Name: 原子間力分光法による単一分子の接着性を調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学ぶ原子間力分光法による単一ポリマーの接着力測定手法。AFMカンチレバー先端へのポリエチレングリコールリンカー固定とプラズマ活性化を用い、生体物理学・表面化学の研究に応用可能です。

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著者はDFG(Hu 997/2-2)の財政的支援に感謝します。FSは、ハンス・ザイデル・シュティフトゥング(HSS)を認めています。SKrは、博士課程プログラム「Material Science of Complex Interfaces」の枠組みの中で、Elitenetzwerk Bayernの支援を受けました。SKiは、SFB 863の財政的支援に感謝します。

注：準備、データ収集及びデータ解析ステップを含むプロセスフローの概要について、図2を参照してください。 1.試薬のセットアップ注：すべての化学物質は、取り扱いに注意しなければならないため、白衣、手袋と目の保護を使用する必要があります。すべての操作は、実験室フード内で実行する必要があります。具体的には、特別な手袋はクロロホルムを用いた場合に着用してください。 <ol><li>急速にそのような乾燥クロロホルムなどの低含水量で化学薬品を使用し、週間以上乾燥ではなく、保管してください。 APTES（（3-アミノプロピル）triethoxysilanが）およびPEG（ポリエチレングリコール）（ 表1参照）ため、-20℃で、窒素またはアルゴンガス下で両方の化学物質を保管吸湿性であり、PEGは、空気中で酸化を受ける。 </li><li>大気中の酸素や水分に株式の頻繁な露出を避けるために、理想的に窒素を用いてグローブボックスシステム内で、小さいアリコートを準備atmosphe再。 </li></ol> 2.機器のセットアップ注：可能な交差汚染を回避するために、ステップごとに新鮮できれいな容器を使用する。 <ol><li>きれいなガラス器具および60℃の超音波浴中で30分間、界面活性剤溶液中でピンセット。 </li><li>超純水で2回徹底的にステップ2.1から機器をすすぎ、超音波処理。 </li><li> RCA溶液中のステップ2.1からの熱機器（超純水、過酸化水素及びアンモニア（5：1：1））に75℃で45分間オーブン中でC、その後、超純水でそれらをすすぐ。 </li><li>最後に、乾燥窒素気流下、オーブン（100℃、3時間）でガラス製品、ピンセットを乾燥する。 </li></ol> 3.ヒント機能化 NOTE：ピンセット、船舶等は、ステンレス鋼、PTFE、ガラス、または該当する場合は、有機溶液中で化学的に安定である任意の他の材料から作られる。特に断りのない限り、Rにおける全てのステップを実行するT.必要なインキュベーション溶液の量は、カンチレバーチップの数に依存する。カンチレバーはすべての時点でそれぞれの溶液に浸漬されていることを確認します。 注：有機蒸気の吸入を避けるために、フードを使用してください。 <ol><li>カンチレバー表面上のOH基の形成（「活性化」）（約0.5時間）。 <ol><li>きれいなガラススライド上に、プラズマ室（100 W）に入れ、新鮮なカンチレバーチップ（10〜100 PN / NM：：SiNから、バネ定数材料）を配置するためにピンセットを使用してください。 </li><li>チャンバー（〜0.1ミリバール）を避難させる。 </li><li>酸素ガスとの洪水室と再び避難する。 </li><li> （20％、継続時間：15分、プロセス圧力：0.25ミリバールパワー）プラズマプロセスをアクティブにします。 </li></ol></li><li>カンチレバーのアミノシラン（約1時間）： <ol><li>プラズマプロセス中に、理想的には、これを行う- APTES溶液を2.5mlを調製し、ガラスシャーレ（ 表1参照）。 </li><li> Immediatelプラズマ処理後のYは、アセトン中で1秒間各カンチレバーを浸しAPTES溶液中で直後に配置します。 </li><li> RTで15分間インキュベートする。 </li><li>慎重に10ミリリットルのアセトンに一回10ミリリットルのクロロホルムに二回カンチレバーチップをすすぐ。 </li><li>任意の最終ステップ：清浄なガラススライド上に前工程からのプレースカンチレバーチップを70°Cで30分間、それらを焼く。表面活性化、 例えば、UV処理12のための代替戦略もあることに注意してください。 </li></ol></li><li> PEG化（約2時間）： 注：手順を実行し3.3.1-3.3.4アミノシラン中に。 NHSおよびマレイミド基は、水性環境中で加水分解を受けやすいとPEG自体は空気中で酸化の対象となります。そのため（特にステップ間で）タイミングは重要なパラメータである。詳細については13を参照してください。 <ol><li>クロロホルム溶液を（ 表1参照）を準備。 </li><li>結露を避けるために、、暖かいPEGは分量を開き、適切な量を計量する前に、室温まで粉末。 </li><li>アミノ基を有するポリマー又は脂質の結合のために、個別にそれらが完全に解決されるまで、それらをボルテックスすることにより、クロロホルム溶液中でNHS-PEG-NHS（6 kDa）のメチル-PEG-NHS（5kDaの）を解く。濃度については、表1を参照してください。 <ol><li>代わりに。チオール基を有するポリマーのカップリングのために別々にクロロホルム溶液中のMal-NHS-PEGとメチル-PEG-NHSを解決する。 </li></ol></li><li> NHS-またはマレイミドおよびメチル末端PEG分子（：500、典型的には1）との​​間に一定の数の比を調整するために必要に応じて溶液を混合する。理想的な比率は、準備、実験一連のサイクルで反復的に決定されなければならないことに留意されたい。 </li><li>クロロホルムの蒸発を防止するためにクロロホルム、飽和雰囲気中で1時間PEG溶液にカンチレバーチップをインキュベートする。 </li></ol></li><li>分子抱合を探る（&gt; 1時間）。 注：以下の3.4.1-3.4.3では、AFMチップの異なるプローブ分子の共有結合のための3つの例が記載されている。各分子のためのプロトコルを調整する必要がある。実施例1及び3-NHS化学で実施例2において、チオール官能化ポリマーPI- gが -PSがマレイミド化学を介してPEGに結合され、一方、使用されていることにも注意。詳細については、14を参照してください。 <ol><li>ポリ（アミノ酸）、ポリ-D-チロシン（40-100 kDa）のための<ol><li> 1MのNaOHでポリチロシン共役プローブ分子を溶解させる。 1 mg / mlの濃度に調整。 </li><li>官能化の直前にスピン脱塩カラム（7 kDaのMWCO）を用いてホウ酸ナトリウム緩衝液（pH 8.1）のためのNaOHを交換</li><li>その後のホウ酸緩衝液5ミリリットルとエタノール5ml、最後にして、クロロホルム5mlで最初のカンチレバーをすすぐ。 </li><li>ポリチロシンホウ酸緩衝溶液中で1時間、カンチレバーチップをインキュベートした後、ホウ酸緩衝液ですすぎ超純水。測定まで超純水に保管してください。 </li></ol></li><li>線形バックボーン（ポリイソプレン、119 kDaの）を有するグラフトされた側鎖（ポリスチレン、88 kDa）の14を有するポリマーについては、 <ol><li>乾燥クロロホルムにPI-G -PSを溶かす。 4 mg / mlのへの接合溶液の濃度を調整します。 </li><li>クロロホルム5mlのカンチレバーをすすぎ、共役溶液中で少なくとも1時間インキュベートする。 </li><li>クロロホルム5mlに再度リンスし、クロロホルム飽和環境でクロロホルム中で測定まで保存し（クロロホルム蒸発を防ぐため）。 </li></ol></li><li>脂質POPEのために<ol><li>乾燥クロロホルムにPOPEに溶解する。 20 mMの濃度を調整します。 </li><li>脂質溶液中で1時間、カンチレバーのインキュベーション前に5mlのエタノールと超純水5mlを有するカンチレバーをすすぐ。 </li><li>インキュベーション後、5mlのクロロホルム、エタノ5mlでカンチレバーをすすぐlで（この順序で）暖かい、超純水5mlの未結合プローブ分子を除去し、クロロホルム残基を取り除くために。すぐに官能化されたヒントを参考にしてください。必要になるまで代わりに、クロロホルムに保管してください。 </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" /> 図1 NHS化学の例を用いて、先端官能化プロセスを示す（A）概略図。 （B）化学結合は、アミノ基を介して先端にプローブ分子を取り付けるために採用。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 4.表面の準備<ol><li>自己組織化単分子膜（SAM） 注：最初に、例えば表面が、自己組織化単分子膜を選択した。文献15を参照してください</s詳細については、&gt;まで。 <ol><li>それぞれ30分間超音波浴中の洗剤溶液および2回、超純水でクリーンなガラススライド。次に、追加の洗浄工程として、15分間、75℃で（ステップ2.3参照）RCA溶液中に置く。 </li><li>コー​​ト10nmのクロム、ニッケル、真空コーター中で100nmの金でスライド。そして、前に次のステップに直接RCA溶液中に再び冷蔵庫、清潔に保管してください。 </li><li> 12時間2 mMの1-ドデカン/エタノール溶液中に前の手順のスライドをインキュベートします。チオール基は金表面に結合した疎水性単層自己アセンブル。エタノール、超純水でスライドをすすぎ後、窒素ガスの流れによるドライ。 CCDカメラ10とゴニオメーターでの静的接触角測定と調製された表面の疎水性を確認する。 </li></ol></li><li>水素終端ダイヤモンド 注：第二の例のための表面としては、水素終端ダイヤモンドが選ばれました。以前に16記載のように表面処理を行った。 </li><li>サポートされている脂質二重層 注：最後の例では、表面支持された脂質二重層（SLB）を表面として使用した。そのような表面を得るために、リン脂質POPCからなる大型の単層小胞（LUVを）の溶液（0.1 mg / mlで）を押出法により形成した。その後、LUV溶液50μlを、新たに切断したマイカシート（A = 1 cm 2で）上に置き、30分間インキュベートした。最後に、この溶液を超純水20mlで洗浄した。のSLBの準備の詳細については、17,18を参照してください。 </li></ol> 5.データ集録注：実験では、液体中で測定する機能を提供し、AFMを使用します。データ収集およびデータ分析手順は関係なく使用AFMモデルの適用可能である。さらに、いくつかの実験ではtemperaturを制御する可能性を有することが有利である液体セル内の電子。カンチレバーの偏向は、レーザビームの偏向方法19を介して検出した。ばね定数は、熱雑音法20を用いて測定した。 <ol><li>体液中の測定に適しているAFMカンチレバーホルダーに官能化カンチレバーを挿入します。 </li><li> AFMにサンプリングされる（調製は上記参照）の表面を入れて、液体でそれをカバーしています。どちらも、カンチレバーと表面が今表面に向かって指しているカンチレバーの先端で液中に浸漬する必要があります。多くの場合、液体の滴が十分であることに注意してください。いずれの場合においても流体の蒸発は、閉じた流体セルを用いて、例えば 、避けるべきである。 </li><li>該当する場合、コントローラ上の所望の温度を調整します。 </li><li>システムは、少なくとも半時間平衡化しましょう​​。 </li><li>効果を減衰任意の表面を除外するために、遠く離れた表面からカンチレバーとカンチレバーの熱雑音スペクトルを記録します。通常1ことに注意してください0以上のスペクトルは、十分な信号対雑音比を得るために、蓄積されなければならない。 </li><li>表面アプローチ。先端形状と先端官能化を節約するためにアプローチプロセスは注意深く行わなければならないことに留意されたい。これは、間欠接触モードで接近、例えば、によって達成することができる。 </li><li> NM /ボルトで測定された逆の光てこ感度（InvOLS）を決定します。硬い表面に対してカンチレバー先端を押すことでこれを行います。 <ol><li>フォトダイオード電圧の変化対ピエゾ移動距離の傾きを測定することにより、InvOLSを決定します。カンチレバーの先端が表面に接触している力 - 距離曲線の一部にラインを取り付けます。脂質二重層のようなソフト面を含む実験では、脂質二重層（「欠陥スポット」）で覆われていない領域でこの手順を実行する。 </li></ol></li><li>熱雑音スペクトルに高調波発振器を適合させることによりバネ定数（PN / nm）を決定します。使用ばね定数決定のための自動化されたソフトウェア機能と、そうでなければ文献20を参照してください。 </li><li>実験を開始します。 <ol><li>各実験条件での数々の力 - 距離曲線を記録します。 1μmの距離を撤回、5 kHzの、1ミクロン/秒の先端速度のサンプリングレート：通常、実験パラメータに次の値を使用します。 注：場合によっては、検討した実験のダイナミクスに応じて、それは（「滞留時間」）の表面に接触して先端にある程度の時間を待機する必要があるかもしれない。 注：この実験特有のパラメータは、上記の値から大幅に逸脱することができます。 </li><li>長期の測定中に、フォトダイオードを再配置することによって随時フォトダイオード上のレーザ位置をゼロ。 </li><li>オプション：すべての力曲線の後、別のXY位置にAFMチップを再配置。 </li><li>実験の終了時に、感度およびスプリングを決定CONSTAシステムの一貫性および安定性を確認するために再度のnt。 注：実験前と後のばね定数と感度を比較することは、システムの特性およびチップの特性は実験の過程にわたって変化しないままであったことを確実にするための手段である。ばね定数の差が（&lt;= 15％）が大きすぎない場合には、バネ定数の決定の本質的な不確実性も15％程度であるので、それらは、平均することができる。大きな違いの場合は、最初に見つけると、さらなる実験を続行する前に、変化する見かけのばね定数の原因を排除することをお勧めします。 </li></ol></li></ol> 6.データ準備注：典型的には、ニュートンとナノメートル単位を変換するだけでなく、データが記載されている修正するための実験の特定のタイプとは無関係に行われ、このセクションの一般的データ準備工程において。実験特定のデータ分析はBRであるieflyそれぞれの代表的な実施例のセクションで以下にさらに説明する。 <ol><li>一般的に、すべてのデータの準備を行い、解析ソフトウェアIGOR Proを6に基づいて、 例えば家庭書き込まアルゴリズムによって自動的に繰り返す。 </li><li> InvOLS [NM / V]とばね定数[nNの/ nm]とでそれを掛けることによって発効[V]生の偏向信号（DEFL）を変換します。 </li><li>表面（アンロードカンチレバー）から十分な距離でカンチレバー上の力が0 NNのになるように力を相殺した。 </li><li> ：実際の先端位置（表面に対して測定した場合にも、分離と呼ばれる）を考慮にカンチレバーの曲げをとるのz *を計算する <img alt="式1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" /></li><li> のz * = 0は、表面のz位置に対応するように* zのオフセット。 注：ここで、Fは 、したがって、先端に作用する力であり、曲げ（ステップ6.2で決定された。）は、カンチレバーのs、zは測定されたz軸センサ位置（直接計器により与えられる）、kは （ステップ5.8で決定された）ばね定数を表している。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" /> サンプル調製、データ収集とデータ分析を示す図2.プロセスフロー図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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<li>Morfill, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-matured+recombinant+antibody+fragments+analyzed+by+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

