Name: ナの機能的特徴 + / H +交換器 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶナトリウム・プロトン交換体の機能解析法。プロトンキリング選択で細胞を選別し、細胞内pH回復と高速イオン取り込みを測定することで、輸送体のイオン選択性と動的パラメータを決定する手法を解説します。

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著者は、ここで説明されている測定値を考案し、改善したpHとイオン輸送に取り組んでいる科学コミュニティのすべてのメンバーに深く感謝しています。彼らは特に、ここで使用されたH +殺人選択技術を考案したジャック・プイセギュール博士に感謝しています。彼らは、ニース上智大学アンティポリス、CNRS、ANR(JCJC SVSE1 NHEint)、およびICST Labexの支援に感謝しています。

1. H +キリングセレクション<ol><li>細胞株<ol><li>安定的にNHE欠損細胞をトランスフェクト（ 例えば 、CCL39由来PS120細胞株16）線維芽細胞株で効率的なトランスフェクション収率及び選択を生成する哺乳動物発現ベクターおよびトランスフェクション方法の任意の組み合わせを使用して。 注：長年、リン酸カルシウム沈殿19が良いトランスフェクション収率で使用された。これは、リポフェクタミン2000などの市販の試薬によって、より最近で置換された、トランスフェクションは、製造業者の説明書に従って行われる。 </li></ol></li><li>ソリューション<ol><li>以下のように説明する3つの滅菌溶液を準備します。ろ過（0.22μm）とすることで、これらのソリューションを滅菌する。 <ol><li> 50mMのNH 4 Clを、70 mMの塩化コリン、5mMの塩化カリウム、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMのglのからなるNH 4 +のロード液（pH7.4）を調製ucoseとpH7.4の15mMのMOPS。 </li><li> 120 mMの塩化コリン、5のKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、pH7.0の5 mMグルコースおよび15 mMのHEPESから成るすすぎ液（pH 7.0）を準備します。 </li><li> pH7.4の120mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPESからなる回収液（pH7.4）を調製。 </li></ol></li></ol></li><li>選択を開始する前に、外部タンクのない追加のCO 2と共に37℃で使用することができる細胞培養インキュベーターを得る（CO 2と呼ばれる- 「フリー」インキュベーター）、5％とCO 2を損なうことがバッファリングをもたらす酸性化。約2×10 8細胞（典型的には約20コンフルエント100mmのプレート）に関心までのNHEを発現する細胞株を増幅する。 </li><li> H +手続きを殺す： <ol><li> 3で、ローディング溶液中で1時間関心の細胞内NHEを発現する細胞をインキュベートCO 2を含まないインキュベーターで7°C。 </li><li>ローディング溶液を吸引した後、上記の-リンス溶液中で二度、それらをすすぐ。酸性化が生成されます急なNH 4 +勾配の作成 ​​を損なう残留細胞外NH 4 Cl のを排除するために効率的にこの手順を実行します。 </li><li>吸引によるすすぎ媒体を除去し、CO 2フリーのインキュベーター中で37℃で再び回復ソリューションで1時間細胞をインキュベート。 </li><li>定期的な培養液（7.5％FCSを含む一般的にDMEM）を使用してリカバリメディアを交換し、（5％CO 2、95％空気の加湿雰囲気中で37℃）、標準的な培養条件で細胞を増殖させる。 </li></ol></li><li>安定なクローンが出現するまで、週2回の選択のこのサイクルを繰り返します。 注：細胞培養​​および選択条件に関する特別な注意を払ってください。仕事の月数がoになりやすい任意の汚染によって台無しにすることができます文化と繰り返し、細胞操作の長い期間の後ccur。 <ol><li>ここでは、クローンを増幅し、個別にさらにセクション2-3で説明し、それらを特徴づける、または特性化の前に細胞集団を生成するために、それらを一緒にプールするかどうかを選択します。 </li></ol></li><li>カウンターを選択する親の酸感受性表現型（ 図1B）に復帰した可能性があるものをすることによって酸性化耐性細胞を保持するために臨時の選択（約2週間に1回）を適用します。 </li></ol> 2.細胞内pH測定 2.1）蛍光性pHイメージング<ol><li> 490 nmで励起したときのpH感受性であり、製造者のプロトコルに従って、445 nmの等吸収点を有しているレシオメトリックpH感受性蛍光色素BCECF / AMを使用します。 <ol><li>また、製造者のプロトコルに従って他のpH感受性プローブ​​を、使用しています。 </li></ol></li><li> CON設定された撮影に使用します高感度ビデオカメラに接続された倒立顕微鏡のsisting。 450nmの励起に適した石英中性密度フィルタと対に490nmの狭帯域干渉フィルタと、このセットを装備する。 <ol><li>可能であれば比も両方λ1および/またはλ2のために、どちらが飽和または低すぎる設定されている基底蛍光値を避けるため1に近づくように、λ1とλ2のセットアップ同等の蛍光値にフィルタや照明条件の適切なセットを使用します。これは、その後、細胞内pHが変化しているものの、比率は検出されていない重要なアーティファクトをもたらすことができる。 注：このシステムは、適切な発光波長（BCECFための535 nm）における急速な灌流、タイムラプス2上記の波長で励起し、取得を有効にする必要があります。ソフトウェアは自動データ収集と保存を可能にしてシステムを装備。 </li></ol></li></ol> NHEフォワード活動の2.2）測定（の押出サイトゾルからのプロトン） <ol><li> NH 4 +のロード溶液中で1時間のインキュベーションによって細胞を酸性CO 2の非存在下で（ステップ1.4参照）。 </li><li>最後の5分間溶液にBCECF-AM（5μM最終濃度）を追加した後、細胞外のプローブを除去するためにNH 4 +ローディング溶液でそれをすすいでください。 </li><li>顕微鏡で細胞をマウントし、安定したベースラインを記録するために複数の画像を取る。リンス液（上記参照）を灌流する。これは、酸性化に対応する蛍光の低下をもたらす。 </li><li> pHが安定した後、リチウム+ / H +のNa + / H +またはK + / H +交換によって媒介されるpH回復速度を測定するために、下記の溶液のいずれかを灌流。各溶液をH +交換のために試験される潜在的結合カチオンを含んでいる。