MYH6プロモーター - 選択と組み合わせたES細胞のプログラミングに基づいて、マウス心臓ペースメーカー細胞凝集体の生成

この手順の全体的な目標は、高純度の洞結節細胞を生成することです。これは、まず培地を改変して細胞分化を誘導し、垂れ下がった滴を作製して、定義されたサイズの胚体を形成することによって達成されます。次に、胚体をゼラチンでコーティングした皿の上に座らせて細胞層を形成します。

その後、抗生物質の選択が開始され、心筋細胞のみが生き残ります。最後に、細胞層を解離して、高速に鼓動する単一の洞結節細胞、または小さな洞結節体を得る。最終的に、ライブセルイメージングは、洞結節細胞の高い拍動頻度を示すために使用されます。

この方法の主な利点は、薬物検査など、高純度の副鼻腔リンパ節細胞を作製できることです。この方法は、細胞が根本的なメカニズムについての洞察を与えてくれるため、副鼻腔結節疾患における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術は、分化手順の2日前に培地を吸引することにより、フィーダー細胞からPSCを除去したテキストプロトコルで概説されているように、照射されたフィーダー細胞と共培養されたES細胞株と多能性幹細胞から開始し、この方法を開発した博士課程の学生であるJulia Yungによって研究室で発表されます。

細胞を洗浄するためにPBSの10ミリリットルを使用してください。次に、7ミリリットルのコラゲナーゼ4溶液を加え、細胞を摂氏37度で10分間インキュベートします。次に、滅菌済みの40マイクロメートルフィルターを50ミリリットルのチューブに入れます。

次に、コラゲナーゼ溶液を5回上下にピペッティングして、PSCコロニーを慎重にすすぎます。細胞懸濁液をフィルターに移し、8ミリリットルのPBSを使用してフィルターを3回すすぎます。次に、フィルターを裏返して逆さまにペトリ皿に置き、フィルターの底に10ミリリットルのPBSをピペットで入れます。

PSCコロニーを除去するには、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移し、5分間、300回遠心分離します。G.PBSを取り出し、細胞を1ミリリットルのアキュテインに懸濁し、摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、10ミリリットルのPBSを追加します。

PBSが除去されたら、細胞培養培地の10ミリリットルを使用して細胞を再懸濁し、細胞番号のシードを決定するために、500倍G.10ミリメートルでピペッティングアップし、細胞溶液を50回で囲むと、37°Cと5%二酸化炭素で2日間培養します。70%のコンフルエントに。細胞を採取し、Resusをテキストプロトコルに従って分化培地に懸濁させた後、20ミリリットルの水と5ミリリットルの吊り下げ液またはHD溶液を二次シャーレにピペットで入れて、HDの乾燥を防ぎます。

次に、トレイに最大50ミリリットルの細胞懸濁液をピペットで入れます。次に、ペトリ皿の蓋を裏返し、12チャンネルピペットを使用して、20マイクロリットルの細胞懸濁液を含む180 HDSを蓋に置きます。蓋を慎重に裏返し、ペトリ皿の上に置きます。

2日間インキュベートして細胞がEBSを形成するようにした後、二次シャーレの蓋を慎重に裏返し、2つのシャーレに由来するEBSを50ミリリットルのチューブに移します。EBSがチューブの底に落ち着くまで10分待ってから、できるだけ多くの培地を吸引します。10ミリリットルの分化媒体を使用してEBSを懸濁し、懸濁液を10センチメートルのシャーレに移します。

細胞を懸濁液中で4日間培養したら、テキストプロトコルに従って、EBSをゼラチンでコーティングされた10平方センチメートルの細胞培養皿に移し、顕微鏡下で次の2〜6日間インキュベートし、細胞が鼓動を開始した3日後に細胞の鼓動病巣と細胞層の形成を確認します。 培地を吸引し、10ミリリットルの新鮮な差別化を加えます。4日後に細胞にG 4 18のミリリットルあたり400マイクログラムを含有する培地。細胞層を吸引せずに培地を慎重に取り除きます。

次に、10ミリリットルのPBSを追加して細胞を洗浄します。PBSを慎重に除去した後、10ミリリットルのコラゲナーゼ4溶液を加え、細胞を50ミリリットルのチューブに移します。次に、37°Cで5分間インキュベートした後、懸濁液を10回ピペッティングして激しく混合し、さらに37°Cで細胞を5分間インキュベートします。

小さなクラスターの懸濁が存在する必要があります。次に、20ミリリットルのPBSを加え、300回で10分間遠心分離します。Gは、慎重にPBSを吸引し、誘導されたsino atrial bodiesまたはsabsを生成する場合は、Gの4 18 18の1ミリリットルあたり400マイクログラムを含む分化培地の12ミリリットルを使用し、細胞を懸濁し、24ウェルゼラチンコーティングプレートの6つのウェルにそれぞれ2ミリリットルを見て、分化培地を追加するのではなく、単一の節細胞を生成します。

PBSを除去した後、5ミリリットルのアキュテインを使用して細胞を懸濁し、摂氏37度で5分間インキュベートします。ピペットを上下に激しく動かします。37°Cで5分間インキュベートした後、懸濁液を混合します。

20ミリリットルのPBSを加え、12ミリリットルの分化でGの300倍で5分間遠心分離します。G4を含む媒体 18.細胞を懸濁し、24ウェルゼラチンコーティングプレート培養の6つのウェルにそれぞれ2ミリリットルを見て、テキストプロトコルに従って細胞の分析を行います。

このビデオで実証されたプロトコルを使用して、isab Sは、isab Sの解離後にここで見られるように、毎分約450拍の拍動頻度で多能性幹細胞から生成することができます。これらの細胞は、過分極活性化環状ヌクレオチド依存性陽イオンのような洞結節の機能に不可欠なタンパク質の高発現レベルを示しています。チャンネル4、HCN4、コネクシオン4、5コネクシオン30.2、MYH6。

チャネル遮断薬ZD 7 2 88、またはムスカリン受容体アゴニストカラコールで治療すると、イサブ由来の細胞は、鼓動頻度が有意に減少する。一方、ベータ副腎受容体アゴニストイソプレンは、鼓動周波数の上昇につながります。全体として、私たちの技術は、心臓ペースメーカーの機能と疾患をよりよく理解するための道を開くでしょう。

このビデオを見た後、PLUの強力な幹細胞から完全に機能する洞結節細胞を生成する方法を十分に理解しているはずです。