Name: 胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学ぶ胚性齧歯類の腹側中脳からドーパミンニューロンを単離・培養する方法。免疫蛍光顕微鏡で細胞を同定し、パーキンソン病の神経変性機構を研究するための信頼性の高いin vitroモデルを構築します。

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この作業は、インペリアル・カレッジ・ロンドンの脳科学部門のスタートアップ資金を使用して行われました。

注：動物は維持され、施設のガイドラインに準拠して処理され、すべての動物の手順はインペリアルカレッジの動物保護によって承認されたと倫理審査機関（AWERB）とホームオフィス、ハーバード大学施設内動物管理使用委員会（IACUC）し、連邦および州の規制に準拠した。 1.試薬と機器のセットアップ<ol><li>解凍し、アリコートし、-80ºCで保存し、1mg / mlのラミニンソリューション。 1~2μgの/ cm 2のコーティング濃度で得られた1mlのDMEM / F12中で2μlの溶解する。 注：氷上で解凍ラミニンゆっくりと冷たいDMEM / F12に溶解し、直ちにプレート/カバーガラスに追加します。 </li><li> 4ºCで0.01％の425ミリリットルのPBS中のポリ-L-オルニチン、店舗の75ミリリットルに希釈する。 注：作業溶液の貯蔵寿命は1ヶ月までです。 </li><li>がたまでために、4℃で25％（wt / vol）のPBS中のBSA、pH7.4で、店舗を溶解AR。 </li><li> （HBSS中）は、50％FBS失活メディアを準備します。 </li><li> - （+） - グルコース（重量/体積）、0.25％のBSA（重量/体積）の50 U / mlのペニシリンおよびストレプトマイシン、1×N2サプリメント、5％（容量/容量）FBS、0.36％のDを追加することによって、完全培地を調製4ºCでのDMEM / F12とストア。 注：貯蔵寿命は10日までです。 </li><li>グリースとオートクレーブの痕跡を除去するために少なくとも30分間、70％（体積/体積）エタノール沸騰置きカバーガラス。 </li><li>場所の24ウェルプレート中のカバーガラスと、各ウェルに500μlのポリ-L-オルニチン溶液を加える。 RTでの組織培養フードの下で1時間インキュベートし、その後、500μlの水で3回洗浄する。各プレートに500μlのラミニン溶液を添加し、37ºCの加湿組織培養インキュベーターでO / Nインキュベートする。 注記：洗浄は、24時間培養後、細胞の死をポリ-L-オルニチンで3回以上の結果を洗浄し、ラミニン処理後に必要でないが。 </li><li>天然ガスやトーチF上のガラスピペットの先端を磨くラメ。 注：このステップの後、先端の直径は、通常のサイズの約半分である必要があります。 </li><li>オートクレーブはさみとオートクレーブを用いて、1.5ミリリットルマイクロチューブのキャップをカット。 </li></ol>胚腹側中脳の2解剖<ol><li>麻酔をかけるには、CO 2吸入によって（E12.5）ダム妊娠タイムアウトした後、頚椎脱臼により安楽死させる。 </li><li> 70％エタノールで腹部をスプレーし、子宮嚢がすべて露出するまで腹部切開を作る。鉗子を使用すると、膣の添付ファイルをカットし、子宮を取り除く。 100ミリメートルペトリ皿に、氷冷HBSS中で子宮を置きます。 </li><li>鉗子（ 図1C）を使用して、子宮と羊膜嚢から胚を削除します。新鮮な氷のように冷たいHBSS中で胚を置きます。 メモ： 図1Dに長方形は胚の腹側中脳の位置を示している。 </li><li>解剖顕微鏡（10倍の倍率）の下で胚を置き、中脳を解剖bioscissorと鉗子を（ 図1Eは 、切開のラインに対して図1Aを参照してください）を使用して、地峡と中脳、間脳境界領域で脳を切断することによりアーチ。 </li><li>全体中脳を取り出した後、背内側中脳（ 図1F）でカットをする。 </li><li> 2鉗子（ 図1H）を使用して、髄膜を削除します。 注：重要なステップ：このステップは、最適な神経細胞の収量と生存に不可欠である。培養条件は、脳細胞のために最適であるため、周囲の組織からの細胞のほとんどは、めっき後に死亡し、この組織からのアポトーシスシグナルは培養物の完全性に損傷を与えることができる。 </li><li>滅菌シェービングブレード（ 図1H、I）を使用して、蝶形状を観察し、各翼の約半分を切断するためにペトリ皿に脳組織を平らにする。 メモ： 図1Jは、孤立した腹側中脳を示している。 </li><li>転送15ミリリットルコニカルチューブ中の氷冷HBSSに腹側中脳の部分と次の胚を進める。 注：手順2.1から2.8には1時間以上を服用してはいけません。氷上でこの時間枠を越えて胚を維持することが有意に細胞生存率を減少させる。 </li></ol>腹側中脳細胞の3解離<ol><li>層流フードの下で腹側中脳の部分を転送します。 HBSSを削除し、（腹側中脳の最大12個のために十分なボリューム）をコニカルチューブに予め温め1ミリリットル（37℃）0.05％トリプシン-EDTAを追加します。 5〜10分間37ºCでの組織をインキュベートする。 </li><li>ボンネットの下にトリプシン-EDTAを削除し、組織に1ミリリットルの脱活性化培地を（血清はトリプシンを非アクティブにします）を追加します。 </li><li>非アクティブ化媒体を除去し、二回完全培地1ミリリットル中の組織を洗う。 NOTE：解離細胞を廃棄防ぐため、チューブから全培地を除去し、組織をピペット避ける。 </li><li> 1ミリリットル完全培地とトリットを追加ファイアーポリッシュガラスピペットで組織を尿酸。気泡の形成を回避し、単一細胞懸濁液が得られるまで粉砕する続ける。 注：通常、8-10が完全に解離のために必要とされる制限された先端を通過する。 </li><li>室温で5分間400×gで細胞を遠心し、培地を除去。 </li><li>再懸濁ゆっくりピによって完全培地1ミリリットル中にペレットを上下に4倍のために。 </li></ol> 4.メッキ腹側中脳細胞<ol><li> 90μlのトリパンブルー溶液を用いて細胞懸濁液10μlを混合し、血球計数器を用いて細胞の数を数える。 注：細胞の生存率も、この段階で確認することができる。 </li><li> 100ミリメートルペトリ皿で​​滅菌マイクロ遠心チューブのキャップを置き、ポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングしたカバースリップを転送し、鉗子、キャップの上に一度に1を使用した。 注：カバースリップを洗浄しないでください、これはuneve原因となることがありますので、ラミニンを乾燥避けるn個の文化や細胞の生存性の減少。 </li><li> （ボリュームが流出せずにカバースリップの表面を覆うように最適である）完全培地を追加することによって、1μLあたり1500細胞に音量を調整し、各カバースリップの上に100μlの細胞懸濁液（150,000細胞の合計）を追加します。ペトリ皿を閉じて、加湿した組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で1時間、それらをインキュベートする。 NOTE：CRITICAL STEP：この手順は、細胞の付着および生存率を高めるために、胚あたりのカバースリップの数を増加させるために必要とされる。あるいは、細胞を（カバーガラスを含む）をウェルに直接転送することができるが、細胞の数は、（代わりに15万）ウェルあたり350,000増加させるべきである。直接転送が原因プレート（横またはカバースリップの下）に付着する細胞の約3-4カバースリップを生じながら、言い換えれば、この方法を使用して、8-10カバースリップを、取得することができる。平均viabiliこの方法を使用して培養物のtyが、約90％であった。 </li></ol> 5.文化成長および維持<ol><li>インキュベーションの1時間後に、慎重に400μlの予め温めた（37ºCに）完全培地を含む24ウェルプレートに培地を含むカバースリップを転送する（総容量：500μl）を。 37ºCで細胞のO / Nをインキュベートする。 </li><li>井戸のインキュベーション後24時間以内に、静かに各ウェルに500μlの完全培地を追加します。 注：最初の数時間は、ドーパミン作動性ニューロンの生存のための最も重要な段階で、生存細胞の数は、この点を越えて大きく変化しない。 </li><li>最初の2週間、または培地が黄色になるまで培養液に追加のメディアを追加しないでください。以上の2週間または新鮮な完全予め温めメディア（通常は隔週）と黄色、メディアの交換の半分（500μL）中〜色の変化のために培養した場合。 注：内のドーパミン作動性ニューロン培養物は、これらの条件下で6週間以上生存するであろう。 </li></ol>

