Name: マウス骨髄単球の追跡インビボ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 学ぶマウス頭蓋骨髄における単球動態の可視化法。二光子顕微鏡を用いて生体内で単球の動員メカニズムをリアルタイムに追跡し、免疫血液学の理解を深める。

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著者は編集の援助のためにアンダロンとピエールルイLoyherに感謝したい、2光子顕微鏡と支援を飼育したマウスのための動物施設「NAC」とカミーユBaudessonの支援についてPlateforme ImageriePitié-Salpêtrière（PICPS）。これらの結果につながる研究グラント契約の下で欧州共同体の第7次フレームワークプログラム（FP7 / 2007から2013）から資金提供を受け、N 304810を°いる - RAIDの、そしてnは241440-Endostem、INSERMから、大学ピエール·マリー·キュリーから &quot;出現を° 「ラから「協会ラルシェルシュシュルルがんを注ぐ」とから「通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ」プログラムの創発2012（ANR-EMMA-050）」から、「リーグコントル·ルがん。 PHはラ &quot;リーグコントル·ル癌」によってサポートされていました。

注：すべての実験プロトコルは、フランスの動物実験や倫理委員会によって承認され、番号A-75から2065に「サービスの保護らサンテAnimales、エンバ」によって検証された。サンプルサイズは、実験の再現性を確実にするために選択され、動物の倫理規定の3Rに応じている。 マウスの作製<ol><li>麻酔<ol><li>イメージングの短時間（1時間未満）のために、ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kgの）を含有する生理食塩水200μlを腹腔内注射してマウスを麻酔し。 </li><li>あるいは、（4時間まで）イメージングの長期間適合マスクを介して、O 2 / N 2 Oの70/30混合物で気化イソフルラン2.5％の吸入で、マウスを麻酔し。 </li><li>注：この方法は、より安定した無意識のために提供し、薬のシリアル腹腔内注射を避けることができます。 </lI&gt; <li>マウスを麻酔したら、ニッパーで足パッドの刺激を通じて無意識をチェック。 </li></ol></li><li>血管染色/追加の染色<ol><li>血管の染色：尾静脈に静脈内にローダミン - デキストランを200μl（2 MDA、生理食塩水緩衝液中10mg / ml）を注入する。 </li><li>好中球の染色のために：尾静脈に静脈内に生理食塩水100μl中Ly6G-PE（クローン1A8）2μgのを注入する。 </li></ol></li><li>固定化<ol><li>固定化のために、顕微鏡に及び麻酔ガス吸入器に適合したカスタムメイドの定位ホルダーを使用しています。 注：sterotacticホルダーは、動物の頭を締め、2金属板ブラケット、固定されている1と他のリムーバブルと適応性を持つ金属支持体である。 </li><li>呼吸動きからの分離を確実にするために、保持プレート間のマウスの頭部をインストールします。 SKをストレッチする保持プレートとヘッドと耳を締めインチ安定性と動物の呼吸福祉のために確認してください。 </li></ol></li><li>頭皮を削除<ol><li>慎重に眼との接触を避け、無菌のアプリケーターで頭皮の髪を濡らし、エタノール70％使用しています。 </li><li>完全に前頭骨に頭頂骨の後方から頭皮を削除するには、滅菌ハサミやニッパーで皮膚をカットします。大規模な出血を防ぐために、目と耳から3ミリメートルまで遠ざけること。頭蓋骨（骨膜）をカバー疎性結合組織を削除します。暖かいPBSに浸したペーパータオルで残りの髪を洗ってください。 </li></ol></li><li>液浸システムのセットアップ<ol><li>分布を制御するための小さなゲージの針を用いて頭蓋骨に直接外科的接着剤で直径18mmのゴムリングを貼り付けます。 （30μlのに十分であるべきである）の漏洩を防止するために、ゴムリングの全周を接着。 </li><li> PBSに浸したペーパータオルでリング下に最後にもう一度頭蓋骨をきれいにし、その後の完全な浸漬し、37℃のPBSを追加頭蓋骨。眼の乾燥を避けるために、マウスのそれぞれの眼にNaClの0.9％溶液または特定の眼軟膏のドロップを追加します。目的の下に定位ホルダーをドラッグします。 </li><li>約ダイレクトトランスミッションを介し顕微鏡接眼レンズを使用してフィールドを配置します。 </li></ol></li></ol> 2.二光子イメージングの取得<ol><li>選択的に680から1080ナノメートルまで調節可能で、NIR光の140fsパルスを提供するサファイア結晶レーザ、レーザパワー制御のための音響光学変調器：チタンと結合し、多光子顕微鏡を使用する。 2ダイクロイックミラー（565 nmおよび690 nm）で、610分の565と550分の500バンドパスフィルタの組み合わせ（3蛍光チャネルの同時録画を可能にする）3外部の非デスキャン検出器（NDD）を含む構成を使用して、プランアポクロマート485ショートパスフィルターは、水浸対物レンズ（NA = 1）×20。 </li><li> anaesの良いhomeothermyを可能にするために加熱室を設定thetizedマウス。、 注：温度が、より安定性のためにセッションを画像化する1時間前に設定されることがあります。我々のケースでは、32°Cで麻酔したマウス（36~37℃）の最適な体温を得るために選択され、4時間後まで維持される。この温度は、使用されるシステム（デジタルプローブは、この点を確認するために使用することができる）に適合させることができる。また、使用される加熱チャンバは、黒/暗い、外光の混入を避けるために、システム（目的および電動プレート）の一部を覆う。 </li><li>システムの電源を入れます<ol><li>サファイアレーザー、その後全体の顕微鏡システム：TIの電源をオンにします。取得ソフトウェアを起動します。 870 nmのレーザー波長範囲を設定する。記録のために適切なNDDを選択します。 注：この例では、第二高調波発生（SHG）19と、シアン蛍光タンパク質（ECFP）は485ショートパスフィルタの後NDDによって検出される。 550分の500バンドパスフィルタ及びローダミン - デキストランをtで検出された後ECFPもNDDによって検出される彼NDD 610分の565バンドパスフィルタの後。 </li></ol></li><li>取得の設定を調整<ol><li>ソフトウェアの「ライブ取得」イメージングコマンドを使用し、顕微鏡、方向コントロールを使用して、ECFP及びローダミン信号の領域にフォーカスを調整します。最小限の光損傷を有する最良の信号対雑音比を得るために、最小限にレーザパワーを設定する。 注：使用される電力設定は、関心領域の深さに応じて変化する。典型的には、AOMの設定は、15ミリワットの周りの目的を超えてレーザパワーを表して約20％に設定される。各NDDは、光退色および光損傷を低減することがPMTのゲインに電力を増加させる方がよい。典型的な取得の設定は、単一の1.58マイクロ秒のピクセル滞留時間でスキャンし、1.5倍率512×512ピクセルの解像度である。 </li></ol></li><li>関心領域を選択します<ol><li>記録パラメータが設定されると、再び「ライブ」の取得コマンドを使用リアルタイムで監視すべき所望の（x、y、z）の欄を選択するための組織を調査する。 注：通常、我々は両方の血管および実質領域を含むフィールドを選択しました。 </li><li> 「位置」ソフトウェアコマンドを使用してフィールドを登録します。 注：このコマンドは異なる遠いフィールドのx、y、z座標を記憶する。 </li><li>同じ手順を使用して、（3まで）興味のある追加のフィールドを選択し、登録します。 </li><li>選択した倍率で、必要量に応じて第一記憶した位置にある「zスタック」ソフトウェアコマンドを使用して、3次元zスタックを設定します。最初の深い位置し、次に最も高い位置を記憶します。深さのレーザパワーを正規化する。 注：複数の付随フィールドイメージングのために、我々は12μmの厚さのボリュームを取得するフィールドごとに3μmのZ-段階で区切られた5スライスを獲得する。これらの設定は、研究細胞の種類に適合させることがあります。 </li></ol></li><li>起動買収<ol><li>選択する220と、時系列「ソフトウェアコマンドと時間間隔の持続時間とサイクル数を選択します。 「実験を開始する「ソフトウェアコマンドを選択することで、必要な時間の経過と期間に応じてタイムラプスイメージングを開始します。 注：私たちのケースでは、30分のリアルタイムを表す60サイクルの間に各30秒1のボリュームを取得する。短い時間の経過は、血管内の速い細胞ローリングを追跡するために行うことができる。この場合、薄いzスタックと2以下の異なるフィールドを同時に記録することができる。 </li><li>セットアップの定期的なモニタリング。 <ol><li>常にそれが無意識であることを確認するために動物を監視します。 注：動物のウィスカーまたは脚の振動復活の指標である。