Name: 水 - パルス振幅変調（WATER-PAM）蛍光測定を用いて細菌/植物プランクトンの共培養を評価するために小音量バイオアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学ぶWATER-PAM蛍光測定を用いた小容量バイオアッセイで、細菌と藻類の共培養における光合成系IIの健康状態を迅速に評価する方法です。微生物相互作用のスクリーニングに応用できます。

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この作業は、カナダ自然科学工学研究評議会（助成金402105)、カナダイノベーション財団（助成金129087）およびアルバータ州教育訓練））によってRJCに支援されました。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

小型化された形式での藻類の成長。 マイクロタイタープレート中の1ml培養体積に藻類培養物の微細化が増加する実験内での複製を可能にする。それは藻が実験を通して、健康であることを確認することが重要です。藻類の栄養要件が満たされていることを確認するために、様々な藻類メディアを評価するために、マイクロタイタープレートフォーマットを用いて、増殖曲線（ 図2）を実行する。さらに、それは概日周期（明暗周期）と温度を最適化することが重要である。特定の藻類のための適切な最適化は、26日間から140日間（ 図2）の後に潜在的な量子収率を検出するためのピーク蛍光における健全な藻類培養の維持を可能にすることができる。 蒸発の影響を最小限に抑える。 これは、「エッジ効果」のような液体ベースアッセイの蒸発の影響を最小限に抑えることが重要であるO、一般的であるbserved板の中央に向かって位置するウェル内のよりマイクロタイタープレートの縁部にお...

植物プランクトンの生理機能は、伝統的に三角フラスコ中で20ミリリットルからカーボイ1-7 ​​で5 Lの範囲のメソスケールの実験で研究されている。各時点で複製試料を犠牲にすることは手に負えない実験装置を作成し、この実験的なスケールは、実験的な監視のためのサブサンプリングが必要です。 藻類の生理学実験のための実験容積を小型化することによって、同じ日周インキュベータ·スペースを使用しながら独立した実験の数を増加させる能力は、大量のサンプリング擬似複製の制限を軽減または排除する。マイクロタイタープレート形式は、実験変数の条件で藻類を操作するための1ml培養体積を使用して、藻類のバイオアッセイのために開発された。この実験小容積が増加する反復の数を可能に起因複製試料との間の減少した変動性、実験の再現性を増加させる実験、および140日間（ 図2）12のための実験対照（ すなわち、純粋藻類培養液）を維持しながら、真の複製を可能にする。 このマイクロタイタープレート形式で容易のような実験的な質問、各種のために適合される：細菌は、その藻類ホストと、共生中性または病原性の相互作用がありますか？藻類への化合物の刺激の追加や毒性はありますか？これらおよび他の問題は、この新しい形式9-11を用いた迅速なハイスループットの方法で対処することができる。 48ウェルマイクロタイター培養プレートに1mlずつウェル単一の時点でサンプリングされる独立した実験設定にすることができる。各種パラメータを含め、この1ミリリットルボリュームからサ ​​ンプリングしたが、これらに限定されないことができます：水-パルス振幅変調（WATER-PAM）蛍光法（ 材料および機器の表を参照）1を用いたクロロフィル蛍光及び光化学パラメータ3。WATER-PAMの蛍光測定は、藻類13で行われた実験を監視するために使用することができる迅速かつ非侵襲的な技術である。 14,15（WATER-PAMのために4mlの容量- - 2培地で希釈した培養液300μl150）それは小さな培養液量から光合成効率とPSII健康の測定を可能にする。 WATER-PAMの蛍光測定に加えて、この設定を含む他の様々なパラメータを測定するために用いることができるが、これらに限定されない：藻類細胞および藻類細胞形態の変化に付着した細菌を可視化する顕微鏡。単位（CFU）のカウントを形成する細菌のコロニー。と藻類の細胞数と識別する亜集団のためにフローサイトメトリー。