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</ol>

利益相反は宣言されていません。

中脳ドーパミン作動性ニューロンは、中枢神経系におけるドーパミンの主な供給源である。これら3つのグループに分割され、黒質緻密部（SNpc）、腹側被蓋野（VTA）及びretrorubralフィールド（RRF）10、11。 SNpcとVTAのニューロンは、そのような感情、動機と運動行動の制御などの機能に関与する主要なドーパミン作動性経路に上昇、中間皮質、中脳辺縁系と黒質線条体を与える。 SNpcと黒質線条体系の機能的破壊のニューロンの終焉は、第二の最も顕著な神経変性疾患、パーキンソン病（PD）12,13の主な病理学的特徴である。現在の治療アプローチは疾患の症状に対処し、停止または変性を遅くし、遅い、進行性の細胞の喪失の原因はまだ14-16不明ではありません。したがって、in vivoおよび developmeの研究のためのインビトロ技術の開発このニューロン集団の、NTAL生化学、および生理学的特性PDの病因を理解するために、新たな治療アプローチの開発に不可欠である。 ここでは、そのような...

黒質のドーパミン作動性ニューロンの損失は、緻密は、パーキンソン病（PD）、第二の最も優勢な神経変性疾患の基本的運動症状につながる様部。この中脳ニューロン集団の終焉の根本的な原因は知られていない。開発を担当し、神経生理学的特性およびmesDAニューロンの生存を調節する生化学的経路を研究するために、いくつかの細胞培養と動物モデル系が使用されている。ラットは、ドーパミン作動性細胞株1RB 3 AN 27（N27）、ヒトドーパミン作動性の神経芽細胞腫細胞株SH-SY5Y、MN9Dおよびヒトの脳細胞をLUHMESマウスドーパミン作動性のハイブリッド細胞株を含む、不死化細胞株は、生化学的および限定された機構研究1のために使用されている-5。 mesDAニューロンの特定の損失の研究のために、いくつかの神経毒をベースと遺伝モデルが6-8を開発されてきた。初代腹側中脳の文化、ドーパミン作動性ニューロンの神経細胞とシナプスのプロパティと、この一般的な疾患の病因に関与する経路を研究するための不可欠なツールを提供する。 ここでは、より高い生存性と胚あたりのカバースリップの増加収量、結果の修正が含まれている中脳ドーパミン作動性ニューロンの分離のための詳細なプロトコルを提示する。前成熟したE12.5マウス中脳（ラットにおいてE14.5）の使用は、生存性を向上させます。この年齢でのニューロンは解剖時に無傷の細胞を残している、まだ軸索を開発し、それによって大幅に生存能力を高め、ストレスを最小限にしていない。また、腹側中脳の注意深い解剖は、このプロトコルのセクション2で説明したように、さらに生存性を高めます。胚あたりのカバースリップの数を増加させるために、代替的なメッキ法は、このプロトコルのセクション4に示されている。これは、下の4カバーガラスと比較して胚当たり最大10カバーガラスの収率をもたらす標準めっき条件は、このように、実験あたりの動物の量を減らす。 軸索とdentritesの文化展示成長におけるニューロンは、シナプス結合を形成し、生細胞イメージング、免疫細胞化学的および電気生理学的研究のために、これらの培養物は適して神経細胞とシナプスマーカーの存在を明らかにする。さらに、ニューロン培養の使用は遺伝的および薬理学的操作を容易にします。 in vitroでの 2日目からの神経突起の伸長が発生研究が可能になります。また、（6週間まで）培養物の長期生存は、これらのニューロンの遅い、進行性変性を研究するのに適したものとなる。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコ改変イーグル中栄養混合物 F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液 (HBSS) (1X)、液体</td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、熱不活化 (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16140</td><td></td></tr><tr><td>N2 サプリメント (100X)、液体</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース水溶液(45%(重量/vol)</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン BSA</td><td>Sigma</td><td>A9430</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫基底膜からのラミニン</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン(0.05% (wt/vol)</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)細胞培養試験</td><td>済みSigma&nbsp;</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>抗チロシンヒドロキシラーゼ (Th) 