覚醒ラットにおける口腔内味物質投与の間に高速スキャンサイクリックボルタンメトリーと迅速ドーパミンダイナミクスの検討

この手順の全体的な目標は、口腔味密度に対するサブセカンドドーパミン反応を測定することです。これは、最初に外科手術に必要な口腔カテーテル、参照電極、炭素繊維電極を作成し、その後、高速スキャンサイクリックVテレメトリーを介して記録することによって達成されます。2番目のステップは、口腔カテーテル、頭蓋内電極、および炭素繊維電極用のガイドカニューレを外科的に埋め込むことです。

1週間後、炭素繊維微小電極を側坐核に下げて、味覚の経口送達に応答した細胞外ドーパミン放出の変化を記録することができます。記録後の最後のステップは、電極を校正し、主成分分析を使用してドーパミンに関する情報を含むデータを分離することです。最終的には、口腔内味覚と送達、および高速スキャンサイクリックボリュームテレメトリーを組み合わせて使用することで、テイテンに対するサブセカンドドーパミン反応の変化を示します。

この組み合わせた手法には、既存の方法に比べて主に 2 つの利点があります。まず、高速IC測光は時間分解能が高く、2回目のタテンの経口送達により、ラットがタチンを取得するために必要な動きが最小限に抑えられ、タチンに対するドーパミン応答をより適切に分離できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、口腔カテーテルの製作に苦労します。

ただし、良好で有料の経口カテーテルを構築すると、頬と上臼歯の間にカテーテルがぴったりとフィットし、実験が成功する可能性が高くなります。記録電極を調製するには、まず、内径0.4ミリメートルのホウケイ酸ガラスキャピラリーに直径7ミクロンのT-650炭素繊維を吸引します。次に、キャピラリーを垂直極性に配置し、最初はヒーターを55.0に設定して磁石をオフにして引っ張り、必要に応じて調整します。

顕微鏡でピペットを引っ張った後、露出した炭素繊維を切断して、ガラスから75〜100ミクロン伸びるようにします。ガラス中の繊維はしっかりと密封されなければならず、そうでなければ調製物を廃棄する。次に、3インチの30ゲージワイヤーの半分から絶縁体を剥がし、熱収縮を適用して電極をマイクロマニピュレーターに固定します。

次に、塗料がまだ濡れている間に、銀色の塗料をワイヤーに薄く塗ります。電極の開放端にワイヤーを挿入し、電極内のカーボンファイバーに取り付けます。この接点を顕微鏡で確認します。

電極をマイクロマニピュレーターに取り、熱収縮で固定します。調製した炭素繊維電極をIPAに少なくとも10分間入れて、電極表面を洗浄し、その後のドーパミンに対する感度を高めます。IPAから電極を取り外した後、炭素繊維を水道水ですすいでIPAを取り除きます。

次に、13ミリ銀線に直径0.4ミリの6ミリ銀・塩化銀メッシュの参照電極を用意し、ワイヤーのメッシュ化されていない部分を切り取り、金ピンにハンダ付けします。次に、はんだにエポキシを塗布します。次に、メッシュ部分を共重合体酸に5回浸します。

最後のディップの後、ディップの間に空気中で30分間乾燥させます。一晩風乾させます。翌日。

ワイヤーのメッシュ部分を摂氏120度で1時間焼きます。口腔カテーテルを最初にカットします。ポリエチレン100チューブを6センチメートルのセグメントに分割します。

次に、チューブセグメントの1つに小さなフラットディスクを作成します。端を溶かし、ディスクの中央にある平らな冷たい表面に押し付けます。18ゲージの針を使用して穴を開けます。チューブセグメントのもう一方の端を18ゲージの針の鈍い端に取り付けます。

次に、穴あけ機を使用して、直径6ミリメートル、厚さ3.18ミリメートルのポリテトラフルオロエチレンを数個作成します。次に、これらのディスクの中央に穴を開けて、ディスクをワッシャーにします。ワッシャーを台形にカットして、大臼歯の移植中にワッシャーを固定します。