動物の呼吸がぎくしゃくしている場合には、イソフルランの量をわずかに減少させることができる。取得中の強力な組織ドリフトは、マウスの復活の指標である。 </li><li>目的が適切に浸漬していることを確認します。 37℃のPBS betweeリニュー2件の買収（30分）をn個。 注：買収時の信号のプログレッシブ消失は、PBS漏れの指標である。 </li></ol></li></ol></li><li>手続きの終了<ol><li>必要な動画が記録されると、急速に蘇生する前に頚椎脱臼により動物を安楽死させる。 NOTE：創傷治癒は、長手方向の撮像を実行するための可能性を制限24〜48時間でかさぶたの形成をもたらす。 </li></ol></li></ol> 3.データ分析<ol><li>ドリフト補正<ol><li> 3D自動追尾のためのIMARISビットプレーンソフトウェアを使用してください。 </li><li> IMARIS上の3D画像シーケンスを開きます。 SELECTコマンドを「スポット」、そして均一分野で配布可能な場合は、4種類のアンカーポイントの最低すべての時点のマニュアルトラッキング（マウスクリック+シフト）を生成します。 </li><li> 「編集トラック」タブで「正しいドリフト」コマンドを使用して、ドリフト補正を適用します。 </li><li>トンの確認彼のx補正、yおよびzは、特に内の品質は人為的な揺れを回避する。 注：補正が十分でない場合は、他のアンカーポイントを試してみてくださいまたは分析からのビデオを除外する。 </li></ol></li><li>細胞追跡<ol><li>コマンド &quot;新しいスポットを追加」と「トラックスポットの経時&quot;アルゴリズム設定を選択してください。次のステップに進みます。 </li><li> 「ソースチャンネル」コマンドを使用して、関心の全チャネルのいずれかの自動細胞トラッキング手順を適用します。 10μmとしたオブジェクト（すなわち、細胞）の直径。次のステップに進みます。 注：選択は、オブジェクトと測定された信号の特異性の区別に依存します。要するに、全チャネル上の自動追尾が検出された信号が対象物に特異的である場合にのみ可能である。 SHG及びECFPの両方が485ショートパスフィルタの後NDDによって検出されるため、トラッキングは5後NDDによって記録ECFP信号を使用して、より特異的かつ効率的になる00/550バンドパスフィルタ。クラスタ化または高密度のパックされたオブジェクトは、3.1.2のステップに類似した個々のオブジェクトを手動で選択が必要になります。 </li><li> 「品質」フィルタの種類を選択して、非特異的オブジェクトの追跡を除外するようにしきい値を設定。次のステップに進みます。 </li><li> 2スポット間の「最大距離」と「ギャップサイズ」の正確なパラメータを指定して「ブラウンアルゴリズムモーション」を選択してください。トラックの発生を検証します。 </li><li>トラックが自動的に計算されると、「トラック継続時間」フィルタの種類を選択し、（4時間点を表す）を120秒より短いトラックを排除するためにしきい値を設定。 </li><li> 必須：自動追尾した後、トラックの品質をチェック。 <ol><li>オブジェクトは、トラックパスに従うことを確認するためにタイムバーをアンロール。 「編集」タブで利用可能なトラックポイント補正のオプションを使用しない場合は、次の「削除」コマンド（任意のトラックpを削除して虚偽または不適切なトラックを削除個別に「切断」コマンド）を使用してOINT。トラックパスが不足している時点（マウスクリック+シフト）を追加し、不連続である場合には、所定のトラック上のすべての点を選択し、「編集トラック」タブでコマンドを「接続」を使用します。 </li></ol></li></ol></li><li>定量パラメータ<ol><li> 「環境設定」コマンドで「統計」タブを選択し、リスト内の関心の動的パラメータを選択します。選択してコマンドおよび生成されたExcelファイルを保存」ファイルにすべての統計情報をエクスポート」。 注：いくつかの動的なパラメータを直接、トラックの長さ、瞬間速度、平均速度などのソフトウェアから得られ、真直度を追跡している。運動係数6、20を決定することができるが、ソフトウエアにより直接提供されない。 </li><li>各セルについて、時間（ΔT）の各期間の変位の平均値を算出（30秒タイムラプス映画のために、ΔTは30、60、90秒、などとなります）。時間間隔の関数としての平均二乗変位をプロットする。曲線の直線部分の傾きを計算することによって、運動性係数を得る。 </li></ol></li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