抗体</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P60101-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン、0.01%溶液</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>抗Map2 (微小管関連タンパク質-2Aおよび-2B) 抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>抗シナプシン-1抗体</td><td>ミリポア</td><td>AB1543P</td><td></td></tr><tr><td>アレクサ フルーア 488 ロバ 抗ウサギ IgG&nbsp;&nbsp;抗体</td><td>分子プローブ</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ロバ抗ウサギ IgG&nbsp;&nbsp;抗体</td><td>分子プローブ</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ抗ヒツジ IgG&nbsp;&nbsp;抗体</td><td>分子プローブ</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ロバ抗ヒツジ IgG&nbsp;&nbsp;抗体</td><td>分子プローブ</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ロバ抗マウスIgG&nbsp;&nbsp;抗体</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21203</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution (0.4% (wt/vol))</td><td>Biowhittaker</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>倒立位相差顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 40 C</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>May-45</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slip Forceps&ndash;デュモクセル</td><td>ファインサイエンティフィックツール</td><td>11251-33</td><td></td></tr><tr><td>Two Dumont #45鉗子&ndash;デュモクセル</td><td>ファインサイエンティフィックツール</td><td>11245-30</td><td></td></tr><tr><td>ブレードホルダー/ブレーカーフラットグリップ-11cm</td><td>ファインサイエンティフィックツール</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>学生用アイリスはさみ-ストレート11.5cm</td><td>ファインサイエンティフィックツール</td><td>91460-11</td><td></td></tr>光ファイバー<tr><td>ハロゲンイルミネーター</td><td>ニコン</td><td>MKII</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てホウケイ酸ガラスパスツールピペットフィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Proscitech</td><td>SVZ2NIOU</td><td></td></tr><tr><td>0.2&micro;m 滅菌フィルターユニット</td><td>Nalgene</td><td>NL-CE-156-4020</td><td></td></tr><tr><td>100x20 mm シャーレ</td><td>BD Biosciences</td><td>351005</td><td></td></tr><tr><td>ラウンドカバー スリップ #1 厚さ ドイツガラス 12 mm</td><td>ベルコガラス</td><td>1943-10012&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

中脳ドーパミン作動性(mesDA)ニューロンの変性は、パーキンソン病の病理学的特徴です。生理学的機能に関与する生物学的プロセスと、これらのニューロンの脆弱性と死の研究は、この一般的な神経変性疾患の根本的な原因を理解し、治療法を解明するために重要です。mesDAニューロンの初代培養物は、疾患の経過におけるこれらのニューロンの発生、長期生存、および変性を理解するために、分子的、生化学的、および電気生理学的特性を調査するためのツールを提供します。ここでは、E12.5マウス(またはE14.5ラット)胚から中脳ドーパミン作動性ニューロンを単離、培養、維持するための詳細な方法を紹介します。このプロトコルで最適化された細胞培養条件により、軸索および樹状突起、シナプス結合、およびその他のニューロン形態学的特性の存在が得られ、培養物はこのニューロン集団の生理学的、細胞生物学的および分子的特性の研究に適しています。

