロウイルス技術による遺伝子操作されたバーコード細胞を生成する、最初は長いプロセスですが、一つは、一度、電池材料の信頼性と安定した供給源を確立し、取得することができます。この技術の性質は、一貫して、自分の本当の識別可能なbiosignatureなって安定した蛍光特性を持つ遺伝的に操作された細胞株を生成します。 接着性および非接着細胞タイプの両方が、それらの物理的吸光/発光スペクトルに基づいて、容易に識別可能である蛍光タンパク質を利用してバーコードすることができる。これらには、そのようなCFP、mCherryをなどのタンパク質に限定されるものではない、E2クリムゾンとTDトマト。遺伝的にそれらの識別可能な蛍光タンパク質とバーコードと、それらは細胞集団のパネルを製造するために組み合わせることができる。...

そのような蛍光分光法などの技術、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーは、すべてが、蛍光に広く、生化学的、生物医学的、及び化学的用途において利用性を依存している。蛍光、内因性または標識を介して、タンパク質発現パターンおよびプロファイル、細胞の運命、タンパク質相互作用及び生物学的機能1-9の分析のために利用され、されているかどうかの生体分子相互作用及び立体配座の変化を検出するための蛍光/蛍光共鳴エネルギー移動を介して10-13。 オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質（GFP）14の単離以来、他の刺胞動物、特にサンゴからの追加の天然に存在する蛍光タンパク質の発見は、大部分が識別可能な励起/発光スペクトルを有する既存の蛍光タンパク質の数が増加している。一緒に彼らの遺伝子に変異を導入し15-19とこれら、HAVEさらに、顕微鏡を利用する研究者に利用可能な蛍光タンパク質の真のパレットを取得し、可能性を拡大し、フローサイトメトリーとその研究のために他の蛍光ベースの技術。 並行して、独立しているが、レトロウイルス技術の開発が大幅に哺乳動物細胞における異所性の遺伝情報20-23の安定な発現を促進した。その技術は、細胞型および組織24-28の広い数に、またはトランスジェニック動物の産生のために29〜31の蛍光タンパク質の遺伝子を導入するために使用されていることは驚くべきことではない。レトロウイルスの性質に続いて、異所性蛍光タンパク質の遺伝情報は、セル32のゲノム内に導入され、細胞がever&#39;は`蛍光性になる。このプロパティは、細胞の運命の、または細胞集団内の単一セルの追跡を可能にした。今蛍光細胞は、このようにアックイいます独自のbiosignatureを赤とバーコードのように定義することができます。そのユニークなbiosignatureは、他の細胞からそれを識別し、重要なのは、遺伝的に識別可能な吸収/発光スペクトルを有する異なる蛍光タンパク質を発現するように操作された細胞と区別します。そのような多能性33に向けて初期化因子の追跡などの生物学的用途、核小体局在34の解明のための核内要因の分析、転写の研究35またはニューロンネットワークアーキテクチャ36の研究のための神経細胞の遺伝的標識のための蛍光レポータープラスミドの構築、同じ実験のセットアップのために、異なる蛍光タンパク質遺伝子を悪用している多くのわずか4例です。 フローサイトメトリー広く、遺伝子発現、細胞周期、アポトーシス、及びホスホリルを介したシグナル伝達のような単一細胞レベルでの生物学的プロセスの分析に利用されているATION 37-43は、哺乳動物細胞中の蛍光タンパク質遺伝子の.theの安定な発現は、細胞分析38,44およびリガンド-受容体相互作用45のフローサイトメトリーの有用性が増強されている。拡張機能は、フローサイトメトリーは、ハイスループットおよびハイコンテントスクリーニング46のために広く利用される方法論になることを可能にした。できるカップルのプレートリーダーシステム、イメージングおよびフローサイトメトリー蛍光計とロボット技術の今拡張した数にもかかわらず、これらの強化された技術力を活用し、合うことができる実験的なデザインの欠如があるように思われる。 、高速で信頼性の高い、簡単かつ堅牢な細胞ベースの方法が大幅にさらにハイスループット能力を高める多重化アプリケーションのために必要とされる。これは、多重化された形式で、エンジニアリング、細胞ベースのアッセイは、ハイスループットスクリーニング39,47-50のパワーを高めることができる創薬の分野において特にそうである</sup&gt;。は、1つのサンプル中の同時分析を可能にするように多重化は、さらに高いスループット能力51-54を高める。蛍光遺伝子バーコードは、エレガント多重化を可能にするだけでなく、一度に操作、時間のかかるプロトコルの必要性を回避する、抗体、ビーズや汚れ39,52,55に伴うコストを削減し、高に必要なスクリーンの数を減らすことができるだけでなくスループットのアプリケーション。我々は最近、以前に別の臨床的に普及している変異体58とHIV-1プロテアーゼ活性56,57を監視するために開発されたアッセイを発現させることによって、生物学的用途のために、蛍光遺伝子バーコードを介して多重化を向上させることができる方法のレトロウイルス技術が記載されている。方法は、遺伝的に、蛍光バーコードのセルを選択し、増幅する方法に焦点を当て、より説明的な方法で説明した方法を異なる蛍光タンパク質および/または異なる蛍光intensitを発現するクローン集団のパネルを生産するさIES。それらの蛍光特性に基づいて識別可能な細胞集団のパネルは、異なる生物学的問題に取り組むための細胞ベースのアッセイと組み合わせて利用することができる多重化能力を高める。プロトコルはまた、例えば59のように、以前に研究室で開発されたセルベースアッセイの1を保有するバーコード細胞のパネルを設計する方法について説明します。このプロトコルは、このように遺伝的伝達のための十分に確立されたレトロウイルス/レンチウイルス技術、60,48サイトメトリー蛍光タンパク質またはフローのアプリケーションの価値を示すためではなく、多重化されたアプリケーションのための3つを組み合わせて強化する力を示すことを意図するものではない。

