多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング

次の実験の全体的な目標は、哺乳類細胞を蛍光でバーコード化して、異なる蛍光読み出しに依存するマルチプレックスハイスループット生物学的アッセイを強化することです。そのために、レトロウイルス粒子を用いて、哺乳類の細胞で蛍光タンパク質を安定して発現させ、それによってそれらをバーコード化します。次に、蛍光活性化細胞の選別を行い、クローンバーコード化された集団を得る。

次に、クローン集団を増幅、結合、およびフローサイトメトリーで分析して、互いに区別できること、したがって同時に使用できることを確認します。最後に、バーコード化された細胞株にタグ付きアッセイを形質導入します。タンパク質と生物学的活性は、バーコード化されたチャネルとは異なる蛍光チャネルを使用して監視されます。

この結果は、哺乳類細胞の蛍光バーコーティングが、ハイスループット環境でのマルチプレックスアプリケーションに適していることを示しています。この手法は、抗体や色素の慎重なキャリブレーションを必要とする既存の方法と比較した場合の主な利点として、遺伝的にバーコード化された細胞株が確立されると、それ以上の操作が不要になり、目的のタンパク質が長期間発現するため、生物学的適応にさらに使用されることです。蛍光性遺伝子バーコード細胞株と表面アッセイを組み合わせることで、生物学的機能や効果をハイドロスループット形式で独立して研究することができます。

この例では、蛍光遺伝子バーコーティングを使用して、さまざまなウイルス基質のマルチプレックスの切断を監視します。このアッセイは、切断に関与する機械を調査し、ハイスループットの創薬にさらに活用できます。トランスフェクションの前日に、10の2.5倍の10センチメートルプレートを10%FBSのDMEMで6番目のPhoenix GP細胞に播種します。

このパッケージング細胞株は、トランス状態でのレトロウイルス粒子形成のためのギャグタンパク質とポールタンパク質を安定して発現します。トランスフェクション当日は、明視野顕微鏡を使用して細胞を検査します。細胞は健康で、トランスフェクションに使用される単層でプレートに接着する必要があります。

次に、DNAトランスフェクション混合物を125マイクロリットルの無血清に調製します。DMEMです。3マイクログラムの水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質ベクターP-C-I-V-S-V-G、および目的の蛍光タンパク質遺伝子を運ぶ3マイクログラムのトランスファーベクターを加え、15マイクロリットルのポリエーテルアミントランスフェクション試薬を加えて混合し、異なる蛍光タンパク質マーカーを持つウイルス粒子を得ます。各トランスフェクションは、選択したマーカーを使用して個別に実施します。

インキュベーショントランスフェクション後、各混合物を細胞に添加することにより、室温で15分間インキュベートします。次に、Dropwiseでプレートを摂氏37度でインキュベートします。必要に応じて、24時間後に、培地を7ミリリットルの新鮮な培地と交換します。

これにより細胞の健康状態が改善する可能性がありますが、上清中のウイルス量が減少する可能性があります。トランスフェクションの48時間後、ピペッターを使用して、ウイルス粒子を含む上清を10ミリリットルの注射器に移します。0.20マイクロモルのポリテトラフルオロエチレンフィルターを装備し、プランジャーを押して濾液を2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに分注します。

すぐに使用できるように、2ミリリットルのアリコートを取っておきます。残りのウイルススナットおよびアリコートを氷上に置いて、形質導入の24時間前に使用するまで摂氏マイナス80度に移し、6ウェルプレートの各ウェルでシードし、2.0〜3.0倍10〜5番目の接着細胞をここで2、9、3T細胞を翌日使用する。接着細胞を形質導入するには、既存の培地をプレートから取り出します。

以前に採取したウイルスサインの2ミリリットルにポリブレイン1ミリリットルあたり5マイクログラムを加え、混合物を細胞に慎重に加えます。プレートをパルファムで密封します。次に、プレートを吊り下げ式バケツに入れます。

Gの1500倍で32°Cで120分間遠心分離します。スピン後、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。24時間後、少なくとも72時間細胞を培地に交換します。

形質導入後。形質導入細胞をフローサイトメトリーで解析し、形質導入率を定量化する準備をします。まず、同等の非形質導入細胞株をネガティブコントロールとして使用し、ゲートが正しいチャネルに適切に設定されていることを確認します。

パラメータのチャネル電圧を、負の母集団が対象の各蛍光軸で 10 から 3 番目の値より小さくなるように設定します。次に、ポジティブ蛍光のゲートを、ネガティブコントロールのゲートを超えて現れるイベントとして設定します。次に、形質導入した細胞を使用して、特定の蛍光チャネルの陽性率を決定します。

細胞を100%FBSの1ミリリットルを含む15ミリリットルの円錐管に選別します。次に、吊り下げられたバケツでソートされた母集団をスピンダウンします。ローターをGの524倍、摂氏32度で5分間遠心分離します。

スピン後、細胞を1ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁し、次に6センチメートルプレート上のDMEMの2ミリリットル中の6つの細胞に10回2回播種します。この濃度では、合流点は60%未満であり、少なくとも2日間は成長と分裂が可能になります。細胞を摂氏37度のインキュベーターに数日間置き、増幅の時間を確保します。