インビボイメージング方法の重要な点は、画像の持続時間を最大にし、炎症細胞の動態に影響を与える可能性のある細菌汚染および炎症の危険性を最小限にするために、焦点の安定性を確保するためである。骨髄へのアクセスを得るために行わ手術が最小であるように、頭蓋骨骨​​髄のイメージングは​​、これらの目的に従う。滅菌材料および防腐剤の使用は、細胞恒常性摂動を誘発する可能性があり、感染の危険性を制限することが不可欠である。 定位ホルダーの開発は挑戦することが、各システム（顕微鏡の対物と電動ステージとの距離、麻酔用ガス吸入器の使用）のための具体的なカスタマイズを必要とするかもしれません。より広い撮像面へのアクセスのためにできるだけ水平にマウスの頭を取得することが重要である。動物が配置されると、それは数分requirすると予測される焦点面の良好な安定性を得るために、編。したがって、獲得記録を起動する前に、組織のドリフトをチェックすることをお勧めします。関心の領域の選択と一緒に、このプロセスはしばらく続くことができるので、それはまた、定期的にケタミン/キシラジンが使用され...

骨髄は造血において中心的な役割を果たし、血液と髄質の間を恒常的に循環し、短い寿命で循環する単球のプールを更新し、定常状態の組織マクロファージと樹状細胞4の再構成に関与する単球の主要な貯蔵庫を表しています。.炎症中または一過性無形成後、単球は骨髄または脾臓5、6、7のいずれかから活発に動員され、炎症を起こした臓器にコロニーを形成します。いくつかの走化性軸は、骨髄からの骨髄細胞動員のプロセスに関与しています8、5、6、9。骨髄コンパートメントを超えて、骨髄はTリンパ球のプライミング10の重要な部位であり、免疫学的記憶のニッチ11,12でもあります。したがって、この組織は、血液学および免疫学の分野における数多くの研究の中心です。髄様骨髄系細胞の構造組織に関する我々の知識は、主に固定組織の組織切片の解析から生じている13。この静的なビューでは、骨髄の機能的活性の基礎である骨髄の異なるコンパートメント間の細胞交換ダイナミクスの研究はできません。
生体内イメージングは、以前はin vitroシステムからのみ記載されていた細胞移動性、細胞接着、細胞間相互作用の研究において重要な生物学的インプットを構成しています。適切な生体内イメージングの技術的課題には、光学的観点から関心のある組織に到達する能力、生理学的(呼吸、筋肉、蠕動収縮)または機械的ドリフト(手術後の組織の破壊と伸展、顕微鏡の対物レンズへの曝露、温度、血管/酸素化の摂動)から組織を最大限に分離する能力が含まれます。微視的なドリフトは、焦点を長時間保持する能力を制限する可能性があり、細胞の運動性の定量化にアーティファクトをもたらす可能性があります。これらの技術的な困難を軽減するためにいくつかの組織で検証された1つの選択肢は、温常化および酸素化培地でインキュベートされた外植組織に取り組むことです。ただし、リンパ循環と血管循環の完全な混乱が問題になる可能性があります。頭蓋骨骨髄の生体内イメージングには、これらの問題に関していくつかの利点があります。まず、最小限の外科的作用が必要です。第二に、この領域の骨の厚さは、摩耗することなく骨髄ニッチを直接視覚化することを可能にするため、生理学的摂動が減少します。髄質ネットワークは、骨の傍矢状領域で画像化できます。ただし、正弦波は、骨基質が薄い前頭頂部でより目立ちます12,14。
Intravitalイメージングは、関心のある集団をタグ付けする最も正確な蛍光レポーターの利用可能性に依存しています。養子移し前の精製細胞集団のin vitro標識は、造血幹細胞ニッチ15または腫瘍生着16に有利な骨髄内皮マイクロドメインの重要な特性評価につながり、免疫学17の主要な概念に関するいくつかの基本的なインプットを提供しました。しかし、このアプローチでは通常、後でin vivoで細胞を検出する機会を得るためには、数十万個の細胞が必要です。これは、染色後の死亡率が高いこと、全身で希釈されること、活性化状態が変化することで説明でき、ホーミングが偏っている可能性があります。トランスジェニックマウスシステムからの内因性標識は、これらの制限を大幅に克服し、内因性骨芽細胞8、巨核球18、または骨髄系譜サブセット6の挙動を画像化することを可能にした。それにもかかわらず、研究されたサブセットの中での蛍光レポーターの特異性を考慮する際には注意が必要です。 
Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFPは、MacBlueマウス1と呼ばれ、リアルタイムイメージング6で髄質単球を研究するための貴重なトランスジェニックシステムです。高分子量ローダミン-デキストランの静脈内注射は、髄質を骨髄の血管正弦波ネットワークと区別します。このアプローチを使用すると、関心のある特定の生理病理学的状況で、さまざまな髄質コンパートメントでの単球の挙動を追跡することができます。さらに、特定の抗体を使用したin vivo標識を通じて単球のダイナミクスを好中球のダイナミクスと比較する追加の戦略を提案します。