最後の数十年の間に、単一分子実験は分子メカニズムに前例のない洞察を提​​供し、生命科学とそれ以降で非常に貴重なアプローチであることが判明しました。 SMFS実験の良い有意義な統計値を達成するために、理想的には、同一の分子は、実験の全体​​にわたって使用されている。分子のアンサンブルを用いた実験とは対照的に、SMFS実験は稀な事象と隠された分子状態を検出することができる。単一分子実験の別の利点は、分子動力学シミュレーション24,25によってモデル化することができることである。 28 -上記のカンチレバー機能化プロトコルは、以前に26を公表された手順の修正バージョンです。活性化およびシラン化した後、AFMカンチレバーは、ポリエチレングリコールの二つの異なる種類（PEG）分子（リンカー分子）との混合物で官能化されている。 N-ヒドロキシスク...

過去30年間に、原子間力顕微鏡（AFM）は、すべての3つの次元での分子の空間分解能を提供し、様々な溶媒中で動作させることができるので、生物学1,2および合成3の材料および表面を研究するための貴重なイメージング技術であることが判明している環境。加えて、AFM-単一分子力分光法（SMFS）はpNからμN政権に至るまで力を測定することが可能になり、4,5の折り畳みタンパク質に例えば前例のない洞察を与えている、高分子物理学6から8、および単一分子-表面相互作用9 -単一分子ではなく、分子のアンサンブルを研究の背後にある12 .theの根拠は、多くの場合、稀な事象や隠された分子状態をマスクする効果を平均化することを避けることである。さらに、このような等輪郭長、クーン長、接着自由エネルギー、などの分子パラメータの多数であることができる得。これは、以下の実施例に詳述されている。典型的なAFM-SMFS実験では、プローブ分子は、リンカー分子を介して非常に鋭い先端部に連結されている。チップ自体は曲げられる片持ち梁の端部に配置されている。先端が表面と接触した場合、プローブ分子は、この表面と相互作用する。表面から分子を分離するために、先端部の後退時にカンチレバーのたわみ、力、ひいては自由エネルギーを観察することによって決定することができる。意味のある統計値を得るために、いわゆる力 - 距離曲線の多数を取得しなければならない。さらに、真の単一分子実験（ すなわち 、1つを使用して、全実験期間にわたって同じプローブ分子）を有するプローブ分子は、AFMチップに共有結合されるべきである。ここで、共有結合を介して単一分子カンチレバーの官能化のための実験プロトコルが提示される。単一分子は、アミノまたはチオ介して結合することができるいずれかAFMチップのL群。コンジュゲーションプロセスは、使用されるポリマーの溶媒和特性を考慮して、溶剤（有機及び水性）広範な種類の中で行うことができる。 最初の部分では、共有結合的にAFMチップを、リンカー分子を介して単一分子（「プローブ分子」）を取り付けるための一般的なプロトコールが記載されている。この目的のために、有機NHS-またはマレイミド化学を13に使用される。 3つの例示的分子のためのプロトコルと共に、データ収集及びデータ解析プロセスが記載され、さらに読み出し用の参照が提供される。例分子である：（リニア）ポリマーチロシン、グラフトポリマーPI-G -PSおよび脂質POPE。これは共有結合システインを添付する例えば、プロトコルのわずかな変動が含まれています。また、セクションは、そのようなダイヤモンド表面、CH 3 -self組織化単分子膜と脂質二重層として異なる面の準備に専念しています。これらのインタフェースは、箴を持っているEN良い参照と例であることを。

