原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

この手順の全体的な目標は、1つのポリマーをA FMカンチレバーチップに結合して、同じ分子の1つで4回の分光表面脱着実験を複数回行うことです。これは、まずチップの表面をプラズマで活性化し、第2のステップとして水酸基を形成することによって達成されます。カンチレバーチップは、アップテスト溶液によってアミノサイロ化されており、チップ表面にアミノ基を形成します。

3番目のステップは、ポリエチレングリコール分子をアミノ基に結合させることです。これらは、チップと基板との間の非特異的な相互作用を防ぎ、ポリマーのリンカー分子として機能します。最後に、ポリマーをポリエチレングリコール分子に結合させてプローブを形成します。

測定によると、この手順は、完全な実験セット、または同様に数百の力距離曲線に1つの同じポリマー力プローブを実際に使用することを可能にすることを示唆しています。アンサンブル法に対する1分子実験の主な利点は、アンサンブル平均化では隠されてしまうような、稀な確認や頻度の低い状態を研究できることです。これらの実験はサイズが小さいため、分子動力学シミュレーションと直接比較できます。

最初のステップは、プローブ分子をカンチレバーの先端に共有結合的に結合することです。新しい窒化ケイ素から始めます。カンチレバーチップは、ナノメートルあたり10〜100ピコニュートンのばね定数を持つチップを採用しています。

ピンセットを使用して、清潔なスライドガラスまたはシャーレに置きます。次に、チップを載せたスライドを100ワットのプラズマチャンバーに入れ、チャンバーを排気し、0.25ミリバールと20ワットで15分間操作した酸素で洗い流します。次のステップでは、プラズマ処理中に有機蒸気を吸い込まないようにフードを使用します。

ガラスのペトリ皿のカンチレバーのアミノのサイロ化のための準備を、テスト解決の2.5ミリリットルを置いた。さらに、アセトンを含む容器を修理します。カンチレバーは、プラズマ処理が完了した直後に回収してください。

各カンチレバーをアセトンに1秒間浸し、次にOptus溶液に入れます。カンチレバーを室温で15分間インキュベートしてから進めます。カンチレバーがインキュベートされたら、水と空気がコンポーネントに与える影響を最小限に抑えるために、ペグ化の準備を開始します。

事前に準備したEPHチューブから始め、1つはmペグ、NHS、もう1つは色素を含んでいます。NHSペグ。各チューブの内容物の重量を決定します。

次に、EG NHSを含むチューブで作業し、クロロホルムを追加する準備をします。クロロホルムを注ぎ、最終濃度が25ミリモルに達し、その後のステップでカンチレバーを覆うのに十分な溶液が得られます。チューブをボルテックスミキサーに置き、粉末が溶解することを確認します。

EG NHSの入ったチューブを脇に置いて、ダイエットに取り組みます。NHSペグ。クロロホルムを加えて、最終濃度0.25ミリモルに到達させます。

ボルテックスミキサーを使用して、粉末が溶解していることを確認します。次に、溶液を混合して、ダイエットNHSペグとメチルペグNHS分子の比率を調整します。この比率は通常、1 対 500 です。

蒸発を制限するための蓋付きの小さなガラス製シャーレを入手し、カンチレバーとして混合物を充填します。インキュベーションを終了します。APT試験液には、約10ミリリットルのアセトンが入った容器が2つと、すすぎ用のクロロホルムが入った容器が1つ用意されています。

それぞれをアセトンに2回、クロロホルムに1回浸し、ポリエチレングリコール溶液に入れます。皿を覆い、カンチレバーを溶液に入れたままにします。1時間、プローブ分子(この場合はポリアミノ酸ポリデチロシン)の共有結合を準備します。

これに溶解する1モルの水酸化ナトリウムの体積から始めて、プローブ分子を1ミリグラムあたり1ミリグラムの濃度にします。ポリDチロシンの場合、水酸化ナトリウムを8〜8.5pHのナトリウムボアと交換します。機能化の直前に8つのバッファ。

カンチレバーがポリエチレングリコール溶液中でのインキュベーションを完了すると、カンチレバーをすすぐための3つの容器とポリチロシンボアの容器を準備します。すすぎ用の8つの緩衝液は、5ミリリットルのクロロホルム、5ミリリットルのエタノール、5ミリリットルのボア緩衝液です。約300マイクロリットルのポリチロシンボア緩衝液を使用してください。

カンチレバーを取り出し、それぞれを最初にクロロホルムに浸し、次にエタノールに浸し、次にボア8バッファーに浸します。それらをポリチロシンに入れる前に、8つの緩衝液を穴に含んでください。カンチレバーチップを準備し、1つの容器に約5ミリリットルのベイトバッファーを入れ、カンチレバーをすすぐための別の5ミリリットルの超純水もそれらを保存するための20ミリリットルの超純水を用意した後、カンチレバーチップを1時間インキュベートします。

カンチレバーを入手し、それぞれをBoiteバッファーに浸し、続いて超純水ですすぎます。その後、超純水に浸して保管します。カンチレバーは、データ収集に使用できるようになりました。

A FMチップが機能化され、表面が準備されて取り付けられたら、FMデータ集録の手順を開始します。まず、機能化されたカンチレバーを、液体中の測定に適したA FMカンチレバーホルダーに入れます。次に、カンチレバーホルダーをAFMヘッドに接続します。

流体セルに水を注ぎ、カンチレバーと表面を浸します。次に、液体セルのAFMヘッドを下げます。システムを少なくとも30分間平衡化させます。

e平衡化後。カンチレバーを表面から遠ざけて配置し、表面減衰効果を排除するための十分な信号対雑音比を得るためには、熱雑音スペクトルを10個以上記録する必要があります。次に、慎重に表面に近づいて、逆光レバー感度を測定します。

これには、カンチレバーの先端を硬い表面に押し付けて、力とピゾの移動距離を記録することが含まれます。接触時の傾きを測定し、それを反転させて、逆光レバー感度を決定します。次の作業では、逆光学レバー感度と熱雑音スペクトル 高調波発振器を熱雑音スペクトルに適合させることにより、カンチレバーのばね定数を決定します。

次に、データ収集の適切なパラメータを設定します。データ収集の最後に、各実験条件の多数の強制距離曲線を記録します。感度とスプリング定数を再度決定して、システムの一貫性と安定性を確認します。

この赤色の強制距離トレースの例は、メチル自己組織化単分子膜不純水からのポリチロシンの収縮によるものです。ゼロフォースへのシングルステップドロップは、単一分子の分離を示します。シグモイドフィットは黒で示されています。

抽出されたプラトーの長さとプラトーの力は矢印で示されています。カンチレバーの伸長収縮速度は毎秒0.5ミクロンで、表面での滞留時間は1秒でした。測定用の液体環境が異なると、抽出されるプラトー力に変化が生じました。

これらのヒストグラムは、純水での測定値と水中での測定で抽出されたプラトー力を反映しています。エタノール混合物は、同じ単一ポリマー中の1つで、各溶液について少なくとも300の力距離トレースが記録されました。ここでは、純水および水エタノール混合物中の抽出されたプラトー長について、類似のヒストグラムが示されています。

エタノールの添加は、ポリチロシンと表面との間の疎水性相互作用を弱め、プラトー力の低下とプラトー長の減少につながります。これは、ピークプラトーの長さとピークプラトー力のこのプレートに要約されています。一度習得すれば、開発後約4時間で機能化プロトコルを行うことができます。

この技術は、物理学や化学の分野の研究者が、界面におけるポリマーの違反の接着を探求するための道を開きました。