<table><tbody><tr><td>ケタミン</td><td>メリアル</td><td></td><td>100 mg/ml、麻酔薬</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>バイエル ヘルスケア</td><td></td><td>10 mg/ml、麻酔薬</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td></td><td>2.5%、麻酔薬</td></tr><tr><td>O2/NO2</td><td></td><td></td><td>70/30 混合物、麻酔薬</td></tr><tr><td>Rhodamin-Dextran</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>2 MDa、10 mg/ml、血管染色</td></tr><tr><td>Ly6G-PE</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td></td><td>クローン 1A8、好中球</td></tr>染色 <tr><td>定位ホルダー</td><td>ホームメイド</td><td></td><td>手術</td></tr><tr><td>エタノール70%</td><td></td><td></td><td>手術</td></tr><tr><td>滅菌ハサミ・ニッパー</td><td></td><td></td><td>手術</td></tr><tr><td>ゴムリング</td><td></td><td></td><td>直径18mm、手術</td></tr><tr><td>グルブラン2</td>クエリ<td>ー医療</td><td></td><td>外科用接着剤、ゴムリング固定</td></tr><tr><td>スモールゲージ針</td><td>テルモ</td><td></td><td>手術</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 NLO多光子顕微鏡&nbsp;</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>Ti:サファイアクリスタルレーザー&nbsp;</td><td>Coherent Chameleon Ultra</td><td></td><td>140 fsec pulses of NIR light</td></tr><tr><td>Zen 2010</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Acquistion Software</td></tr><tr><td>Imaris Bitplane&nbsp;</td><td>ビットプレーン</td><td></td><td>解析ソフトウェア、3D自動追跡</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>D.ダッチャー</td><td></td><td>手術</td></tr><tr><td>サーモステーテッドチャンバー</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>生体内イメージング</td></tr></tbody></table>

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

リアルタイムの多光子イメージングは、生理学的3次元環境での細胞輸送と細胞間相互作用を研究する絶好の機会を提供します。免疫細胞の生物学的活動は、主にその運動能力に依存しています。血液単球は血流中の半減期が短いです。それらは骨髄に由来し、骨髄から構成的に放出されます。炎症状態では、このプロセスが促進され、血液モノサイトーシスとそれに続く末梢炎症組織の浸潤につながります。骨髄から血管網への単球輸送を制御する生体力学的事象を特定することは、単球の生理病理学的関連性を理解するための重要なステップです。Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP(MacBlue)マウスの頭蓋骨骨髄の2光子顕微鏡によるin vivoタイムラプスイメージングを行った。MacBlueマウスは、骨髄特異的プロモーター1の制御下で、血管ネットワーク標識と組み合わせて、蛍光レポーター増強シアン蛍光タンパク質(ECFP)を発現します。このアプローチにより、個々の髄質単球をリアルタイムで追跡し、骨髄実質と血管系内の移動行動、および細胞間相互作用をさらに定量化する方法について説明します。このアプローチは、骨髄単球サブセットの生物学に関する新たな洞察を提供し、これらの細胞が特定の病理学的状態においてどのように影響を受けるかをさらに解明することを可能にします。

マウスの頭蓋骨構造は、生体内イメージングによって骨髄生理学を勉強する良い機会を提供しています。フロント頭頂領域の周りに薄くなる骨は、それが骨の摩耗なし髄ニッチへのアクセスを得ることが可能である。1 MacBlueトランスジェニックマウスの頭蓋骨の広い2Dフィールドを表す図 。骨基質は、主にSHG 19によってIは容易に検出可能なコラーゲンで構成されている。ローダミン-デキストランの注射は、骨髄の血管網を染色し、骨基質と血管14との間に実質骨髄ニッチの同定を可能にする。 ECFP細胞は骨髄の二つの区画に分布するが、骨基質には存在しない。単球は、手動で、組織内でのそれらの位置に応じて分類される。全細胞が容器のサイズを無視し、脈管構造内にあるとき、血管の単球が定義されている。唯一の大きな収集細静脈は、当社のAから除外されているnalysis。細胞が血管系および骨基質との間に配置されたときに実質球が定義されている。 興味のある特定の領域のタイムラプスイメージング（補足ビデオ1、2...