<table><tbody><tr><td colspan="4">材料</td></tr><tr><td>Hellmanex III アルカリ濃縮液 (洗剤溶液)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RCA (超純水、過酸化水素 (35%)、アンモニア (32%); 5:1:1(v/v/v))</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベクタボンド試薬 / APTES (3-アミノプロピル)トリエトキシシラン</td><td>Vectorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乾燥アセトン (< 50 ppm H2O)</td><td>Σ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドライクロロホルム (> 99.9%)</td> <td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリエチルアミン</td><td>Σ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超純水</td><td>バイオクロム、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四ホウ酸二ナトリウム (>&nbsp;99.5%)</td><td>Biochrom、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Biochrom、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>単官能性&α;-メトキシ-&omega;-NHS PEG、5 kDa、"メチル-PEG-NHS」</td><td>ラップ、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘテロ素ファンクショナル &alpha;,&omega;-bis-NHS PEG, 6&nbsp;kDa, "NHS-PEG-NHS」</td><td>ラップ、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘテロ二官能性 &α;-maleimidohexanoic- &omega;-NHS PEG, 5 kDa, "マルペグNHS」</td><td>Rapp, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プローブ分子 (polymer, lipid, etc.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Enough amount of glass crystallizing dishes with spout (10&nbsp;ml)、ガラスペトリ皿(500&マイクロ;l) とガラス蓋</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>実験室用オーブンモデルUF30</td><td>Memmert、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>温度制御された超音波処理器</td><td>VWR International GmbH、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラズマシステム「フェムト」、100 W</td><td>ディーナー、ドイツ</td><td></td><td></td></tr> 有機<tr><td>溶媒ごとに1つの別々のガラスシリンジ</td><td>VWR International GmbH、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>ミキサーVWRインターナショナルGmbH、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ(0.5 mlまたは1.5 ml)</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット:10-100 & マイクロ;L、50-200 &micro;l と 100-1,000&nbsp;&マイクロ;l</td> 温度制御流体セル付き<td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM(例:/ MFP-3D、BioHeater付き)</td><td>アサイルムリサーチ、サンタバーバラソフト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SiNカンチレバー、通常は窒化ケイ素(SiN)製(ばね定数100 pN / nm未満、例:MLCT)</td><td>Bruker AXS、サンタバーバラ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