<table><tbody><tr><td>10立方フィート 昼行インキュベーター (6012-1)</td><td>キャロン・コーポレート</td><td>112310-6012-1-11</td><td><a href="http://www.caronproducts.com">www.caronproducts.com</a></td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 25 cm2, Vent/Close Cap, 7 ml 作業容量, 200/cs</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>N156340</td><td><a href="http://www.fishersci.ca">www.fishersci.ca</a></td></tr><tr><td>マルチウェルTCプレート &ndash;48ウェル</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td></td> <td>353078<a href="http://www.bdbiosciences.com/">www.bdbiosciences.com</a</td></tr><tr><td>>P1000 Gilson The Pipetting Standard&mdash;ギルソンのピペットマン</td><td>サイエンティフィックカンパニー株式会社</td><td>GF-F123602</td><td><a href="http://www.mandel.ca">www.mandel.ca</a></td></tr><tr><td>P10mL ギルソン ピペッティングスタンダード&mdash;ギルソンのピペットマン</td><td>サイエンティフィックカンパニー株式会社</td><td>GF-F161201</td><td><a href="http://www.mandel.ca">www.mandel.ca</a</td></tr><tr><td>>Wide Orifice Tips 非滅菌 [100&ndash;1,250 マイクロ;l]</td><td>VWRインターナショナル</td><td>89079-468</td><td><a href="http://www.ca.vwr.com">www.ca.vwr.com</a></td></tr><tr><td>Ultrafineチップ非滅菌[100&ndash;1,250 マイクロ;l]</td><td>VWR International</td><td>89079-470</td><td><a href="http://www.ca.vwr.com">www.ca.vwr.com</a</td></tr><tr><td>>Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml]</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9402151</td><td><a href="http://www.fishersci.ca">www.fishersci.ca</a</td></tr><tr><td>>WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED)</td><td>Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany</td><td>EDEE0232</td><td><a href="http://www.walz.com">www.walz.com</a></td></tr><tr><td>15mm径石英ガラスキュベット(WATER-K)</td><td>キャロンコーポレート</td><td></td><td><a href="http://www.caronproducts.com">www.caronproducts.com</a></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(結晶性/認証ACS)、フィッシャーケミカル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td><a href="http://www.fishersci.ca">www.fishersci.ca</a></td></tr><tr><td>BD Difco Marine Broth 2216</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com</a></td></tr><tr><td>BD Bacto Agar</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td>BD Biosciences Discovery Labware</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com</a></td></tr><tr><td>L1ミディアムキット、50 L</td><td>NCMA [国立海洋藻類・微生物叢センター</td><td>NCMA [国立海洋藻類・微生物叢センター</td><td><a href="http://www.ncma.bigelow.org">www.ncma.bigelow.org</a></td></tr></tbody></table>

水 - パルス振幅変調（water-pam）蛍光測定を用いて細菌/植物プランクトンの共培養を評価するために小音量バイオアッセイ

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

培養物は、実験1-7を通してサブサンプリングすることができるように、微細藻類の実験操作のための従来の方法は、培養物の大量の（5 L 20 ml）を使用している。 1）それは、全体積の変化および表面積を引き起こす：大量のサブサンプリングは、いくつかの理由で問題となることが実験中の培養物の体積比; 2）疑似レプリケーション（ すなわち、同じ治療フラスコ8からサ ​​ンプルを複製する）は、多くの場合、むしろ真の複製（複製処理からのすなわち、サンプリング）も採用されている。 3）実験の期間は、総容量によって制限されます。汚染は、一般的にサブサンプリング中に起こるような、4）純粋培養または通常の細菌叢は、長期間の実験の間に維持することが困難である。 マイクロタイタープレートの使用は、内、最大48の別々の治療法を用いて1ml培養毎に使用するボリュームの複製を可能に12.65 X 8.5×2.2センチプレート、それによって実験的なボリュームを減少させ、任意の治療をサブサンプリングすることなく、大規模な複製を可能にする。 9-11をスクリーニングする細菌藻類共培養物、藻類生理学テスト、および毒素：さらに、この技術は、実験を含む種々の型式に適合するように修正することができる。水 - パルス振幅変調（WATER-PAM）蛍光法、顕微鏡検査、細菌のコロニー形成単位（CFU）：藻類、細菌および/または共培養は、数々の実験手順のためにサンプリングしたが、これに限定されないことができますと、個々のウェルカウントおよびフローサイトメトリー。マイクロタイタープレート形式とWATER-PAMの蛍光測定の組み合わせは、光化学収率および試料間の低い変動性を有する他の光化学的パラメータの複数の迅速な測定を可能にし、高い再現性実験の過程でカーボイまたは三角フラスコをサブサンプリングの多くの落とし穴を回避する。