単球は自然免疫の主要な調節因子であり、末梢の単核食作用系の更新や炎症の場合に重要な役割を果たします。この原稿では、単球の動員メカニズムを研究するためのマウスのカルバリア骨髄のリアルタイムイメージングの手順について説明します。

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

この手順の全体的な目的は、2光子イメージングを用いて、生存マウスの頭蓋骨骨髄における単球のトラフィッキングを可視化することです。まず、マウスを麻酔し、血管を標識するためにロドミンデキストラン溶液を注入します。次に、マウスを専用の金属製サポートに固定し、頭頂骨の後方から前頭骨にかけての頭皮を除去します。次に、ラバーリングを外科用接着剤で頭蓋骨に直接固定し、リザーバーに生理食塩水を充填します。最後に、多光子顕微鏡を用いて、頭蓋骨骨髄内における蛍光細胞の発達を経時的に追跡します。この手法は、定常状態または化学療法後の単球動員メカニズムなど、免疫血液学分野における重要な疑問の解明に役立ちます。したがって、本手法を用いることで、モジュラーモノサイトの挙動に関する知見を得ることができます。また、使用する蛍光レポーターの特異性に応じて、他の骨髄細胞サブセットの研究にも適用可能です。以下のプロトコルでは、チタンサファイア結晶レーザーとレーザー出力制御用のOPモジュレーターを備えた多光子顕微鏡を使用します。3つの蛍光チャンネルを同時に記録できるようにするには、3つの外部非DSスキャン検出器（NDD）と、565 nmおよび690 nmのダイクロイックミラー、565 nm、610 nm、および500-550 nmのバンドパスフィルター、そして485 nmのショートパスフィルターを組み合わせた構成にする必要があります。このセットアップでは、第二高調波発生（SHG）およびシアン蛍光タンパク質（CFP）は、485 nmショートパスフィルターを通過した後にNDDで検出されることに注意してください。また、CFPはNDDによっても検出されます。500 550 nmのバンドパスフィルターの後、Rod Domine DextranがNDDによって検出されます。565 610 nmのバンドパスフィルターを使用する場合、イメージングの数時間前に加熱チャンバーを32 °Cに設定してください。この温度により、実験の間、マウスを最適な体温に維持することができます。ここで使用している加熱チャンバーは遮光されており、システムの対物レンズと電動ステージを覆っていることに注意してください。これにより、外部光による汚染を防ぐことができます。システムの起動は、まずチタンサファイアレーザーのスイッチを入れ、次に顕微鏡システムの残りの電源を入れてください。取得ソフトウェアを起動します。ここではZeiss Zenソフトウェアを使用します。レーザー波長範囲を870 nanometersに設定します。次に、記録に適したNDDを選択します。本実験で使用するマウスはMac blueと呼ばれるトランスジェニックマウスであり、CSF1受容体プロモーターの制御下でシアン蛍光タンパク質を発現します。推奨される麻酔方法はイメージングの時間によって異なるため、詳細は付属資料を確認してください。本手順で困難な点はT静脈への注入であり、静脈を外しやすい傾向があります。もし失敗した場合は、代わりに後眼窩静脈叢注入を行ってください。マウスの麻酔後、ニッパーで足底を刺激し、意識がないことを確認します。次へ。血管を染色するには、200 µLのrhodamine dextranを尾静脈に注入します。好中球を染色する場合は、LY6G PEを含む生理食塩水100 µLを注入します。注入後、マウスの頭部を、顕微鏡および麻酔ガス吸入器に適応させた特製の手製立体定位固定ホルダーの保持プレートの間に固定します。これにより、呼吸による動きがイメージングに影響しないようになります。保持プレートを締め、耳と頭の間の皮膚を伸ばします。安定しているか確認してください。ニッパーで頭部を軽く押さえ、頭部が動かないように固定します。次に、動物の呼吸が正常であることを確認してください。2光子イメージングの準備として、指を用いて頭皮の毛に70% ethanolを塗布します。この際、目に触れないよう注意してください。次に、頭皮を露出させるための切り抜きがあるドレープを掛けます。続いて、滅菌済みのハサミとニッパーを用いて皮膚を切開し、頭頂骨の後方から前頭骨まで頭皮を完全に除去します。大量出血を防ぐため、目と耳からは3 mmの距離を維持してください。頭蓋骨を覆っている緩い結合組織または骨膜を除去します。次に、ここで示すように、温めたPBSを浸したペーパータオルを用いて、残った毛を洗い流します。細いゲージの針を使用し、直径10 millimeterのゴムリングの外周全体にサージカルグルーを塗布します。次に、PBSを浸した別のペーパータオルを用いて、ラバーリングを頭蓋骨の上に直接配置します。リングの内側を最後にもう一度洗浄します。温めたPBSを加え、頭蓋骨が完全に浸るようにします。