ナの機能的特徴 ⁺ / H ⁺交換器

次の実験の全体的な目標は、細胞内で発現するナトリウムプロトン交換体の活性を測定することです。これは、まず、細胞内ナトリウムプロトン交換体を原形質膜で発現する細胞をプロトン殺傷選択によって選択することによって達成されます。第2のステップとして、選択した細胞を酸性化し、次に細胞内のpH回復を測定して、細胞のナトリウムプロトン交換活性を確認します。

次に、イオン輸送の高速速度論を測定して、輸送された陽イオンと阻害剤の親和定数を決定します。最終的には、選択した体細胞の細胞内pHの変化と高速動態をモニタリングすることで、細胞内タンパク質交換の機能的特性評価が可能になります。この手法は、変異型トランスポーターの発現や細胞ごとの利用など、既存の方法に比べて、原形質膜で白色タイプの細胞内トランスポーターを発現させることができ、その機能を直接測定できるという大きなメリットがあります。

手順を実演するのは、私の研究室の研究科学者であるマロリー博士の詩人で、陽子線殺傷手順を開始します。まず、目的の細胞内ナトリウムプロトン交換体を発現する細胞を、摂氏37度のローディング溶液と二酸化炭素を含まないインキュベーターで1時間インキュベートします。次に、ローディング溶液を吸引し、細胞を新鮮な培地で2回洗浄します。

2回目の洗浄後、培地を吸引し、二酸化炭素を含まないインキュベーター内の回収溶液で細胞をインキュベートします。さらに1時間後、回収培地を通常の培地と交換し、標準的な培養条件下で細胞を増殖させます。この選択サイクルを週に2回繰り返し、安定したクローンが出現して細胞の細胞内蛍光pHをイメージングします。

まず、倒立顕微鏡と高感度ビデオカメラ、450ナノメートルと490ナノメートルの狭帯域干渉フィルター、励起用の適切な石英減光フィルターを組み合わせたイメージングセットを装備しました。可能であれば、適切なフィルターと照明条件のセットを使用して、チャネル 1 と 2 に同等の蛍光値を設定し、比率が 1 に近づくようにして、ナトリウムプロトン交換体の前方活性を測定します。次に、アンモニウムローディング溶液中で1時間のインキュベーションで細胞を酸性化します。

インキュベーションの最後の5分間に二酸化炭素が存在しない場合、細胞をレシオメトリックのpH感受性蛍光ダイで染色します。インキュベーション期間の終わりに、アンモニウムローディング溶液で細胞をすすぎ、細胞外プローブを排除し、染色した細胞を顕微鏡にマウントします。必要に応じて、蛍光値が測定される関心領域を選択します。

次に、いくつかの画像を記録してベースラインを確立し、細胞にRIN溶液を灌流して蛍光の低下を開始します。pHが安定したら、目的の溶液で細胞を精査し、リチウム水素、ナトリウム水素、またはカリウム水素交換によって媒介されるpH回復速度を測定します。次に、塩化カリウムとゲリンを補給したヒッピーの溶液で細胞を熟読します。

次に、画像から蛍光測定値を収集し、データをテキスト形式でスプレッドシートプログラムにエクスポートして、ナトリウムプロトン交換体の初期速度を測定します。セブンスでは、リチウムの高速取り込みにより、先ほど示したように、イモジウムローディング技術により細胞とマルチウェルプレートを酸性化します。次に、先ほど示したようにプレートを2回すばやくすすぎます。

次いで、取り込み期間の終わりに約1分間または以下の目的の陽イオンまたは阻害剤の所望の濃度を1〜10マイクロモルのリチウムを含む取り込み溶液中で細胞をインキュベートし、取り込み培地を慎重に取り出し、リチウムの流出を防ぐために合計10秒未満で氷冷PBSで細胞を4回迅速に洗浄し、その後、細胞を250マイクロリットルの25%硝酸で溶解させる。まあ、少なくとも1時間は。インキュベーションの終わりにピペットチップの端で各ウェルをこすり落とし、各ウェルから懸濁液を新しいマイクロ遠心チューブに移します。最後に、室温で15, 000 Gで5分間サンプルを遠心分離し、細胞の破片を除去し、原子吸光分光法でSNATのリチウム含有量を測定します。

製造元の指示に従って、プロトン殺傷選択はアンモニウム弱塩基の拡散に基づいています。例えば、細胞膜に機能的なナトリウムプロトン交換体を発現していない細胞は、中性のpH値を回復することができず、したがって、選択サイクルを繰り返した後、この代表的な画像に見られるように、扁平な形状と粒状のサイトゾルを有する典型的な酸性化の様相を示す、完全かつ安定的に生存する細胞である。しかし、酸性化は、ここで見られるように個々の細胞クローンを形成し、原形質膜で発現する細胞内ナトリウムプロトン交換体の活性およびイオン選択性は、イモジウム負荷酸性化後のこれらのグラフで観察されたように、さまざまな実験条件下で誘発される細胞内pHの変化を測定することによって特徴付けることができる。

酵素動態に関しては、初期取り込み速度に対する用量応答をさらに使用して、基質の親和定数値および阻害剤の阻害定数値を導出することができる。実際、トランスポーターの興味深い特徴は、異なるカップリングカチオンが輸送をめぐって競合し、この手順に従って、この図に示すように、リチウム取り込みとの競合によってナトリウムの親和定数を測定する可能性をもたらすことです。RNAサイレンシングと組み合わせた細胞表面BioInnovationなどの他の実験は、目的のトランスポーターが実際に原形質膜で発現していることを検証するために実行できます。