<table><tbody><tr><td>10mlシリンジ</td><td>BD</td><td>309604</td>ウイルス<td></td></tr><tr><td>0.45&microをろ過するために使用されます。ウイルス</td><td></td><td>DMEM</td><td></td></tr><tr><td>(Dulbeccoの変更されたワシ媒体)</td><td>コーニング</td><td>45000-304HEK</td><td>293T細胞のための細胞成長媒体</td></tr>をろ過するために使用されるポールコーポレーション4219 <tr><td>PEI(ポリエチレン)</td><td>poly科学</td><td>23966-2</td><td>2 mg / mlの濃度を使用</td></tr><tr><td>ハンギングバケツ遠心分離機(冷蔵)</td><td>エッペンドルフ</td><td>5805 000.017</td><td>のために使用されるスピン感染</td></tr><tr><td>PBS(リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td>細胞<td>の洗浄に使用される</td></tr><tr><td>ポリブレン(臭化ヘキサジメレン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td>ウイルス感染効率を高めるために使用されます。5 & マイクロで使用。g / ml濃度。</td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td>の<td>機器 細胞集団の選別に使用される</td></tr><tr><td>機器 FACSCanto</td><td>BD Biosciencesの</td><td></td><td>機器 細胞分析に使用される</td></tr>機器 <tr><td>Phoenix-GP</td><td>Gary Nolan</td><td></td><td>からのギフト レトロウイルス粒子の生成に使用される</td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td> 細胞増殖と<td></td>SupT1細胞<td>の選別に使用される</td><td>Mediatech</td> MT35015CV</tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1942</td><td>ヒト T リンパ芽球</td></tr><tr><td>HEK 293T 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>SV40 大型 T-抗原</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>コーニング</td><td>10-040-CV</td><td>SupT1 細胞用細胞増殖培</td></tr>地も含むヒト胚性腎臓細胞</tbody></table>

多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

蛍光タンパク質、蛍光色素、蛍光色素は、一般的に分子細胞生物学の分野に革命をもたらしました。特に、蛍光タンパク質とその遺伝子の発見により、局在化のためのタンパク質融合体のエンジニアリング、目的のタンパク質の転写活性化と翻訳の解析、または個々の細胞と細胞集団の一般的な追跡が可能になりました。蛍光タンパク質遺伝子とレトロウイルス技術の組み合わせにより、これらのタンパク質を哺乳動物細胞で安定的かつ信頼性の高い方法で発現させることがさらに可能になりました。ここでは、これらの遺伝子を利用して、細胞集団内の細胞に独自のバイオシグネチャーを与える方法を示します。バイオシグネチャーはレトロウイルス技術によって達成されるため、細胞は「無期限」にバーコード化されます。そのため、バーコード化された細胞の混合物内で個別に追跡し、より複雑な生物学的アプリケーションに利用することができます。細胞混合物中の異なる集団の追跡は、多数の標的に対する薬物の発見や異なるプロモーターの活性化プロファイルなど、マルチプレックスアプリケーションに最適です。このプロトコルでは、異なる遺伝的蛍光マーカーを使用してバーコード化された哺乳類細胞をエレガントに開発および増幅する方法、および一度に複数のマーカーを使用するか、異なる強度で1つのマーカーを使用する方法について説明します。最後に、このプロトコルでは、細胞を細胞ベースのアッセイと組み合わせてさらに利用し、マルチプレックスによる分析能力を高める方法を説明しています。

