マウス骨髄単球の追跡インビボ

この手順の全体的な目標は、2光子イメージングを使用して、生きているマウスの頭蓋骨骨髄における単球の輸送を視覚化することです。まず、マウスに麻酔をかけ、腐敗剤であるルミンデキストラン溶液を注射して血管系を標識します。次に、マウスをカスタムメタルサポートに置き、頭頂骨の裏側から前頭骨までの頭皮を切除します。

次に、ゴム製のリングを外科用接着剤で頭蓋骨に直接取り付け、リザーバーに液体生理食塩水で満たします。最後に、多光子顕微鏡を使用して、頭蓋骨骨髄内の蛍光細胞の経時的な発達を追跡します。このMeは、定常状態または化学療法後の単球動員のメカニズムなど、免疫血液学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

したがって、この方法は、モジュラー単球の挙動に関する洞察を提供することができます。また、使用するインフルエンザセントレポーターの特異性に応じて、他の骨髄細胞サブセットの研究にも適用できます。次のプロトコルでは、チタンサファイア結晶レーザーと組み合わせた多光子顕微鏡と、レーザー出力制御用のオペ変調器を利用しています。

3つの蛍光チャンネルの同時記録を可能にするには、565ナノメートルと690ナノメートルのダイクロイックミラー、565、610ナノメートル、および500個の550ナノメートルバンドパスフィルター、および485ショートパスフィルターを組み合わせた3つの外部非DSスキャン検出器またはndsを含む構成にする必要があります。この設定では、第 2 高調波発生 (SHG) とシアン蛍光タンパク質 (CFP) は、485 ショートパスフィルターの後の NDD によって検出されることに注意してください。CFP は NDD によっても検出されます。

500 550バンドパスフィルターとロッドドミンデキストランがNDDによって検出された後。565 610バンドパスフィルターの後、イメージングの数時間前に加熱チャンバーを摂氏32度に設定しました。この温度により、実験中、マウスは最適な体温に保たれます。

ここで使用されている加熱チャンバーは暗く、システムの対物レンズと電動プレートを覆っていることに注意してください。これにより、外部光の汚染を防ぐことができます。最初にシステムをオンにするには、チタンサファイアレーザーのスイッチを入れてから、顕微鏡システムの残りの部分のスイッチを入れます。

取得ソフトウェアを起動します。ここでは、Zeiss Zenソフトウェアを使用します。レーザーの波長範囲を870ナノメートルに設定します。

次に、録音に適したNDDを選択します。今回用いたマウスは、CSFの1つの受容体プロモーターの制御下でシアン蛍光タンパク質を発現するMac blueというトランスジェニックマウスです。推奨される麻酔方法は、イメージングの長さによって異なりますので、詳細については添付のドキュメントを参照することをお勧めします。

この手順の難しい側面は、静脈を見逃しやすいため、T静脈注射です。このような場合は、代わりに眼窩後注射を行ってください。マウスに麻酔をかけたら、ニッパーを使用してフットパッドを刺激して意識がないかどうかを確認します。次に。

血管系を染色するには、200マイクロリットルのロッドドミンデキストランを尾静脈に注入するか、好中球を染色します。.LY 6 GPEを含む生理食塩水を100マイクロリットル注入します。注射後、マウスの頭を、顕微鏡と麻酔ガス吸入器に適合したカスタムメイドの定位ホルダーの保持プレートの間に置きます。

これにより、呼吸の動きがイメージングに影響を与えないようにします。保持プレートを締めて、耳と頭の間の皮膚を伸ばします。安定性を確認してください。

ニッパーでヘッドをそっと押すと、ヘッドが動かなくなるはずです。次に、動物が正常に呼吸していることを確認します。マウスを2光子イメージング用に準備するには、目を避けながら指で頭皮の毛髪に70%エタノールを塗布します。

次に、頭皮を露出させるために切り欠きのあるドレープを置きます。次に、滅菌ハサミとニッパーを使用して皮膚をカットし、頭頂骨の後ろから前頭骨まで頭皮を完全に取り除きます。目や耳から3ミリメートルの距離を保ち、広範囲の出血を防ぎます。

頭蓋骨を覆っている緩い結合組織または骨膜を取り除きます。次に、温かいPBSに浸したペーパータオルを使用して、ここに示すように残りの髪を洗い流します。小さなゲージの針を使用して、直径10mmのゴムリングの全周に外科用接着剤を塗布します。