原子間力分光法は、表面や界面での分子を研究する理想的なツールです。共有結合的にAFMチップ上に結合する単一分子の多種多様の実験プロトコルが提示される。同時に、AFMチップはAFMチップに結合した単一の分子を研究するための前提条件でチップと基板との間の非特異的相互作用を防止するために不動態化される。固体表面にバイオインターフェイス上の接着力、密着長さ、およびこれらの分子の自由エネルギーを決定するための分析がすぐに提示され、さらに読み出し用の外部参照が提供される。例分子は、ポリ（アミノ酸）、ポリチロシン、グラフトポリマーPI- グラム -PSおよびリンPOPE（1-パルミトイル-2- oleoyl- のsn -glycero -3-ホスホエタノールアミン）である。これらの分子は、CH 3 -SAMsのような異なる表面、水素終端ダイヤモンドから脱着や各種溶剤条件下における脂質二重層をサポートされています。最後に、力分光法の利点は、単一分子実験は真に単一分子実験で研究されているかどうかを決定するための手段を含む、議論されている。

以下では、上記の結果は、例えば分子 ​​、すなわちポリマーのポリ（アミノ酸）、ポリチロシン、グラフトポリマーPI- グラム -PSおよびリンPOPE記載、提示されている。まず、各実施例について、データ収集及びデータ準備のための試し特定の詳細が提供される。その後、これらの分子は異なる表面から脱着された実験用の例示的な結果（CH 3 -SAMs、水素終端ダイヤモンドと脂質二重層）が示されている。接着力、密着長さと自由エネルギーの決定は、導入される。 例1：自己組織化単分子膜からポリチロシンの脱着 エタノールの様々なコンテンツを持つ別のソリューションで疎水性のSAMからのポリチロシンの脱離を測定した。上述の少なくとも300力dと各溶液にカンチレバーInvOLSとバネ定数を決定したistanceトレースは各溶液について記録した。つの実験セットの実験はすべて、同一の単一のポリ（アミノ酸）を測定したことを確認するために、一日に単一のカンチレバーを用いて行った。カン...

多種多様な単一分子をAFMチップに共有結合するプロトコールが提示されます。これらの分子が固体支持体および生体界面に付着力および自由エネルギーを決定するための手順および例が提供される。