それらの一つは、輸送される場合、これはcorrespます495 nmでの蛍光増加をもたらす二の細胞内のpHの昇給へ： pH7.4の120mMのLiClを、5mMのKClを、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPES pH7.4で120mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPES pH7.4での125mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPES </li></ol> NHEリバース活動の2.3）測定注：ここでの原則は、膜貫通イオン性勾配を反転させることである。 <ol><li>測定前に、興味のある細胞内カチオンで細胞をロードする（下記参照）。 </li><li> （ステップ2.2.2を参照）BCECF / AMで5分間それらをインキュベートする。それらをすすぎ、ビデオ顕微鏡にマウント。 </li><li>ローディング溶液を灌流し、安定なベースラインを記録するために複数の画像を撮る。 </li><li>ベースラインが安定した後、画像セルが120メートルを含む細胞外酸性媒体で灌流されたpH変化Mの塩化コリン、5mMのKClを、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、pH6.5の5 mMグルコースおよび15 mMのMES。 </li><li> LiClをローディングのため、pH7.4の120mMのLiClを、5のKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースと15mMのHEPESからなる溶液中で2時間細胞をインキュベート。原子吸光分光法によって測定された細胞内のリチウムは、約60mMの値が得られる。 </li><li>のNa +をロードするために、1mMのウアバインの存在下で、pH7.4の120mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPESからなる溶液中で2時間細胞をインキュベートのNa / K ATPアーゼをブロックする。これらの条件において、細胞内のNa +濃度は、40mMの範囲である。 注：細胞質ゾルK +濃度が140 mMの範囲にあり、外側に指向K +勾配を達成するのは容易であるようにK +ローディングが不要である。 </li></ol> 2.4）データの処理と校正： 注：このステップでは、順方向および逆方向の測定値の両方に適用されます。 <ol><li>各実験の最後に、140ミリモルのKCl、20mMのHEPESおよび6.5と7.4の間のpH値に調整し、5μMナイジェリシンの溶液で細胞を灌流する。 </li><li>テキスト形式の下での画像（強度レベルを表すグレーレベル）と輸出から蛍光測定などのデータを収集し、スプレッドシートプログラムを用いて以下に説明するように扱う。 </li><li>個々のセルまたは次の式を使用して、関心領域のための細胞内pH値を計算する。 でpH = pKaは+（ログ（R-Rminを）/（R 最大 -R））×F 分（λ2）/ F MAX（λ2） </li><li> Fの分（λ2）/ FのMA×（λ2）実験を通して450 nmの蛍光の減少、その結果、プローブの漂白や漏れがあった場合の比率を使用してください。しかし、これは非常にまれにDESで使用される条件で観察されないcribed実験。 </li><li>較正データは、各pH測定の終了時に存在するように、対応する計算値を較正のために使用されるpH値と異なるかどうかをチェックする。それが事実である場合、次の手順を使用してキャリブレーションへのすべての実験的に決定されたpH値を調整します。 <ol><li>以下の商（Q、キャリブレーション値の間で測定された値/差と差）を計算します。計算値は、対応するキャリブレーション値と等しくなるように加算または減算することによって最終的な調整を行いますQ.によって全データセットを掛けます。 </li></ol></li></ol>ファストLi +の取り込みによるNHE7の初期速度の3測定<ol><li>マルチウェルプレート上の種子細胞（6ウェル-24）および上記または20に記載の交互ナイジェリシン/ウシ血清アルブミン（BSA）酸性記載NH 4 +ローディング技法のいずれかを使用して酸性化する。 </li><li&gt;の所望の量のために、上述したリンス液を用いて急速に二回、プレートを洗浄した後、（若干のKm値以下）1〜10 mMのリチウムを含有する取り込み溶液中で細胞をインキュベートし、カチオンおよび/または関心のある阻害剤の所望の濃度時間の。 </li><li>トランスポートが初期速度条件で動作することを保証するために短いと一貫性の取り込み期間（通常は1分以下）を維持します。また、取り込みのために使用されるすべてのソリューションが等張であることを確認してください。 </li><li>取り込み時間の終わりに、慎重に取り込み培地を除去し、氷冷リン酸緩衝食塩水（PBS）で細胞を4回洗浄する。 （そのうち4が理想的であるために10秒未満）リチウム流出を防ぐために可能な限り速く、これらの洗浄を行う。 </li><li>溶解する25％の硝酸のセル。 25％の硝酸のウェル当たり250μlのを適用し、それがピペットチップの端部と各ウェルを廃棄し、新しいミシガン州全体の井戸サスペンションを転送した後、少なくとも1時間放置crocentrifugeチューブ。 </li><li>細胞破片を除去するために15000 XG（室温）で5分間、それらを遠心分離、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにライセートを転送します。 </li><li>原子吸光分光法21により上清のリチウム含有量を測定します。 注：異なる企業がリチウム中空陰極ランプを装備する必要は原子吸光分光計を提供する。これらのマシンは非常に正確なだけでなく、非常に繊細であるように、メーカーの指示に従ってください。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、部位特異的突然変異誘発によって、その一次配列を変更することなく、原形質膜で細胞内のNa + / H +交換体を発現する細胞を選択する方法について説明します。これらの交換は今特徴付けることができる。 この方法は、原形質膜小胞でのNa + / H +交換体を発現する細胞株を選択するために、細胞内のプロトンの細胞毒性に基づいている。それは、Li +、K +、Cs等+として輸送することが疑われ得る他のカチオンを使用することが、原理的に、可能であろう。しかし、これは不確実性のレベルを高めることができます。選択は、任意の陽性クローンが得られない場合は、それを試験し、陽イオンが輸送されないかどうかを評価することは困難であるか、交換が原形質膜ではない。これらの理由から、選択は、これは、細胞外のsubstrそのまま結合カチオンとしてのNa +を使用して実行されている生理的条件下で最も高い豊富に見出さ食べた。これは、原形質膜（詩人と...

