腫瘍間質相互作用のための三次元共培養モデル

この手順の全体的な目的は、3次元共培養法を用いて、肺がん細胞とがん関連線維芽細胞の間の細胞間相互作用を調べることです。これは、採取した肺組織を1 mm大に細切し、ヒト肺がん関連線維芽細胞を初代培養することで達成されます。次のステップでは、トリプシン処理した細胞を用いてコラーゲン溶液を混合し、線維芽細胞を埋没させたコラーゲンゲルを調製し、6ウェルプレートに移してゲル化させます。

次に、がん細胞と線維芽細胞の三次元共培養を調製するため、各ゲルの表面に肺腺がん細胞を播種し、ゲルをウェルの端から切り離して浮遊培養にします。最終ステップとして、収縮したゲルを6ウェルプレート内のメッシュ上に配置して空気にさらし、気液界面培養および浸潤アッセイを行います。最終的に、組織学的検査を用いて、がん細胞の浸潤と形態学的変化を評価します。

この手順の既存の手法（二次元単層培養など）に対する主な利点は、三次元培養条件下で多細胞間の相互作用を調査できることです。この手順は、テキストプロトコルに記載および参照されている通り、採取した肺組織からの線維芽細胞の一次培養から始まります。このビデオでは、ヒト肺がん組織の代わりにマウス肺を使用しています。

肺組織サンプルを、培地のない10 cmの組織培養皿に置きます。滅菌鉗子とメスを用いて、組織を約1 mmサイズの小さな断片に切り分けます。この際、切片を乾燥させないように注意してください。乾燥すると細胞の増殖効率が低下します。各切片の周囲に空白領域を確保するため、肺組織の小片を互いに離して配置します。

メスを用いて組織培養皿の表面に傷をつけます。あるいは、組織片を被覆することで、数回の継代後の細胞増殖および細胞伝播の効率を高めることができます。まず、各ウェルの1.5 centimeter離れた2点にシリコングリースを塗布します。

次に、刻んだ組織片を各ウェルの中心に個別に配置します。その後、シリコングリスを用いてカバーガラスをプレートの表面に取り付けます。組織切片が乾燥する前に、ディッシュまたは6ウェルプレートに培養液を緩やかに加えます。

効率的な細胞の増殖は、大部分が失われます。サンプルが乾燥している場合、コラーゲンゲルの形成のために組織切片が剥がれるのを防ぐため、培地を急激に注入しないでください。線維芽細胞を1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、トリプシンを加えて約5分間トリプシン処理し、増殖した細胞を剥離させます。

37 °Cで、10% FBSを添加した9 mLのDMEMを用いて細胞を剥離させ、培液に懸濁した細胞を10 mLチューブに回収し、200〜300 ×gで遠心分離して細胞ペレットを形成させます。得られたペレットを100% FBSを用い、細胞密度 0.5 × 10⁶ cells/mLとなるように再懸濁します。コラーゲンゲルの調製前に、冷蔵庫内で試薬、ピペット、およびチューブを冷却しておきます。

次に、線維芽細胞懸濁液をFBS、Type one A collagen 5X-DMEM、および再構成バッファーと混合し、コラーゲンゲルを調製します。ピペッティング中に気泡が混入しないように注意しながら、均一な混合物になるまで激しくピペッティングしてください。その後、この混合液を6ウェルプレートの各ウェルに3 mLずつ加え、37 °Cのインキュベーター内で30〜60分間、静置してゲル化させます。コラーゲンゲル上でのがん細胞培養のため、がん細胞を3D共培養培地を用いて1 × 10⁵ cells/mLの密度で再懸濁します。

再懸濁したA549肺腺がん細胞溶液2 mLを、各ゲルの表面に分注します。ゲルの収縮を行うため、実験条件に応じて共培養におけるがん細胞または線維芽細胞の数を調整してください。がん細胞をコラーゲンゲルに接着させるため、ゲルを37 °Cで一晩インキュベートします。

その後、それぞれを剥離し、各ウェルで浮遊培養を行います。6ウェルプレートにおいて、2〜3日ごとに21ゲージの斜め切り針または小型スパチュラを用いて、各ゲルをウェルの端から切り離します。各ウェルの3D共培養培地を2 mLで更新してください。

5日間にわたり、毎日各ゲルのサイズを測定します。最後に、コラーゲンゲルの解析に関するテキストプロトコルを参照してください。コラーゲンゲルを37 °Cで5日間培養した後に行います。

収縮したゲルをメッシュ上に置き、空気にさらします。市販のフローサイトメトリー用セルストレイナーを用いて、新しい6ウェルプレートにメッシュを作成してください。各ウェルに3D共培養培地を11 mLずつ静かに満たします。

滅菌済みのスプーンを用いてゲルをメッシュ上に配置し、この条件下でゲルに残っている培地を除去します。ゲルを培地に浸し、ゲルの上面を空気にさらします。この培養条件を気液界面（air liquid interface）と定義します。

腫瘍微小環境を模倣したこの共培養法は、コラーゲンゲルに埋め込まれた線維芽細胞とがん細胞との相互作用を研究するための有用なツールです。線維芽細胞を埋め込んだコラーゲンゲル上に 5 49 細胞を共培養し、ゲルを培地中のメッシュ上に配置することで、5 49 細胞の層を空気にさらしました。ここでは、6ウェルプレートのウェル内のメッシュ上に配置されたゲルの代表的な写真と、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色による組織学的解析の結果を示しています。

3次元培養ゲルの横断面を染色したところ、肺癌関連線維芽細胞を埋入したコラーゲンゲル内へ細胞が浸潤していることが明らかになりました。この手順に続き、遺伝子発現解析やノックダウンなどの他の手法を用いることで、腫瘍ストロマ相互作用における特定の遺伝子機能など、さらなる疑問を検証することが可能です。