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

本手順の全体的な目的は、単一のポリマーをAFMカンチレバーチップに結合させ、同一の分子を用いて表面脱離分光実験を複数回行うことです。これは、まず第1ステップとしてチップ表面をプラズマ処理して水酸基を形成させることで達成されます。続いて、チップをアミノシラン溶液で処理することで、チップ表面にアミノ基を形成させます。第3のステップは、ポリエチレングリコール分子をアミノ基に結合させることです。これにより、チップと基板間の非特異的な相互作用を防ぎ、ポリマーのリンカー分子として機能させます。最後に、ポリマーをポリエチレングリコール分子に接合してプローブを形成します。測定結果から、この手順によって、1つのポリマー力プローブを1回の一連の実験全体、あるいは同様に数百本の力-距離曲線に対して繰り返し使用することが実際に可能であることが示唆されました。アンサンブル法と比較した単一分子実験の主な利点は、アンサンブル平均では隠れてしまう希少な構成や低頻度の状態を研究できることです。また、これらの実験はスケールが小さいため、分子動力学シミュレーションと直接的に比較することが可能です。最初のステップは、プローブ分子をカンチレバーチップに共有結合させることです。未使用の窒化シリコン製カンチレバーチップを使用し、ばね定数が10～100 pN/nmのチップを採用してください。ピンセットを使用して、それらを清潔なガラススライドまたはペトリ皿に配置します。次に、チップを載せたスライドをプラズマチャンバーに入れ、チャンバー内を真空にした後、0.25 millibar、20 wattsの条件で酸素を流し、100 wattのプラズマ処理を15分間行います。以降の工程では、プラズマ処理中に有機溶剤の蒸気を吸い込まないよう、フード内で作業してください。ガラス製のペトリ皿を用いてカンチレバーのアミノシリル化の準備を行い、試験溶液を2.5 milliliters分注します。加えて、アセトンを入れた容器を用意します。プラズマ処理が完了した後、直ちにカンチレバーを回収してください。各カンチレバーをアセトンに1秒間浸し、その後Optus溶液に入れます。そのまま室温で15分間インキュベートしてください。インキュベーションの間、構成部品への水や空気の影響を最小限に抑えるため、ペギル化の準備を開始します。あらかじめ準備しておいた2本のEPチューブ（一方はm PEGおよびNHSを含み、もう一方は色素を含むもの）を用意します。NHS PEG。各チューブの内容物の重量を測定します。次に、EG NHSが入ったチューブを用意し、クロロホルムを添加する準備をします。最終濃度が 25 millimolar となり、かつ以降のステップでカンチレバーを十分に浸せる量のクロロホルムを注ぎます。チューブをボルテックスミキサーにかけ、粉末を完全に溶解させます。EG NHSが入ったチューブを脇に置き、食事の調製を行います。NHS pegに、最終濃度が0.25 millimolarになるようにクロロホルムを加えます。ボルテックスミキサーを使用して、粉末が完全に溶解していることを確認します。次に、溶液を混合し、diet NHS pegとmethyl peg NHS分子の比率を調整します。この比率は通常1:500です。蒸発を抑えるため、蓋付きの小型ガラス製ペトリ皿を用意し、カンチレバーとなる混合液を満たします。インキュベーションを完了させます。APT試験溶液の準備として、洗浄用の容器にアセトンを約10 milliliters、クロロホルムを1つ分用意しておきます。それぞれをアセトンに2回、クロロホルムに1回浸した後、ポリエチレングリコール溶液に入れます。ディッシュに蓋をし、カンチレバーを溶液中に保持します。1時間かけて、プローブ分子（本ケースではポリアミノ酸のポリデチロシン）の共有結合によるカップリングの準備を行います。1 molar 水酸化ナトリウム溶液を用い、そこにプローブ分子を 1 mg/mL の濃度になるまで溶解させます。poly D tyrosine を使用する場合は、機能化の直前に、水酸化ナトリウムを pH 8 〜 8.5 のホウ酸ナトリウム緩衝液に置換してください。カンチレバーのポリエチレングリコール溶液中でのインキュベーションが完了したら、洗浄用の容器3つとポリチロシンボアバッファー溶液用の容器1つを用意します。洗浄用の各バッファー溶液は、クロロホルム 5 mL、エタノール 5 mL、ボアバッファー 5 mLです。ポリチロシンボアバッファー溶液は約 300 µL 使用します。カンチレバーを取り出し、まずクロロホルムに、次にエタノールに、そしてボレート緩衝液に順に浸します。ポリチロシンボレート緩衝液中に配置する前に、カンチレバーチップを1時間インキュベートします。1時間後、カンチレバーを洗浄するために、一方の容器にボレート緩衝液を約5 mL、もう一方の容器に超純水を5 mL準備します。また、保管用に超純水を20 mL用意しておきます。カンチレバーを取り出し、それぞれをBoiteバッファーに浸した後、超純水で洗浄します。次に、保存用に超純水に浸します。これで、カンチレバーをデータ収集に使用できるようになります。AFMチップの機能化および表面の調製と設置が完了したら、FMデータ収集の手順を開始します。まず、機能化したカンチレバーを、液体中での測定に適したAFMカンチレバーホルダーに装着します。次に、カンチレバーホルダーをAFMヘッドに接続します。フルイドセルに水を注ぎ、カンチレバーと表面を浸します。次に、AFMヘッドをリキッドセルまで下げます。システムを少なくとも30分間平衡化させてください。平衡状態に達した後、カンチレバーを表面から十分離れた位置に配置し、熱雑音スペクトルを記録します。表面減衰の影響を排除するために十分な信号対雑音比を得るには、10本以上のスペクトルが必要です。次に、慎重に表面へ近づけ、逆光学レバー感度を測定します。これは、カンチレバーの先端を硬い表面に押し当て、力とピエゾ移動距離の関係を記録する操作です。接触時の勾配を測定し、その逆数を取ることで逆光レバー感度を決定します。次に、逆光レバー感度と熱ノイズスペクトルを用います。熱ノイズスペクトルに調和振動子をフィッティングさせることで、カンチレバーのばね定数を決定します。次に、データ収集のための適切なパラメータを設定します。データ収集の最後に、各実験条件で多数の強制距離曲線（forced distance curves）を記録してください。システムの整合性と安定性を確認するため、感度とばね定数を再度決定します。赤色で示されたこの強制距離トレースの例は、不純水中のメチル自己組織化単分子膜からポリチロシンを脱離させた際のものである。力がゼロまで一段階的に低下していることは、単一分子の脱離を示している。黒色で示されているのはシグモイド近似である。抽出されたプラトー長とプラトー力は矢印で示されています。カンチレバーの伸長および収縮速度は0.5 microns per secondで、表面でのドウェル時間は1秒でした。測定時の液体環境の違いにより、抽出されたプラトー力に変化が生じました。これらのヒストグラムは、純水および水・エタノール混合液中での測定から抽出されたプラトー力を示しています。各溶液について、同一の単一ポリマーを用いて少なくとも300本の力-距離曲線が記録されました。ここでは、純水および水・エタノール混合液中で抽出されたプラトー長についても、同様のヒストグラムを示します。エタノールの添加により、ポリチロシンと表面との間の疎水性相互作用が弱まり、その結果、プラトー力（plateau force）の低下とプラトー長の減少がもたらされます。これは、ピークプラトー長対ピークプラトー力のこのグラフにまとめられています。習得すれば、機能化プロトコルは開発後、約4時間で完了させることができます。この手法により、物理学および化学分野の研究者が、界面におけるポリマーの接着や破断を探索することが可能となりました。