ほとんどの細胞内区画は、タンパク質またはホルモンの成熟、人身売買、リサイクル、神経伝達物質の負荷のために重要なパラメータである酸性の管腔のpHを、表示します。これは、サイトゾルおよび小胞の内容の間のpH勾配が小胞のClC塩化物トランスポーター2に結合され、液胞型H + -ATPアーゼ1によって生成されることが示されている。ノックアウト（KO）マウスとヒト患者の両方で、これらのトランスポーターの重要性は、その遺伝子3-6の突然変異によって引き起こさ重い表現型によって強調されています。 ナトリウム-水素交換体SLC9Aファミリーのメンバー、またのNa + / H +交換体のためNHEsと呼ばれるが、細胞内pHと細胞容積調節において、ならびに上皮を横切る酸-塩基当量のベクトル輸送における重要なエフェクターであることが示されている。原形質膜NHEs、3つの高度に保存されのNa + / H +交換体、NHE 6,7に加えおよび9はトランスゴルジ網および初期エンドソーム7で表されている。それらの遺伝子の変異は、アンジェルマン様またはクリスチャンソン症候群8-9、家族ベースの自閉症10及び注意欠陥多動性障害11-12でリンクされている。これらの交換器はまた、アルツハイマー病感受性13とX連鎖精神遅滞隣接遺伝子症候群14などの神経変性の問題に関わってきた。まとめると、これらの研究は、脳の発達および/または機能のこれらの細胞内NHEsの重要性を強調している。 これらの交換器の細胞内局在化は、それらのイオン選択性、搬送方向、速度論的パラメータ、及び規制の正確な測定を妨げる。細胞内区画において発現すべてのトランスポーターの場合のように、それらの生化学的活性を評価するために、したがって、完全にそれらの生理学的役割とmechanを理解することは極めて困難である彼らの病理学的な意味を根底にあるISMS。高い細胞質ゾルK +濃度に基づいて、最も一般的に受け入れられて仮説は、彼らがK +結合したプロトン排出トランスポーターとして働いていたということでした。それは定常状態の水疱性pHを維持するために、V-ATPアーゼによってプロトンポンプを相殺できるようなプロトンリークの存在が仮定されていた。この視覚資料の目的は、それらの形質膜にこのような小胞輸送体を発現する細胞株の遺伝的選択を可能にする、および（ii）これらのトランスポーターの機能を測定するために、二つの独立したアプローチを示すための方法を実証するためには、（i）である。 30年前、PouysségurとフランキはNHEファミリー15のメンバーの分子クローニングおよび特性を有効に遺伝的アプローチを開拓してきた。これは、スクリーニング法として、細胞内のプロトンの毒性に基づいていた。最初のステップは、欠損細胞株を得ることであった任意のNa + / H +交換において、このトランスポーターの可逆性を用いて、原形質膜で発現する。線維芽細胞は、（CCL39細胞株）のNa +またはLi +でプリロードし、次いで2時間、酸性細胞外培地（pH6.5）中に入れた。これは、機能のNa + / H +交換体を発現する細胞の死およびアンチポーター欠損細胞（PS120細胞系）16の選択につながった。重炭酸塩を含まない培地中で培養した場合、これらの細胞は、急性細胞内酸性化に非常に敏感である。そのような細胞は、急性細胞acidificationsに提出された場合、結果として、原形質膜における任意の機能プロトン流出メカニズムの発現が正に（17を参照）が選択される。このような酸性化技術は、売買欠陥が原形質膜でWT細胞NHEsの強制発現を可能とする細胞株を単離することができる。 真核生物のNa + / Hとして+交換器は、彼らがチャンネルを測定するために大きな成功を収めて使用されている電気生理学的ア ​​プローチによって測定可能ではないが、電気的に中性である。この原稿は、したがって、細胞内pH測定及びリチウム取り込みの迅速な動態によって、この交換器の活性を測定する方法を示します。基礎となる概念が同じであるように、選択部のために開発プロセスの多くは、機能の測定のために直接使用されることに注意することは興味深い。 興味深いことに、我々は、この原稿に記載されたアプローチを使用して選択された細胞株に存在するトラフィッキング欠陥は、水疱性カリウムチャンネルTWIK1 18のように、原形質膜における他の小胞のタンパク質のより大きな発現をもたらすことを観察した。これは、小胞の膜貫通型タンパク質のための一般的なリテンション不良メカニズムの選択に向かって指摘している。したがって、この選択手順と、それが05を生成する細胞細胞内コンパートメントの膜タンパク質に取り組んで科学的なコミュニティのための有望なツールを構成している。同様にここで紹介する測定技術は、他の非起電性トランスポーターを研究するための適用可能な場合があります。