WATER-PAMの蛍光定量法の測定値。 水 - パルス振幅変調（PAM）蛍光光度法、蛍光（クロロフィル含量のプロキシ）と藻類の文化の光合成収率（PSII健康）を決定するための迅速かつ効率的な方法である。 PAM WinControlソフトウェアは、（以下では暗順応藻類のサンプルのための基本的なパラメータである）のための生データ値のスプレッドシートを生成します。 F暗順応細胞の0 =蛍光 F = mの最大蛍光発光ダイオードを飽和した後（LED）パルス暗順応サンプル19のFのV / f M =（F mの -F 0）/ F mは =潜在的な量子収率 PAMの蛍光測定は、多くの用途があり、Alの光...

この手順の目標は、微細藻類のスクリーニングにマイクロタイタープレートフォーマットを使用することの再現性と適応性を実証することです。この迅速なスクリーニングは、WATER-Pulse-Amplitude-Modulated(WATER-PAM)蛍光測定を組み合わせて、少量の細菌-藻類共培養によるPhotosystem II(PSII)の健康状態の指標として光合成収量を測定します。

水 - パルス振幅変調（WATER-PAM）蛍光測定を用いて細菌/植物プランクトンの共培養を評価するために小音量バイオアッセイ

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

本実験の全体的な目的は、藻類培養物の健康状態や生理機能に影響を及ぼす可能性のある微生物共生体または病原体を迅速にスクリーニングするための、小型化された藻類バイオアッセイを紹介することです。これは、まず培地を用いて藻類と細菌のコントロール混合液を作成し、次にさまざまな濃度の藻類・細菌共培養実験区を作成することで達成されます。次のステップとして、堅牢で再現可能な迅速スクリーニングを行うため、これらの混合液の分注液を用いて48ウェルプレートを調製します。次に、プレートをインキュベートし、パルス振幅変調クロロフィル蛍光測定法を用いてモニタリングします。これにより、系の光合成状態を推定するための測定が行われます。このタイムコース実験の結果から、細菌が藻類に対して病原性、共生性、または中立的な影響を及ぼしているかどうかが明らかになります。また、タイムコース実験の間に、追加の小容量スクリーニングを適用することも可能です。藻類バイオアッセイに大量の試料を用いる従来法と比較した本手法の主な利点は、バイオアッセイを小型化することで少量の試料で実施でき、繰り返し回数を増やすことが可能になる点にあります。この手法は、もともと細菌性病原体や共生体に対する藻類の反応を詳細に把握するために開発されましたが、化学的な生物活性分子や栄養素が同様の健康状態や生理機能に及ぼす影響についての疑問を解消するためにも適用可能です。なお、本手法に不慣れな方は、小型のマイクロタイタープレート形式への分注や藻類試料の導入に苦労する可能性があります。成功させるには、厳格な無菌操作と十分な実験計画が必要となるためです。実験の時間を調整してください。これにより、定常期に達した細菌と、対数増殖期初期に達した藻類細胞を同時に準備することができます。実験を開始する前に、細菌株および藻類株について十分に理解しておくことが極めて重要です。細菌および藻類株の初期濃度、および暗順応に必要な時間に加え、対数増殖期初期がいつであるかを知っておくことが重要です。PAMを使用する場合、細菌の準備として、ガラス試験管に付着しているバイオフィルムを細菌培養液中に洗い流し、次に培養液1 mLを無菌的に採取します。それをマイクロ遠心チューブに移します。マイクロ遠心チューブを1分間遠心分離します。14,000 gsで遠心し、ペレットを乱さないように上清を除去した後、1 mLのL1などの滅菌済み藻類培地でペレットを再懸濁し、チューブをボルテックスして均一な懸濁液にします。その後、再度遠心分離して上清を除去し、滅菌培地でペレットを再懸濁することで、細菌細胞をもう一度洗浄します。藻類培地で洗浄することで、細菌培地のデトリタスや低分子化合物が完全に除去され、これは後続の工程において極めて重要です。これら2回の洗浄の後、細菌細胞をalmediaで段階希釈

a-small-volume-bioassay-to-assess-bacterialphytoplankton-co-culture

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環境

本論文では、成長の異なる方法を説明します...