多重蛍光は、遺伝的に、個々のクローン集団が生成された後にのみ達成することができる生物学的用途の目的のために細胞をバーコード。バーコードの集団は最小限のスペクトルの重なりとの明確な異なる蛍光特性を持っているとき多重化は最も効果的である。哺乳類SupT1細胞のクローン集団を図1に示す例では、mCherryをシアノ蛍光タンパク質（CFP）とバーコードの細胞は容易に個々の蛍光特性を損なうことなく、同時に分析することができることを示している。この行列は、このようにまだ追加の利用可能なチャネルにおける読み出しとの多重化の生物学的用途のために使用可能である蛍光遺伝子組バーコード細胞のパネルを例示している。そのようなパネルを得るためにはそれが原因挿入EFへの集団内の蛍光強度の可変範囲につながるレトロウイルス技術の本質を、覚えておくことが重要ですfectsおよび/ ​​またはMOI。 図2のいずれか一方または強度の広い範囲（左パネル）における蛍光タンパク質の両方を発現する細胞におけるトマトまたはE2クリムゾン結果をtdとのいずれかを含むウイルス粒子を哺乳動物細胞の最初の形質導入を示してい...

緑色蛍光タンパク質遺伝子の発見以来、蛍光タンパク質は分子細胞生物学に影響を与えてきました。このプロトコルは、遺伝子工学による異なる蛍光タンパク質の発現が個々の細胞のバーコード化にどのように使用されるかを説明しています。この手順により、細胞混合物中の異なる集団を追跡できるため、マルチプレックスアプリケーションに最適です。