<table><tbody><tr><td>標準的な細胞培養機器</td><td></td><td></td><td>カタログ番号の異なる多数のデバイスで構成されたH+殺傷選択に使用</td></tr><tr><td>CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>CO2ないインキュベーター</td><td></td> <td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>層流フード PSM1200NF</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td></td><td></td>52010120</tr><tr><td>DMEM ミディアム</td>シ<td>グマ</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS ゴールド</td><td>GE ヘルスケア</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>原子吸光分析装置 ゼーマン炉システム</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>シグマ</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>硝酸</td><td>シグマ</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>蛍光ビデオ顕微鏡セット</td><td>ライカ</td><td></td><td>カタログ番号の異なる多数のデバイスで構成</td></tr><tr><td>倒立型自動顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スタンド</td><td>ライカ</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> 11505180 <td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>入射蛍光</td>ライ<td>カ</td><td>11888901 11504166</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>モーターブラケット</td><td>ライカ</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>LED透過灯&nbsp;</td><td>ライカ</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034 11521580</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電動プレート</td><td>ライカ</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>11888424</tr><tr><td>カメラ出力</td><td>ライカ</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>画像取得・解析ソフトウェア</td><td>ライカ</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>光学</td><td>ライカ</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203蛍光</td><td></td></tr><tr><td>キセノンランプ</td><td>ライカ</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>浜松</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>メタフルー/Mmfluor 11640905</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH感知プローブ BCECF-AM</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>ニゲリシン</td><td>シグマ</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