クローン集団は、最初に形質導入された細胞または選別された細胞のいずれかから生成できます。この段階では、個々のクローンではなく、選択した蛍光に基づいてタイトな集団を選別することで、将来の選択のためのバックアップ集団を確保できます。必要に応じて、関心のある集団に従ってソートするためのゲートを設定し、ゲートが少なくとも1つの対数スケール離れて設定されていることを確認してください 自動細胞沈着ユニットを使用して識別可能な集団を取得するには、単一の細胞を96ウェルプレートにソートします ウェルごとに平均1つのセルが存在することに注意してください。

一部のウェルにはセルがない場合もあれば、複数のフォローがある場合もあります。選別し、細胞を摂氏37度で少なくとも2週間インキュベートします 個々のクローンを増幅します。顕微鏡下で細胞を定期的に検査し、増加する集団が複数の細胞からではなく、個々の細胞から発生していることを確認します。

また、2週間が経過した後に細胞が生い茂らないように注意してください。フローサイトメトリーにより推定クローン集団をスクリーニングし、ネガティブコントロール集団と比較します。真のクローン集団は、非常にタイトな蛍光パターンを持つべきです。

母集団の平均強度と逼迫性に基づいて、最も明確に分離された母集団を選択します。必要に応じて増幅するか、ストックをマイナス80°Cの10%DMSOを含む冷凍培地で短時間、または液体窒素でより長く保存します。次に、クローン集団をマルチプレックスハイスループットスクリーニングシステムでうまく使用できるかどうかをテストします。

識別可能な吸収、発光スペクトルおよび/または異なる強度を有するクローンのセットを選択し、それらを単一のチューブシードに結合する。フローサイトメーターでパラメーターと補正値を設定する際に使用するネガティブカラーコントロールと単色コントロールを準備します。

報酬値を設定します。次に、サンプルを分析して、独立した確立された蛍光細胞株のそれぞれを区別できることを確認します。バーコード付き細胞株を生物学的アプリケーションに適合させるには、まず、融合として、または内部リボソームエントリー部位を介してタグまたは蛍光タンパク質に結合するように操作されたアッセイエレメントを選択します。

IRESは、ウェスタンブロッティングフローサイトメトリーまたは顕微鏡法による簡単な検出を可能にします。ここで利用されるシステムは、HIVエンベロープタンパク質が細胞表面に発現し、そのHAタグとフラグタグを露出させる生物学的アッセイで構成されています。アッセイタンパク質は、TDトマトを発現するバーコード付き細胞で発現します。

タンパク質の切断は、FSE標識抗フラグ抗体で染色することでモニターできます。タンパク質が切断されていないときは染色が見られますが、タンパク質が切断されると、緑色の蛍光標識は明らかではなくなります。バーコード付き細胞で生物学的アッセイを確立するには、選択したアッセイ要素を含むウイルス粒子で細胞を形質導入します。

ウイルスSUPナチンを任意の細胞に添加し、遠心分離により遠心分離します。次に、蛍光標識した抗HA抗体で細胞をインキュベートします。次に、バーコード化された細胞を選別して、ha陽性のアッセイ要素を含む細胞を分離します。

最後に、異なるバーコード付き細胞株を組み合わせました。それぞれに異なる基質を持つアッセイが含まれています。細胞の混合物をAnti-FlagおよびZI標識抗体とインキュベートし、フローサイトメトリーで分析してタンパク質の切断が発生したかどうかを判断し、アッセイを追跡し、ここで異なる遺伝的にバーコード化された細胞株を区別できる適切なチャネルの集団を分析または解読します。

次に、TDトマトのPEチャネルは、fiteチャネルで分析することにより基質の性質を解読し、分泌経路で表面発現タンパク質の切断をアッセイするための陽性集団を明らかにします。TDトマトを発現するために蛍光バーコード化され、異なる強度で3つの集団に選別されたSub T 1細胞。次に、各集団に異なるレトロウイルスを形質導入して、野生型HIVエンベロープタンパク質、変異型HIVエンベロープタンパク質、またはデングウイルスの発現を誘導しました。

PRM境界タンパク質、それぞれにフラグタグとHAタグが並んでいます。形質導入した細胞を抗HA抗体および抗Flag抗体とインキュベートしました。遺伝子組み換えアッセイタンパク質の存在を確認するために抗HA染色を行い、切断されたかどうかを判断するために抗フラッグ染色を行いました。

未染色の複合集団をフローサイトメトリーで解析したところ、クローン集団はTDトマトバーコードに基づいて区別できましたが、ファイトチャネルは区別できませんでした。対照的に、同じ集団をflag fite抗体で染色すると、1つの集団がflaggに対して陽性でした。バーコードに基づいて、この集団は、変異型HIVエンベロープ基質を持つ集団として容易に識別できます。

さて、レトロバルブ技術をフローサイトメトリーと一緒に利用する方法について非常によく理解しているはずです。蛍光遺伝的にバーコード化された細胞株を確立するために、マルチプレックス形式での4つの生物学的アプリケーション、蛍光遺伝的にバーコード化された細胞と細胞ベースのアッセイをマルチプレックス形式で結合する能力は、ハイスループット能力を劇的に向上させます。細胞株が生成されたら、それらを凍結することが重要です。

その後、定期的に解凍し、再分析して、再び解放します。蛍光性遺伝子バーコード細胞株の作製は、最初は時間がかかるかもしれませんが、一度確立されると、将来のアプリケーションの再現性と堅牢性が劇的に向上します。