チロシンヒドロキシラーゼ（TH）に対する免疫組織化学は、培養中の細胞の0.5〜1％の間でドーパミン作動性であることを示しています。チロシンヒドロキシラーゼ（TH）と微小管関連タンパク質2（MAP2）抗体（ 図3）を使用して、神経突起は、めっき後2時間以内に表示され、初日によって、軸索と樹状突起が区別できる（ 図2）である。ニューロンは、以上の6週間生き残るためには、大規模な成長を示している。先に示したように培養物中のニューロン - グリア比率は、培地中の血清の濃度に直接関連している。比較的純粋なニューロン培養物を得ることができる培養物からFBSを排除しながら、我々は、他の血清の添加は、培養9にドーパミン作動性ニューロンの生存を増加させることを見出した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52475/52475fig1.jpg" /> を単離するための図...

パーキンソン病中の中脳ドーパミン作動性ニューロンの変性の原因は完全には理解されていません。細胞培養システムは、これらのニューロンの神経生理学的特性を研究するための重要なツールを提供します。ここでは、神経変性のin vitroモデリングに利用できる最適化されたプロトコルを紹介します。

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

本手順の目的は、げっ歯類の中脳腹側から一次ニューロンを効率的に単離し、培養することです。まず、げっ歯類胚の中脳を解剖し、次に中脳腹側を慎重に単離することでこれを達成します。次に、単一細胞懸濁液を得るために神経組織を解離させる必要があります。最終ステップとして、一次ニューロンを少量の容量でカバーガラス上に播種し、その後、接着した細胞を24ウェルプレートに移行させます。最終的に、抗体と免疫蛍光顕微鏡を用いて、培養液中のドーパミン作動性ニューロンを同定します。中脳のドパミン作動性ニューロンは、認知における運動と感情の制御や脳の報酬系など、いくつかの機能に関与しています。また、パーキンソン病、依存症、統合失調症を含む神経学的および神経精神医学的疾患にも関与しています。本手法では、腹側中脳の修復について解説します。神経細胞培養は、ドーパミン作動性ニューロンの生理学および細胞特性の研究や、パーキンソン病などの疾患における変性の原因を解明するために利用できます。まず、カバーガラスを準備します。70% ethanolで30分以上煮沸し、油脂を完全に除去します。その後、カバーガラスをオートクレーブで滅菌します。カバーガラスを24ウェルプレートに移し、各ウェルにpolyol all atheneを0.5 mLずつ加えます。プレートを室温で1時間インキュベートします。ワーキングポリオール溶液またはAthene溶液の保存期間は1ヶ月であることに注意してください。その後、カバーガラスを1回あたり0.5 mLの水で3回洗浄します。これら3回の洗浄をすべて行わなければ、培養細胞は24時間生存できません。次に、ラミニン溶液を調製します。まず、氷上でゆっくりと融解させてください。次に、ラミニンを冷えたD-M-E-M-F 12に溶解させ、すぐに使用します。調製したばかりのラミニン作動液を各ウェルに 0.5 mL ずつ加え、プレートを 37 °C で一晩インキュベートします。最後に、ガラスピペットを準備する際、チップの先端を通常の半分のサイズまで研磨します。腹部を切開して子宮嚢を露出し、ピンセットを用いて子宮を切り出します。子宮を100 mmディッシュに入れた氷冷HBSSに移し、ピンセットで胚の回収を開始します。分離した胚を冷たいHBSSが入った新しいディッシュに移します。次に、解剖顕微鏡を用いて、腹側中脳のこの部位を10倍の倍率で観察する準備をします。バイオシザーまたはピンセットを使用し、脳の峡部および中脳と頭蓋弓の境界領域を切断することで、中脳と頭蓋弓を切り出します。