ナの機能的特徴<sup&gt; +</sup&gt; / h<sup&gt; +</sup細胞膜でそれらを表現するためにプロトン殺す選択を使用した細胞内区画の&gt;交換器

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

エンドソームの酸性化は、タンパク質のリサイクルと劣化、受容体の脱感作、およびシナプス小胞における神経伝達物質の負荷などのプロセス、幅広いするために重要である。この酸性化のClC塩化物輸送体に結合されたプロトンATPアーゼによって媒介されることが記載されている。電気的中性のプロトン輸送体を高度に保存された、のNa + / H +交換体（NHE）6、7及び9は、これらのコンパートメントにおいて発現される。それらの遺伝子の変異は、人間の認知と神経変性疾患にリンクされています。それらの細胞内局在化は、詳細な機能解析を妨げているように逆説的に、彼らの役割は、とらえどころのないまま。この原稿は、この問題を解決する方法を示している。これは、原形質膜で細胞内NHEsを保持することにより急性のサイトゾル酸性化の生存可能な変異体細胞系の選択から成る。次に、イオン選択性および活性を測定するために二つの相補的なプロトコルを示している（i）1種の蛍光ビデオ顕微鏡を用いて細胞内pH測定値に基づいて、および（ii）1つのリチウムの取り込みの迅速な動態に基づくこ​​れらの交換器。そのようなプロトコルは、他の非起電性輸送を測定するために外挿することができる。さらに、ここで提示選択手順は、細胞内の保持不良表現型を有する細胞を生成する。従って、これらの細胞は、原形質膜における他の小胞の膜タンパク質を発現する。ここに示された実験戦略は、したがって、その後の選択のために使用される小胞のNa + / H +の交換とともに原形質膜で発現される他の細胞内タンパク質を研究するための潜在的に強力なツールを構成することができる。

選択： 図1Aに示すように、選択を殺すH +は 、アンモニウム弱塩基の拡散に基づいている。細胞内のpHに弱塩基および酸拡散の効果がウォルターホウ素及び共同研究者22によって開拓されました。ポジティブ遺伝子選択のための致命的な酸性化を生成するために、この現象を使用するには、エレガントなアイデアは、その後ジャック·Pouysségur17によって開発されました。このようなプロトコルの下では、細胞内のpHは約5.5リンス工程の後に低下します。原形質膜における機能的NHEを発現しない細胞は、中性のpH値を回復し、扁平状と粒状細胞質ゾル（ 図1B）を有する典型的な酸性化の側面を示すことができない。 （手順/週を殺す約2個のH +）を繰り返し選択サ ​​イクルの後、完全に安定して、この酸性化（ 図1C）を生き残る細胞は、約10 -7の頻度で出現する。これは、個別に、又は所望であれば、...