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

本実験の全体的な目的は、異なる蛍光読み取りに依存するマルチプレックス高スループット生物学的アッセイを強化するために、哺乳類細胞を蛍光バーコード化することです。これを達成するため、レトロウイルス粒子を用いて哺乳類細胞に蛍光タンパク質を安定的に発現させ、細胞をバーコード化します。次に、蛍光活性化細胞分取（FACS）を行い、クローン性のバーコード化集団を取得します。その後、クローン集団を増幅および統合し、フローサイトメトリーで解析することで、各集団が互いに区別可能であり、同時に使用できることを確認します。最後に、バーコード化された細胞株にタグ付きアッセイを導入します。タンパク質および生物学的活性は、バーコード用とは異なる蛍光チャネルを用いてモニタリングします。これらの結果は、ハイスループット環境におけるマルチプレックスアプリケーションにおいて、哺乳類細胞への蛍光バーコーティングが有用であることを示しています。抗体や染料の慎重なキャリブレーションを必要とする既存の手法に対する本技術の主な利点は、遺伝的にバーコード化された細胞株を一度構築すれば、それ以上の操作を必要としない点にあります。また、目的のタンパク質が長期間にわたって発現するため、生物学的な適応に関するさらなる研究に利用可能です。蛍光遺伝子バーコード化細胞株を表面アッセイと組み合わせることで、ハイスループット形式で生物学的機能や影響を独立して調査することが可能になります。本例では、異なるウイルス基質の切断をマルチプレックスでモニタリングするために、蛍光遺伝子バーコーティングを使用します。このアッセイは、切断に関与する機構の調査や、ハイスループットな創薬研究にさらに活用することが可能です。トランスフェクションの前日に、10 cmプレートに2.5 × 10⁶個のPhoenix GP細胞を、10% FBS含有DMEMで播種します。このパッケージング細胞株は、トランスでのレトロウイルス粒子の形成に必要なgagおよびpoleタンパク質を安定的に発現しています。トランスフェクション当日には、明視野顕微鏡を使用して細胞を確認してください。トランスフェクションに使用するには、細胞が健全であり、プレート上に単層で接着している必要があります。次に、無血清DMEM 125 µLを用いてDNAトランスフェクション混合液を調製します。3 µgの水疱性口炎ウイルス外膜糖タンパク質ベクター（P-C-I-V-S-V-G）と、目的の蛍光タンパク質遺伝子を搭載したトランスファーベクター 3 µgを加え、さらに15 µLのポリエーテルアミン・トランスフェクション試薬を添加して混合し、異なる蛍光タンパク質マーカーを保持するウイルス粒子を得ます。任意のマーカーを用いて、それぞれのトランスフェクションを独立して行います。各混合物を室温で15分間インキュベートした後、混合物を細胞に滴下してトランスフェクションを行います。その後、プレートを37 °Cでインキュベートします。任意で、24時間後に培地を7 mLの新鮮な培地に交換します。これにより細胞の状態は改善される可能性がありますが、上清中のウイルス量（viral load）が減少する可能性があります。トランスフェクションの48時間後に、ピペッターを使用して、ウイルス粒子を含む上清を10 milliliterのシリンジに移します。0.20 micromolarのポリテトラフルオロエチレンフィルターを取り付け、プランジャーを押し下げて、ろ液を2 milliliterのマイクロ遠心チューブに分注します。直ちに使用するための2 mL分のアリコートを分けておきます。残りのウイルス上清とアリコートを氷上に置き、使用するまで-80 °Cで保存します。導入の24時間前に、6ウェルプレートの各ウェルに2.0～3.0 × 10⁵個の接着細胞を播種します。ここでは293T細胞を使用します。翌日、接着細胞に導入を行うため、プレートから既存の培地を除去します。 previously collected viral sine 2 mLに、5 µg/mLのpoly brainを加え、その混合液を細胞に注意深く添加します。プレートをparfumで密封した後、吊り下げ式のバケットにプレートを配置します。32 °Cで1500 ×gにて120分間遠心分離します。遠心後、細胞を37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。24時間後、少なくとも72時間は細胞培地を交換してください。導入後、導入細胞をフローサイトメトリーで解析し、導入率（％）を定量します。まず、陰性対照として同等の非導入細胞株を用い、適切なチャネルでゲートが正しく設定されていることを確認してください。各関心のある蛍光軸において、陰性集団が10³以下の値になるようにチャンネル電圧のパラメーターを設定します。次に、陰性コントロールよりも外側に現れるイベントを、陽性蛍光のゲートとして設定します。その後、導入細胞を用いて、特定の蛍光チャンネルにおける陽性率を決定します。細胞を100% FBSを1 mL含む15 mLコニカルチューブに分取します。その後、分取した細胞集団をハンギングバケットを用いて遠心分離します。32 °Cで5分間、524 ×gで回転遠心分離機にかけます。遠心分離後、細胞を1 mLの新鮮な培地で再懸濁し、6 cmプレート上の2 mLのDMEMに2 × 10⁶個の細胞を播種します。この濃度では、コンフルエンスは60%未満となり、少なくとも2日間は増殖と分裂が可能です。細胞を37 °Cのインキュベーターに数日間置き、増幅させます。クローン集団は、最初に導入された細胞、またはソートされた細胞のいずれからでも作製できます。この段階で、個々のクローンではなく、選択した蛍光に基づいたタイトな集団をソートすることで、将来の選択に向けたバックアップ集団を確保できます。