胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

本手順の目的は、げっ歯類の中脳腹側から一次ニューロンを効率的に単離し、培養することです。まず、げっ歯類胚の中脳を解剖し、次に中脳腹側を慎重に単離することでこれを達成します。

次に、単一細胞懸濁液を得るために神経組織を解離させる必要があります。最終ステップとして、一次ニューロンを少量の容量でカバーガラス上に播種し、その後、接着した細胞を24ウェルプレートに移行させます。最終的に、抗体と免疫蛍光顕微鏡を用いて、培養液中のドーパミン作動性ニューロンを同定します。

中脳のドパミン作動性ニューロンは、認知における運動と感情の制御や脳の報酬系など、いくつかの機能に関与しています。また、パーキンソン病、依存症、統合失調症を含む神経学的および神経精神医学的疾患にも関与しています。本手法では、腹側中脳の修復について解説します。

神経細胞培養は、ドーパミン作動性ニューロンの生理学および細胞特性の研究や、パーキンソン病などの疾患における変性の原因を解明するために利用できます。まず、カバーガラスを準備します。

70% ethanolで30分以上煮沸し、油脂を完全に除去します。その後、カバーガラスをオートクレーブで滅菌します。カバーガラスを24ウェルプレートに移し、各ウェルにpolyol all atheneを0.5 mLずつ加えます。

プレートを室温で1時間インキュベートします。ワーキングポリオール溶液またはAthene溶液の保存期間は1ヶ月であることに注意してください。その後、カバーガラスを1回あたり0.5 mLの水で3回洗浄します。

これら3回の洗浄をすべて行わなければ、培養細胞は24時間生存できません。次に、ラミニン溶液を調製します。まず、氷上でゆっくりと融解させてください。

次に、ラミニンを冷えたD-M-E-M-F 12に溶解させ、すぐに使用します。調製したばかりのラミニン作動液を各ウェルに 0.5 mL ずつ加え、プレートを 37 °C で一晩インキュベートします。最後に、ガラスピペットを準備する際、チップの先端を通常の半分のサイズまで研磨します。

腹部を切開して子宮嚢を露出し、ピンセットを用いて子宮を切り出します。子宮を100 mmディッシュに入れた氷冷HBSSに移し、ピンセットで胚の回収を開始します。分離した胚を冷たいHBSSが入った新しいディッシュに移します。

次に、解剖顕微鏡を用いて、腹側中脳のこの部位を10倍の倍率で観察する準備をします。バイオシザーまたはピンセットを使用し、脳の峡部および中脳と頭蓋弓の境界領域を切断することで、中脳と頭蓋弓を切り出します。中脳全体を取り出した後、背側中脳の内側を切開します。

ピンセットを使用して、髄膜を除去します。このステップは、ニューロン培養を成功させるために極めて重要です。非ニューロン細胞は培養条件下で死滅し、隣接するニューロンに悪影響を及ぼすシグナルを送るためです。

次に、中脳組織をバタフライ状に平坦化します。滅菌済みのブレードを用いて、腹側中脳を残し、各ウィングの約半分を切り取ります。腹側中脳を、15 mLコニカルチューブに入れた氷冷HBSSに移します。

次に、1時間以内にできるだけ多くの胚の解剖工程を進めてください。1時間以上氷上で保持された胚は、細胞生存率が低下します。ドーパミン作動性ニューロンの高い生存率を確保するため、解剖から播種までの時間は1時間を超えないようにしてください。

さらに、フード下でのニューロンの生存には、髄膜の除去が極めて重要です。腹側中脳の回収液からHBSSを除去します。その後、組織12片分に十分な量となる、温めた0.05%tripsin A DTAを1mL加えます。

組織を37 °Cで5～10分間インキュベートします。クリーンベンチ内で、トリプシンA DTAを1 mLの不活化培地と交換します。緩やかに撹拌して混合させた後、不活化培地を除去しますが、解離した細胞が廃棄されないよう、十分な量の培地を残しておきます。

次に、細胞を流出させないように注意しながら、組織を完全培地で2回洗浄します。続いて、完全培地を1 mL加えます。その後、気泡が入らないように注意しながら、火炎研磨したピペットで組織をトリチュレーションし、単一細胞懸濁液を得るまで撹拌します。

8〜10代程度の継代で十分です。その後、細胞を400 Gで5分間遠心分離します。培地を除去し、1 mLの完全培地で細胞を再懸濁します。

細胞を最大4回ピペッティングして懸濁液にします。まず、ヘモサイトメーターを用いてトリパンブルー排除法により、懸濁液中の細胞数のカウントおよび細胞状態の評価を行います。

次に、細胞懸濁液を1 µLあたり1500細胞に調整します。その後、滅菌済みのマイクロ遠心チューブのキャップを100 mmディッシュに移します。ピンセットを使用して、準備したカバーガラスをキャップの上に配置します。

カバーガラスは洗浄せず、乾燥させないように注意してください。各カバーガラスに懸濁液を100 microlitersずつ分注します。この somewhat unusual method により90%の培養生存率が得られ、成功のための極めて重要なステップとなります。

その後、ペトリ皿に蓋をし、インキュベーターで1時間培養します。培養後、カバーガラスを培地ごと、各ウェルに37 °Cに温めた完全培地400 µLが入った24ウェルプレートへ慎重に移し、細胞を一晩培養します。最初の数時間が細胞の生存にとって最も重要であり、24時間以内に安定します。各ウェルに完全培地0.5 mLを緩やかに加えます。

2週間ごとに行います。培地の半分を交換してください。培養液が黄色に変化した場合は、培地の半分交換を早めて行うことができますが、それでも交換回数は少なく抑える必要があります。

これらの条件下で、ドーパミン作動性ニューロンは6週間以上生存します。培養2週間後、チロシン水酸化酵素およびニューロンマーカーに対する免疫組織化学染色を行うと、細胞の1%がドーパミン作動性であることが示されます。ニューロンの突起は、播種から2時間以内に現れます。

培養1日目の終わりまでに、軸索と樹状突起を区別できるようになります。最終的に、この手順に従うことで、ニューロンは6週間以上生存し、広範な伸展を示します。ドパミン作動性ニューロンにおけるメカニズム的な疑問を解決するために、ウイルス導入、免疫蛍光染色、または電気生理学などの他の手法を実施することが可能です。