中脳全体を取り出した後、背側中脳の内側を切開します。ピンセットを使用して、髄膜を除去します。このステップは、ニューロン培養を成功させるために極めて重要です。非ニューロン細胞は培養条件下で死滅し、隣接するニューロンに悪影響を及ぼすシグナルを送るためです。次に、中脳組織をバタフライ状に平坦化します。滅菌済みのブレードを用いて、腹側中脳を残し、各ウィングの約半分を切り取ります。腹側中脳を、15 mLコニカルチューブに入れた氷冷HBSSに移します。次に、1時間以内にできるだけ多くの胚の解剖工程を進めてください。1時間以上氷上で保持された胚は、細胞生存率が低下します。ドーパミン作動性ニューロンの高い生存率を確保するため、解剖から播種までの時間は1時間を超えないようにしてください。さらに、フード下でのニューロンの生存には、髄膜の除去が極めて重要です。腹側中脳の回収液からHBSSを除去します。その後、組織12片分に十分な量となる、温めた0.05%tripsin A DTAを1mL加えます。組織を37 °Cで5～10分間インキュベートします。クリーンベンチ内で、トリプシンA DTAを1 mLの不活化培地と交換します。緩やかに撹拌して混合させた後、不活化培地を除去しますが、解離した細胞が廃棄されないよう、十分な量の培地を残しておきます。次に、細胞を流出させないように注意しながら、組織を完全培地で2回洗浄します。続いて、完全培地を1 mL加えます。その後、気泡が入らないように注意しながら、火炎研磨したピペットで組織をトリチュレーションし、単一細胞懸濁液を得るまで撹拌します。8〜10代程度の継代で十分です。その後、細胞を400 Gで5分間遠心分離します。培地を除去し、1 mLの完全培地で細胞を再懸濁します。細胞を最大4回ピペッティングして懸濁液にします。まず、ヘモサイトメーターを用いてトリパンブルー排除法により、懸濁液中の細胞数のカウントおよび細胞状態の評価を行います。次に、細胞懸濁液を1 µLあたり1500細胞に調整します。その後、滅菌済みのマイクロ遠心チューブのキャップを100 mmディッシュに移します。ピンセットを使用して、準備したカバーガラスをキャップの上に配置します。カバーガラスは洗浄せず、乾燥させないように注意してください。各カバーガラスに懸濁液を100 microlitersずつ分注します。この somewhat unusual method により90%の培養生存率が得られ、成功のための極めて重要なステップとなります。その後、ペトリ皿に蓋をし、インキュベーターで1時間培養します。培養後、カバーガラスを培地ごと、各ウェルに37 °Cに温めた完全培地400 µLが入った24ウェルプレートへ慎重に移し、細胞を一晩培養します。最初の数時間が細胞の生存にとって最も重要であり、24時間以内に安定します。各ウェルに完全培地0.5 mLを緩やかに加えます。2週間ごとに行います。培地の半分を交換してください。培養液が黄色に変化した場合は、培地の半分交換を早めて行うことができますが、それでも交換回数は少なく抑える必要があります。これらの条件下で、ドーパミン作動性ニューロンは6週間以上生存します。培養2週間後、チロシン水酸化酵素およびニューロンマーカーに対する免疫組織化学染色を行うと、細胞の1%がドーパミン作動性であることが示されます。ニューロンの突起は、播種から2時間以内に現れます。培養1日目の終わりまでに、軸索と樹状突起を区別できるようになります。最終的に、この手順に従うことで、ニューロンは6週間以上生存し、広範な伸展を示します。ドパミン作動性ニューロンにおけるメカニズム的な疑問を解決するために、ウイルス導入、免疫蛍光染色、または電気生理学などの他の手法を実施することが可能です。

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