必要に応じて、目的の集団に合わせてソート用のゲートを設定し、ゲートの間隔が少なくとも1ログスケール離れていることを確認してください。自動細胞分取装置を用いて識別可能な集団を得るには、単一細胞を96ウェルプレートにソートします。この際、1ウェルあたり平均1個の細胞が分取されることに注意してください。ウェルによっては細胞が含まれていないものや、複数の細胞が含まれているものがあります。ソーティング後、個々のクローンを増殖させるため、細胞を37 °Cで少なくとも2週間インキュベートします。定期的に顕微鏡で細胞を観察し、増殖している集団が複数の細胞からではなく、単一の細胞に由来していることを確認してください。また、2週間経過した後に細胞が過成長しないようにしてください。推定クローン集団をフローサイトメトリーでスクリーニングし、陰性対照集団と比較します。真のクローン集団は、非常にタイトな蛍光パターンを示すはずです。平均強度と集団の凝集度に基づき、最も明確に分離している集団を選択します。必要に応じて増幅させるか、短期間であれば10% DMSOを含む凍結保存液を用いて-80 °Cで、長期間であれば液体窒素中でストックを保存します。次に、クローン集団がマルチプレックス高スループットスクリーニングシステムで正常に使用できるかどうかを検証します。吸収・放出スペクトルが判別可能であるか、または強度が異なるクローンのセットを選択し、それらを単一のチューブにまとめて種細胞とします。合計した細胞 50,000 個を、添加剤入りDMEM 200 µLとともに、96ウェルプレートの各ウェルに個別のチューブから分注します。フローサイトメーターでのパラメータ設定および補正値（コンペンセーション）の設定に使用するための、ネガティブコントロールおよび単色コントロールを準備します。補正値を設定します。次に、サンプルを解析し、構築した各独立した蛍光細胞株が区別できることを確認します。バーコード化された細胞株を生体アプリケーションに適応させるには、まず、融合タンパク質として、または内部リボソーム進入部位（IRES）を介して、タグまたは蛍光タンパク質に結合するように設計されたアッセイ要素を選択します。Iresは、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、または顕微鏡観察による簡便な検出を可能にします。本手法で使用されるシステムは、HIVエンベロープタンパク質を細胞表面に発現させ、そのHAタグおよびflagタグを露出させる生物学的アッセイで構成されています。このアッセイ用タンパク質は、TD tomatoを発現するバーコード付き細胞において発現されます。タンパク質の切断は、FSE標識Anti-Flag抗体を用いた染色によってモニターできます。タンパク質が切断されていない場合は染色が見られますが、切断されると緑色の蛍光標識は消失します。バーコード化された細胞でバイオアッセイを確立するには、選択したアッセイ要素を含むウイルス粒子をそれらの細胞に導入します。選択した細胞にウイルスSUP natinを添加し、遠心分離を行う。次に、細胞を蛍光標識したanti HA抗体とともにインキュベートする。その後、バーコード化された細胞を分取し、ha陽性のアッセイエレメントを含む細胞を単離する。最後に、異なる基質を持つアッセイをそれぞれに含んだ、個別にバーコード化された細胞株を混合しました。この細胞混合物をAnti-FlagおよびZI結合抗体とともにインキュベートし、フローサイトメトリーで解析することで、タンパク質の切断が起こったかどうかを判定しました。これにより、個別の遺伝的バーコード化細胞株を区別できる適切なチャンネルで細胞集団を解析またはデコードし、アッセイを遡って追跡しました。TD-tomatoのPEチャンネルを用いて、次にfit channelでの解析により基質の性質を解読し、陽性集団を明らかにすることで、分泌経路における細胞表面発現タンパク質の切断をアッセイします。Sub T1細胞に蛍光バーコードを導入してTD-tomatoを発現させ、強度の異なる3つの集団に分取しました。その後、各集団に異なるレトロウイルスを導入し、野生型HIVエンベロープタンパク質、変異型HIVエンベロープタンパク質、またはデングウイルスの発現を誘導しました。FlagおよびHAタグで挟まれたPRM境界タンパク質。導入細胞を抗HA抗体および抗Flag抗体とともにインキュベートした。エンジニアリングされたアッセイタンパク質の存在を確認するために抗HA染色を行い、切断されたかどうかを判定するために抗Flag染色を行った。染色していない混合集団をフローサイトメトリーで解析したところ、クローン集団はTDトマトバーコードに基づいて区別できましたが、FLAGチャネルでは区別できませんでした。対照的に、同じ集団をFLAG抗体で染色したところ、1つの集団がFLAG陽性となりました。バーコーディングに基づき、この集団は変異型HIVエンベロープ基質を持つ集団であると容易に特定できます。これで、レトロバルブ技術をフローサイトメトリーと組み合わせて活用する方法について、十分に理解できたはずです。蛍光遺伝的バーコード細胞株を構築し、4つの生物学的アプリケーションをマルチプレックス形式で実施することが可能になります。蛍光遺伝的バーコード細胞をマルチプレックス形式の細胞ベースアッセイと結合させる能力は、ハイスループット能力を飛躍的に向上させます。細胞株を構築した後は、それらを凍結保存することが重要です。その後、定期的に解凍して再解析を行い、再び凍結保存します。蛍光遺伝子バーコード化細胞株の作成には当初時間がかかるかもしれませんが、一度確立すれば、今後の応用の再現性と堅牢性が劇的に向上します。

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