カテーテルを完成させるには、PEチューブに取り付けられた針をワッシャーに完全に押し込み、ワッシャーをチューブと同じ高さにスライドさせます。次のプロトコルは、完了するまでに約 75 分かかります。手術の準備をしたラットから始めて、綿棒を使って口を開けます。

次に、カニューレの針を頬と最初の上臼歯の間の組織に押し込み、針が耳のすぐ後ろと内側に出るようにします。次に、カニューレを上に移動し、ワッシャーを大臼歯に固定して、カテーテルを露出した針に固定します。ワッシャーをスライドさせ、切開部にしっかりと固定します。

このワッシャーを所定の位置に固定します。ラットの頭の上に2〜4センチメートル露出したままになるようにチューブをトリミングします。次に、同じ手法を使用して、カテーテルを口の反対側に挿入します。

これに続いて、ラットを定位固定装置フレームに入れ、側坐核のコア位置に記録するためにカニューレと電極のための3つの穴を開けます。ガイドカニューレは前方1.2ミリメートル、1.4ミリメートル。外側トレマ。

プラスチックベースが頭蓋骨と同じ高さになるまで、カニューレ装置を下げます。ガイドカニューレの反対側の半球に参照電極を置きます。基準を硬膜の約2ミリメートル下に下げます。

次に、刺激電極を後方5.2ミリメートル、側方1.0ミリメートルの位置に配置します。腹側被蓋領域をターゲットにします。刺激電極を硬膜から8.0ミリメートル下まで下げます。

次に、コンポーネントをネジとセメントで固定し、術後ケアを提供します。実験を行う前に、常に200マイクロリットルの水を注入して経口カニューレの開存性を確認し、ラットがダミーのカニューレを取り外し、50%ヘパリンを2滴追加して記録部位から水の味がするかどうかを確認します。ダミーは、記録サイトから2ミリメートル以内にあってはなりません。

次に、VTAに埋め込まれた刺激装置にヘッドステージを取り付けて安定させ、次に記録電極を側坐核コアに下げます。次に、テキストプロトコルに従って、トレーニングデータセットを作成します。常に少なくとも2分間待つが、刺激の間には最大4〜5分、小胞の再装填を可能にする必要がある。

実験で最も重要なステップは、高品質の電極を得ることです。背景が立ち上がり相上の特徴的な丸みを帯びた形状である場合、良好な電極です。丸みを帯びた形状が小さいか、適用された波形とほぼ一致する場合は、別の電極を試してください。

背景がシフトされた場所にある場合は、適用された波形に0.1ボルト刻みで正の方向にオフセットシフトを適用します。録画サイトでトレーニングセットが生成されたら、1〜3分ごとに200マイクロリットルのタテンを注入しながらデータを収集します。その後、少なくとも30分待ってから、同じ方法で次の味を注入します。

口腔内カテーテル留置と組み合わせたFSCVを使用して、ショ糖のアップAITが側坐核コアの位相性ドーパミン放出をどのように調節するかを調べました TATEN注入前の側坐核コアの位相性ドーパミン放出の堅牢な増加を引き起こしました トレーニングセットが取得された後、側坐核コアの位相性ドーパミン放出の堅牢な増加を引き起こしました トレーニングセットが取得された後、200マイクロリットルのスクロースの6.5秒注入 上昇で生成された赤いバーで示されています電流は白い矢印で示されています。これは、白い破線で示されているドーパミンの酸化電位で発生し、データを濃度対時間プロットに変換します。PCAが味に応答して増加した電流がドーパミン濃度の増加の結果であることを確認した後。

側坐核のコアにFSCV記録中に注入された別のタチンメントールは、メントールの注入後にもドーパミン濃度の増加が観察されました一度習得すると、口腔内およびカニューレ挿入を組み合わせた手術を75分で行うことができます。この手法は、これらのプロセス中のサブセカンドドーパミンシグナル伝達に関する質問に答えるために、競争的および嫌悪的なパブロフおよびオペラ条件付けなどの他の形態の行動と組み合わせることができます。