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Research

JoVE Journal

Engineering

工学

両分子が相互作用する細胞の表面上に固定されているときに受容体 -...

用接着周波数アッセイその場で</em細胞間のインタフェースにおけるクロス接合分子間相互作用の>速度論解析

セルロソームは、セルロースを消化するために設計された多酵素複合体です。AFMベースのSMFSを使用して、セルローム関連タンパク質集合体の機械的特性とフォールディング配置を研究しました。セルロソームの組み立てに関与する個々の受容体-リガンド複合体の相互作用を研究するための、タンパク質の固定化、データ取得、およびデータ解析のための完全なワークフローを紹介します。...

AFMベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索

コロイドプローブナノスコピーは、コロイドシステムの物理的安定性と凝固速度についての洞察を得るための様々な分野で使用され、生物学的システムを用いた創薬と製剤化科学を支援することができます。で説明する方法は、そのようなシステムを研究するための定量的および定性的な手段を提供します。...

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ここでは、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、単一分子力分光測定によって明確に定義された無機表面のいずれかのペプチドまたはアミノ酸との間の相互作用の力を測定するためのプロトコルを提示します。測定から得られた情報は、より良好なペプチド無機材料相間を理解することが重要です。...

単一分子力分光法を用いて無機材料とアミノ酸とペプチドの相互作用への洞察

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このプロトコルを記述する、heterobifunctional シラン カップリング剤による酸化シリコン薄膜表面の原子間力顕微鏡による単一分子力分光法のために設計するで例示されている蛋白質の共有結合固定化、RrgA の相互作用 (毛 1 先端付着性S.

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OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

原子間力顕微鏡(AFM)片持ち体先端へのプローブ分子の共有結合は、その物理的性質を調査する上で不可欠な技術である。これにより、AFMベースの単一分子力分光法を介して、高い再現性を持つ伸縮力、脱着力、ポリマーの長さを決定することができます。...

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我々は、単一分子蛍光イメージングのための最小限に流体力学的サイズを有するコロイド量子ドットの調製を記載している。従来の量子ドットに比べ、これらのナノ粒子はサイズが球状タンパク質と類似しており、単一分子の明るさ、光分解に対する安定性、タンパク質や細胞への非特異的な結合への抵抗のために最適化されています。...

1分子蛍光イメージングのためのコンパクトな量子ドット

学ぶ原子間力分光法による単一ポリマーの接着力測定手法。AFMカンチレバー先端へのポリエチレングリコールリンカー固定とプラズマ活性化を用い、生体物理学・表面化学の研究に応用可能です。

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

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