次に、ステレオタキシスホルダーを対物レンズの下に配置します。マウスを固定したら、直接透過型の顕微鏡接眼レンズを使用して頭蓋骨を確認し、顕微鏡の視野内におおよそ配置します。イメージングソフトウェアウィンドウの左上にあるライブアクイジションをクリックします。ソフトウェアの顕微鏡方向制御を使用して、ウィンドウの中央に組織のライブスキャンが表示されます。CFPと桿体優位のシグナルがある領域を探し、フォーカスを調整します。次に、光損傷を最小限に抑えつつ最高のSN比を得るために、レーザーパワーを最小に設定します。次にソフトウェアで、チャンネルタブをクリックし、各NDDのPMTゲインを上げて光退色と光損傷を低減させます。その後、適切なタブをクリックし、取得設定をシングルスキャンに、画素滞在時間を1.58 microsecondsに、解像度を512 by 512 pixels、倍率を1.5倍に設定します。記録パラメータの設定が完了したら、ライブアクイジションコマンドをクリックし、組織を走査して、リアルタイムでモニターしたい任意のx, y, Z領域を選択します。ここでは、血管領域と実質領域の両方を含む領域を選択しています。次に、Positions（ポジション）タブに表示されている視野のX、Y、Z座標を保存または登録します。「Add（追加）」をクリックしてください。この手順を最大3つの追加視野で繰り返し、目的のすべての座標を登録します。座標は、ソフトウェアの指示を行う「positions」タブに表示されます。3枚のDZスタック画像をキャプチャするには、ソフトウェアの「positions」タブにある「move to」をクリックして、最初に登録されたポジションに移動し、ソフトウェアの左上のボックスで「Zack」を選択します。これにより「Z stack」タブが開き、最高Zポジションに移動して、レーザー出力が適切に調整されます。「set last」をクリックし、最も深い位置まで移動させます。レーザー出力を調整してください。その後、「set first」をクリックします。スタック解析の厚さは、観察する細胞の速度に合わせて調整してください。移動速度の速い細胞はすぐに視野外に出てしまうため、より厚いスタックを取得する必要があります。一方、移動速度の遅い細胞の場合は、薄いスタックで取得します。左上のボックスでタイムシリーズコマンドを選択し、タイムシリーズタブを開きます。サイクル数と時間間隔を設定します。ここでは、30秒ごとに1ボリュームを60サイクル取得するように設定します。これは実時間で30分に相当します。メインウィンドウでタイムラプス撮像を開始するには、「start experiment」を選択してください。手順の間、動物が意識喪失状態にあることを確認するため、観察を続けてください。また、対物レンズが適切に浸漬されていることを確認してください。シーケンスのキャプチャ後、ピペットを用いて温めたPBSを添加します。その後、2回目の30分間のアクイジションを開始します。アクイジション中にシグナルの漸次的な消失が見られた場合は、PBSの漏れがないか確認してください。必要なビデオの録画がすべて完了したら、生体イメージングによる骨髄生理学を研究するために、付属文書に記載されているデータ解析を行います。Mac blue トランスジェニックマウスに 2 million Dalton rod domine dextran を注入し、2光子レーザー走査顕微鏡でイメージングを行いました。このビデオで示されているように、得られた顕微鏡写真では、2 million Dalton rod domine dextran で染色された血管系が赤色で、第二高調波発生（SHG）によって可視化された骨が青色で表示されています。シアン色で示されている ECFP 陽性単球は、血管と骨の間の暗い領域として見える実質ニッチ内、および血管内に位置しています。個々の細胞の軌跡を算出するため、タイムラプスイメージングを実施した。このビデオでは、実質単球の遊走挙動を示している。ECFP信号はシアンで表示され、各赤色スポットの遊走経路が緑色で表示される。ここでは、血管単球の遊走挙動を確認できます。これらのデータを用いて、細胞の平均速度と平均二乗変位の両方を算出することが可能です。血管単球は、実質単球と比較して、変位と速度の両方が増加していることに注意してください。このビデオを視聴することで、2つのフォトイメージングを用いて、マウスの骨髄単球をin vivoで追跡する方法について深く理解できるはずです。この技術は、造血の極めて重要な部位であるだけでなく、抗原プライミングや免疫記憶などの他の基本的機能も担う骨髄における細胞の遊走と相互作用を探索するための道を、免疫学分野の研究者に切り拓きました。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、白血病などの血液疾患の患者のために、マウスの後肢から新鮮な全骨髄を分離するための詳細なプロトコルについて説明しています。...