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

アッセイは、細菌および真菌の早期のバイオフィルム形成を測定する迅速な手段を説明します。このメソッドは、微生物のバイオフィルム形成のための基層としてのマイクロタイタープレートを使用し、バイオフィルムは、クリスタルバイオレットの菌株を用いて可視化です。アッセイは、どちらかの初期のバイオフィルム形成のための定性的または定量的なアッセイを提供する。...

マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ

出典: Weber、N. ら、 糸状シアノバクテリウム Phormidium lacunaの自然形質転換、タンパク質発現、および凍結保存。 J. Vis. 経験。...

集束光照明を用いた糸状シアノバクテリアの走光性アッセイ

このビデオでは、ペグプレートを使用してバイオフィルムを効率的に除去する抗菌化合物をスクリーニングするアッセイを示しています。この方法論は、抗菌化合物で処理した後のバイオフィルムの代謝状態をモニターし、バイオフィルムの最小根絶濃度の決定を容易にします。...

抗菌剤をスクリーニングするためのペグプレートバイオフィルムアッセイ

ここでは、遠隔地の海洋環境における有機的および無機的な栄養素の利用可能性と、微生物およびウイルス群集の存在量と構造を評価するための包括的なプロトコルを提示します。...

水化学と海洋微生物学へのフィールドガイド - 海における幽玄選手の解明

バークホルデリアsartisoli RP037-MCHEと全細胞バイオレポーターアッセイは、水飽和モデル系内の空気で満たされた細孔を橋渡し菌糸体により能動輸送後の細菌による分解に利用可能な有機汚染物質（ すなわち、フルオレン）の画分を検出するために開発されました。...

水不飽和システムにおける有機汚染物質の輸送および生物学的利用能を評価するために、全細胞バイオレポーターアプローチ

本稿では、他の方法と組み合わせて、適切な動態パラメータを推定するために使用できるベンチスケールの光合成バイオリアクターの組み立てプロセスと操作について説明します。このシステムは、センサー、データ収集および制御ユニット、およびオープンソースのデータ収集ソフトウェアを使用してpH、光および温度を連続的に監視します。...

動力学的成長試験のための温度、光およびpHモニタリングを有するベンチスケール藻類光合成バイオリアクターの構築およびセットアップ

視覚的クラスタ リングと組み合わせてフローサイトメトリー水生バイオ フィルムを研究するための使いやすい高速メソッドを提供しています。バイオ フィルムの特性評価、バイオ フィルムのコミュニティ構造の変化の検出とバイオ...

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

この出版物は、カスタマイズ可能な光レジームを備えた実験室用フォトバイオリアクター(PBR)の設計について説明しています。シアノバクテリアまたは微細藻類の増殖は、炭酸水素塩を炭素源として使用し、体積酸素産生を測定することによって継続的に監視される。これらのPBRは、実験中のユーザーの介入をほとんど伴わずに、迅速で複製された実験室の成長比較を容易にします。...

オンライン成長測定とカスタマイズ可能な光レジームを備えた実験室用フォトバイオリアクターの操作

高速繰り返し速度蛍光光度計(FRRf)は、光システムII光生理学および一次生産性を測定するための有益な方法である。ここでは、キュベット型FRRfを用いて基質動物プランクトン上のエピゾイ藻類、 コラシウム...

キュベット型高速繰り返し速度蛍光光度計による コラシウム 属の付着ステージの光生理機能の測定

このプロトコルは、パルス振幅変調クロロフィル蛍光測定法による非光化学的消光の緩和を測定するためのハイスループット法を導入する。この方法は、野外で栽培された グリシンマックス...

パルス振幅変調クロロフィル蛍光測定を用いた作物の非光化学的急冷のハイスループット分析

学ぶWATER-PAM蛍光測定を用いた小容量バイオアッセイで、細菌と藻類の共培養における光合成系IIの健康状態を迅速に評価する方法です。微生物相互作用のスクリーニングに応用できます。

水 - パルス振幅変調（WATER-PAM）蛍光測定を用いて細菌/植物プランクトンの共培養を評価するために小音量バイオアッセイ

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