この記事の最初の部分は、原形質膜で小胞性Na+/H+交換体を発現する変異細胞株を選択する方法を示しています。第2部では、細胞内pH測定と高速イオン取り込みに基づくプロトコールを提供し、これらの交換体のイオン選択性と速度論的パラメータを決定するために使用されます。

ナの機能的特徴<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup細胞膜でそれらを表現するためにプロトン殺す選択を使用した細胞内区画の&gt;交換器

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

本実験の全体的な目的は、細胞内で発現したナトリウム-プロトン交換輸送体の活性を測定することです。まず、プロトンキリング選択法を用いて、細胞膜にナトリウム-プロトン交換輸送体を発現している細胞を選択します。次に、選択した細胞を酸性化させ、その後の細胞内pHの回復を測定することで、細胞のナトリウム-プロトン交換活性を確認します。次に、イオン輸送の高速キネティクスを測定し、輸送されるカチオンおよび阻害剤の親和性定数を決定します。最終的に、選択した体細胞の細胞内pHの変化と高速キネティクスをモニタリングすることで、細胞内タンパク質交換の機能的特性解析が可能になります。変異輸送体の発現やパー細胞（per cells）の使用といった既存の手法に対するこの技術の主な利点は、野生型の細胞内輸送体を細胞膜に発現させることができ、その機能を直接測定できる点にあります。本手順の実演は、私の研究室のリサーチサイエンティストであるDr.Mallory poetが行います。プロトンキリングの手順を開始します。まず、目的の細胞内ナトリウム・プロトン交換体を発現している細胞を、ローディング溶液中で37 °C、二酸化炭素を含まないインキュベーターを用いて1時間インキュベートします。次に、ローディング溶液を吸引し、新鮮な培地で細胞を2回洗浄します。2回目の洗浄後、培地を吸引し、二酸化炭素を含まないインキュベーター内で細胞を回復溶液とともにインキュベートします。さらに1時間後、回復培地を通常の培養培地に交換し、標準的な培養条件下で細胞を増殖させます。細胞内の蛍光pHをイメージング可能な安定したクローンが出現するまで、この選択サイクルを週2回繰り返します。まず、倒立顕微鏡に高感度ビデオカメラを組み合わせ、励起用に適切なクォーツ中性密度フィルタと対になる450 nmおよび490 nmの狭帯域干渉フィルタを備えたイメージングセットを準備します。可能であれば、適切なフィルタセットと照明条件を使用して、チャネル1と2で蛍光値が同等（比率が1に近づくよう）に設定し、ナトリウム-プロトン交換体の順方向活性を測定できるようにします。次に、細胞をアンモニウム負荷溶液中で1時間インキュベートし、酸性化させます。インキュベーションの最後の5分間、二酸化炭素を除去した状態で、レシオメトリックpH感受性蛍光色素を用いて細胞を染色します。インキュベーション期間の終了後、細胞をアンモニウムローディング溶液でリンスして細胞外のプローブを除去し、染色した細胞を顕微鏡にセットします。蛍光値を測定する関心領域（ROI）を適宜選択します。次に、ベースラインを確立するために数枚の画像を記録し、RIN溶液を灌流して蛍光強度の低下を誘導します。pHが安定した後、目的の溶液で細胞を灌流し、リチウム、ナトリウム、またはカリウムの水素交換によって媒介されるpH回復速度を測定します。続いて、塩化カリウムとゲリンを添加したhippies溶液で細胞を灌流します。次に、画像から蛍光測定値を収集し、ナトリウム・プロトン交換体（NHE）の初期速度を測定するために、データをテキスト形式でスプレッドシートプログラムにエクスポートします。7. 先ほど実演したイジウム負荷法を用いて、急速なリチウム取り込みにより細胞とマルチウェルプレートを酸性化します。次に、先ほど実演した通りに、プレートを迅速に2回洗浄します。次に、1～10 µMのリチウムと、目的のカチオンまたは阻害剤を所定の濃度で含む取り込み溶液中で細胞をインキュベートする。取り込み期間の終了後、取り込み培地を慎重に除去し、リチウムの流出を防ぐため、氷冷したPBSで4回、合計10秒以内に迅速に細胞を洗浄する。その後、ウェルあたり250 µLの25%硝酸を用いて、少なくとも1時間細胞を溶解させる。インキュベーション終了後、ピペットチップの先で各ウェルを掻き取り、各ウェルの懸濁液を新しいマイクロ遠心チューブに移す。最後に、室温で15,000 Gで5分間遠心分離して細胞残渣を除去し、原子吸光分光法で上清のリチウム含有量を測定する。製造者の指示によれば、プロトンキリング選択は弱塩基であるアンモニウムの拡散に基づいています。例えば、細胞膜に機能的なナトリウム・プロトン交換体を発現していない細胞は、中性のpH値を回復できず、そのため、繰り返しの選択サイクル後に完全かつ安定して生存した細胞としてこの代表的な画像に見られるような、扁平な形状と顆粒状の細胞質を伴う典型的な酸性化様相を示します。しかしながら、ここに見られるように、酸性化によって個々の細胞クローンが形成されます。これは、これらのグラフでイモジウム負荷後の酸性化に伴い観察されるように、さまざまな実験条件下で誘導される細胞内pHの変化を測定することで、細胞膜に発現した細胞内ナトリウム・プロトン交換体の活性およびイオン選択性を特性評価できることを示しています。酵素反応速度論に関して、初期取り込み速度の用量反応は、基質の親和性定数および阻害剤の阻害定数の値を導出するためにさらに利用できます。実際、輸送体の興味深い特徴として、異なる共輸送カチオンが輸送を競合するため、この図に示される手順に従ってリチウム取り込みとの競合によりナトリウムの親和性定数を測定できる可能性があります。また、目的の輸送体が実際に細胞膜に発現していることを検証するために、RNAサイレンシングを組み合わせた細胞表面BioInnovationなどの他の実験を行うことができます。