マウス後肢からの骨髄採取

このプロトコルは、マウスを犠牲にすることなく大腿骨骨髄(BM)の連続サンプリングの手順を説明しています。この手順により、マウスのBM組成の経時的な縦断的研究が容易になり、ex...

生きたマウスにおける大腿骨髄吸引

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。...

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）および骨髄ニッチの間の相互作用の性質は、ほとんど理解されている。カスタムハードウェアの修正および多段階取得プロトコルは、ex vivo画像骨髄エリア内ホーミング標識HSPCs、追跡相互作用及び運動に二光子共焦点顕微鏡の使用を可能にする。...

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

私たちは、麻酔をかけたマウスの生体内共焦点顕微鏡を使用して、定常状態および炎症条件下で腸間膜静脈の好中球と単球の挙動を監視するためのプロトコルを詳述しています。...

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

このプロトコルは、生体内で大腿骨骨髄内の細胞の動きを追跡するために使用できる新しいマウス大腿骨窓室モデルについて説明しています。生体内多光子蛍光顕微鏡は、大腿骨骨髄の3つの成分(血管系、コラーゲンマトリックス、好中球)を経時的にイメージングするために使用されます。...

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル<em&gt;インビボ</emマウス骨髄内&gt;細胞トラッキング

今回ナイーブ cd4 陽性 T 細胞 (T 細胞) の活性化、増殖、GM-CSF 骨髄 (BM) による th1 細胞分化・生体内で定量のためのプロトコル-由来樹状細胞 (Dc)。さらに、このプロトコルでは、BM と T 細胞の分離、DC 世代と DC および T...

メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

ここでは、好中球系統細胞の高次元質量細胞法(Time-Of-Flight、CyTOFによるサイトメトリー)分析のために、マウスまたはヒトから単離された新鮮な骨髄(BM)を処理するプロトコルを提示する。...

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

ここでは、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、その 場で 巨核球の超構造を解析するプロトコルを紹介する。マウス骨マロウは、収集され、固定され、エポキシ樹脂に埋め込まれ、超薄切片で切断される。コントラスト染色後、骨髄は120kVのTEM顕微鏡下で観察される。...

イン・シトゥ 透過電子顕微鏡を用いたネズミ巨核生物の探索

このプロトコルは、マウス異種移植モデルにおける遺伝子編集細胞を含むいくつかの造血幹細胞または白血病幹細胞の大腿骨内注射を説明しています。これにより、細胞の迅速かつ安全な移植だけでなく、骨髄の連続分析も可能になります。...

生きたマウスを使用した簡略化された大腿内注射により、継続的な骨髄分析が可能

このプロトコルは、7-9日齢の新生児マウス骨髄細胞を単離し、L929細胞の上清を顆粒球コロニー刺激因子(M-CSF)の供給源として使用して分化したマクロファージを生成するための非酵素的で簡単な方法を説明しています。骨髄由来マクロファージは、表面抗原F4/80、CD206、CD11b、および機能的コンピテンシーについてさらに分析されました。...

新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製

学ぶマウス頭蓋骨髄における単球動態の可視化法。二光子顕微鏡を用いて生体内で単球の動員メカニズムをリアルタイムに追跡し、免疫血液学の理解を深める。

マウス骨髄単球の追跡

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