次に、別のPBSに浸したペーパータオルでゴムリングを頭蓋骨に直接置きます。最後にもう一度リングの内側を掃除します。温かいPBSを追加して、頭蓋骨を完全に浸します。

次に、定位ホルダーを対物レンズの下に置きます。マウスを所定の位置に置いたら、直接透過型の顕微鏡接眼レンズを使用して頭蓋骨を観察し、顕微鏡の視野に大まかに配置します。イメージングソフトウェアウィンドウの左上にある「Live acquisition」をクリックします。

組織のライブスキャンは、ソフトウェアの顕微鏡方向制御を使用してウィンドウの中央に表示されます。CFPとロッドドミン信号のある領域を見つけて、ピントを調整します。次に、レーザー出力を最小に設定して、写真の損傷を最小限に抑えながら最高の信号対雑音比を取得します。

次に、ソフトウェアで「channel」タブをクリックし、各NDDのPMTのゲインパワーを上げて、写真の漂白と写真の損傷を減らし、次に適切なタブをクリックして、取得設定を1.58マイクロ秒のピクセル滞留時間、1.5倍率で512 x 512ピクセルのシングルスキャンに設定します。記録パラメータを設定したら、ライブ取得コマンドをクリックし、組織を調査して、リアルタイムで監視する目的のx、y、Zフィールドを選択します。ここでは、血管領域と実質領域の両方を含むフィールドが選択されます。

次に、[位置] タブに表示されているフィールドの X、Y、Z 座標を保存または登録します。[追加] をクリックします。このプロセスを最大 3 つの追加フィールドで繰り返して、関心のあるすべての座標を登録します。

座標は、ソフトウェアに指示する横の[位置]タブに表示されます。3つのDZスタックの画像をキャプチャするには、ソフトウェアの[位置]タブで[移動]をクリックして最初に登録した位置に移動し、ソフトウェアの左上のボックスで[Zack]を選択します。これにより、[Zスタック]タブが開き、最も高いZ位置に移動し、それに応じてレーザー出力が調整されます。

最後に設定をクリックしてから、最も深い位置に移動します。レーザー出力を調整します。次に、最初に[セット]をクリックします。

スタック解析の厚さは、迅速に研究する細胞に適合させる必要があります。移動するセルはすぐにフランス語から出てしまうので、より厚いスタックを取得する必要があります。次に、動きの遅い細胞を取り込みます。

左上のボックスで、time series コマンドを選択して [time series] タブを開きます。サイクル数と時間間隔を設定します。ここでは、30秒ごとに1つのボリュームを60サイクル取得します。

これは、リアルタイムで 30 分に相当します。メインウィンドウでタイムラプスイメージングを開始するには、手順全体で実験を開始するを選択し、動物が意識を失っていることを確認するために引き続き監視します。また、対物レンズが適切に浸されていることも確認してください。

シーケンスがキャプチャされたら、ピペットを使用して温かいPBSを追加します。その後、2回目の30分間の取得を開始します。取得中に信号が徐々に消失する場合は、PBSの漏れがないか確認してください。

必要なビデオがすべて録画されたら、添付文献に記載されているようにデータ解析を行い、イントラバイタルイメージングによる骨髄生理学の研究を行った後、Mac Blueトランスジェニックマウスに200万ダルトンロッドドミンデキストランを注入し、2光子レーザー走査型顕微鏡でイメージングしました。このビデオで示したように、得られた顕微鏡写真では、200万ダルトンロッドドミンデキストランで染色された血管系が赤骨で示され、青で示されている血管系が第2高調波発生によって可視化されています。シアンで示されるECFP陽性単球は、血管系と骨の間の暗い領域として見られる実質ニッチ内、および血管内に位置しています。

個々の細胞の軌跡を計算するために、タイムラプスイメージングを行いました。このビデオは、実質単球の遊走行動を示しています。ECFP信号はシアン色で、各赤スポットの回遊経路は緑色で表示されます。

ここでは、血管単球の遊走挙動が見られます。これらのデータを使用して、セルの平均速度と平均二乗変位の両方を計算できます。血管単球は、実質単球と比較して、変位の増加と速度の増加の両方を示すことに注意してください。

このビデオを見た後、2つの写真イメージングを使用してマウスの骨髄単球をin vivoで追跡する方法をよく理解しているはずです。この技術は、免疫学の分野の研究者が、造血の非常に重要な部位である骨髄での細胞移動と相互作用だけでなく、抗原プライミングや免疫学的記憶などの他の基本的な機能も探求する道を開きました。