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

私たちは、Xenopus卵子における酵素の不均一発現と、原子吸光分光光度法による個々の細胞へのRb+またはLi+の取り込みを測定することにより、K+逆輸送P型ATPaseの活性を定量化する方法を説明しています。この方法は、放射性同位元素フラックス実験に代わる高感度で安全な方法であり、複雑な速度論的研究を容易にします。...

のNa、KとH、K-ATPaseのインによって陽イオン輸送を測定する<em&gt;アフリカツメガエル</em原子吸光法による&gt;卵母：アイソトープアッセイの代替

エレクトロポレーションを使用して、精製された細菌の病原性エフェクタータンパク質を直接生きた真核細胞に挿入しました。タンパク質の局在は、共焦点免疫蛍光顕微鏡法によってモニターされました。この方法により、活性な外因性タンパク質を用いた輸送、機能、タンパク質間相互作用の研究が可能になり、真核細胞における異種発現の必要性を回避できます。...

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プロテオリポソームは、明確に定義された生化学的環境で再構成された精製チャネルとトランスポーターを研究するために使用されます。これらのタンパク質によって媒介される排出を測定するための実験的手順が示されています。プロテオリポソームを調製し、記録を行い、再構成されたタンパク質の機能特性を定量的に決定するためのデータを分析するための手順について説明します。...

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継承された不整脈は、しばしば、一つ以上のイオンチャネルの表面の配信を変更する突然変異によって引き起こされます。ここでは、TSA-201細胞で発現された組換えイオンチャネルの相対的な合計および細胞表面タンパク質発現の定量化を提供するために、フローサイトメトリーアッセイを適合させます。...

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ここで表現し、可溶化、酵母を用いた SLC4 トランスポーター家族に相同性を有するいくつかの真核生物のホウ酸トランスポーターを浄化するプロトコルを提案します。ポリコームタンパク アセンブリの精製 homomeric...

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インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

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固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択

本稿では、サッカロマイセス・セレビシエで過剰発現したカンジダ・アルビカンスABC(ATP結合カセット)タンパク質Cdr1の特性評価のための小規模な血漿膜分離プロトコルを提示する。プロテアーゼ切開性C末端mGFPCdr1とタグの間に16残基リンカーを備えた二重タグは、Cdr1の精製および洗剤スクリーニングを容易にするように設計された。...

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このプロトコルは、膜電位の変化を測定することによって電気発生膜タンパク質を研究するための方法を記載しています。このアッセイは、上皮細胞株で内因的に発現する複数のイオンチャネルの機能的読み出しのためのプラットフォームを提供します。...

2つの上皮細胞株における2つの内因性イオンチャネルのハイスループット機能研究のための膜電位の蛍光ベースのアッセイ(英語)

学ぶナトリウム・プロトン交換体の機能解析法。プロトンキリング選択で細胞を選別し、細胞内pH回復と高速イオン取り込みを測定することで、輸送体のイオン選択性と動的パラメータを決定する手法を解説します。

ナの機能的特徴

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