Name: マウス臓器に印加される高精度の亜鉛同位体測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 学ぶマウス臓器の高精度亜鉛同位体測定法。イオン交換クロマトグラフィーと質量分析を用いて、亜鉛の分布と輸送メカニズムを解明し、神経変性疾患の診断に貢献する技術です。

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FMは、PNPグラント、研究所Universitaire·ド·フランスなどソルボンヌパリシテ（ANR-10-LABX-0023とANRでLabex UniverEarthプログラムを通じてchaireドール優秀IDEXソルボンヌパリシテ、INSUを通じてANRからの資金調達を認めます-11-IDEX-0005から02）。また、欧州共同体のH2020フレームワークプログラム/ ERC助成契約＃637503（プリスティン）の下で欧州研究評議会からの資金に感謝します。

注：動物を含む手順は、大学のパリディドロにおける施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。 材料の作製<ol><li>サブ沸騰不純物からそれらを精製するために酸（HNO 3、HBrを）の1 Lを蒸留します。 </li><li>きれいに熱い（〜100℃）でビーカーと先端アダプタは、少なくとも2日間HNO 3酸浴を濃縮しました。 </li><li>数日間の冷3 N HNO 3浴中でピペットチップを洗浄し、脱イオン水で個別に3回すすいでください。 </li></ol> 2.サンプル調製<ol><li>ケタミンとキシラジンの腹腔内注射によりマウスを麻酔。つま先のピンチ方式により麻酔を評価します。 </li><li> 1.5ミリリットルチューブ内のヘパリンの存在下での心臓穿刺により血液を収集します。 </li><li>遠心分離（10分、1,500×gで）により血液細胞から血漿を分離し、ポリプロピレンcにプラズマを転送しますポリプロピレンのヒントを使用してryogenicバイアル。 </li><li>肝静脈を切断し、心臓にDPBSを注入することにより器官から残りの血液を除去。頚椎脱臼によりマウスの死を評価します。 </li><li>滅菌ステンレス鋼の機器との臓器を収穫、もしあれば脂肪周囲のそれらを解放し、スナップ凍結してポリプロピレンの低温バイアル中。 </li></ol> 3.化学精製<ol><li>まず、濃（30％）〜1ミリリットルH 2 O 2、濃縮（15〜M）HNO 3の約1 mlと混合物中にサンプルを溶解します。ヒュームフード内のすべての手順を実行してください。 <ol><li> 15ミリリットルのテフロンビーカーに関心のある器官全体を配置します。その後、ビーカー5にH 2 O 2 / HNO 3を追加。有機物の酸化反応およびCO 2の放出に起因する飛沫を避けるために、数分間開放ビーカーにしてください。 </li><li>最後に、ABOのホットプレート上でビーカーを置きます時間のカップルのための、または溶液が完全に透明になるまで100℃でユタ。 </li></ol></li><li>ビーカーを開き、約100℃のホットプレート上に溶液を乾燥。 </li><li>サンプルが乾燥すると、サンプルに1.5 NのHBrの1ミリリットルを追加します。ビーカーを閉じて、それが時間のカップルのため、100℃のホットプレート上で溶解させます。 </li><li>一方、500μlのカラムを準備します。 <ol><li>列にAG1X8 200〜400メッシュの樹脂の500μlを添加して、その下のゴミ箱のビーカーでカラムラックの上に置きました。 5ミリリットル18.2のMΩ⋅センチ水、0.5 N 5mlのHNO 3、5mlの水、0.5 N 5mlのHNO 3、および水の後、5ミリリットルを：交互に樹脂を洗浄。 1.5 NのHBr 5mlで樹脂を調整。 </li></ol></li><li>ホットプレートからビーカーを取り出して、約30分間超音波浴に入れ、その後、ビーカーを室温まで冷却させます。 </li><li>ビーカーを冷却し、樹脂を洗浄した後、ビーカーを開きます。 tに先端アダプタを入れて彼は、注射器、ピペットチップを追加します。サンプルの1ミリリットルをピペット（樹脂を攪拌させないために、非常にゆっくりと）樹脂上にロードします。 </li><li>すべての液体がカラムを通過した後、1.5 NのHBrの5ミリリットルを追加します。 </li><li> 1.5 NのHBr 5mlをカラムを通過すると、きれいな15ミリリットルビーカーでゴミのビーカーを交換してください。 </li><li>一度に0.5 NのHNO 3 2.5ミリリットルの5ミリリットルを追加します。この段階で、Znが樹脂から溶出されます。 </li><li> HNO 3 5mlをカラムを通過したら、ビーカーを除去し、乾燥するまで、100℃のホットプレート上に置きます。 </li><li>カラムホルダーから列を削除します。樹脂をゴミ箱（各サンプルのための新しい樹脂を使用します）。 </li><li>サンプルが乾燥したら、小さい列に酸（100μl）を同容量のプロトコルを繰り返した後、乾燥するまで、ホットプレートの上に置きます。サンプルは、質量分析のための準備ができました。 </li></ol> 4.質量分析測定<ol><li>亜鉛同位体コンポを分析マルチコレクタ - 誘導結合プラズマ質量分析計（MC-ICP-MS）にジション。 <ol><li> 表1にまとめた機械パラメータを使用してください。 </li></ol></li><li> 62のNi、63銅、64亜鉛、銅65、66のZn、67 Znおよび68 Znを質量（M / Z）で収集するために、ファラデーカップを置きます。 </li><li>同位体分析のために、0.1M HNO 3で500 ppbでのZnを含む溶液を調製します。 </li><li> 100μL/分テフロンネブライザーと組み合わせたスプレーチャンバを使用して、亜鉛の500 ppbの液を分析。各サンプルについて、各スキャンの積分時間は8.389秒である30のスキャン（30サイクルの1ブロック）を測定します。 </li><li>ブランク溶液（サンプルを再溶解するために使用される、0.1M HNO 3溶液）からのピークゼロ強度を差し引くことにより、バックグラウンドを修正してください。 </li><li> 62 Niのピークの強度を測定することによって制御し、正しい可能性64 Niの同重体干渉。64のNi / 62 Ni比が（0.2548）自然で、楽器のマスバイアスから、この値を修正し、などのマス64の64のNiを削除することを想定します。 64 Znの実 = 64 Znを測定 - 64のNi = 64のZnを測定 - （64のNi / 62 Ni）の自然のx 62 Niを測定しました 。 </li><li> JMCリヨンのZn標準の500 ppbの標準溶液（またはIRMM-3702のような別の利用可能な標準）での各サンプルをブラケットにより楽器マスバイアスを修正してください。 （ 式1を参照）は、2つの標準サンプルマイナス1前後で測定し、千を乗じの66のZn / 64のZn比の平均による試料の66のZn / 64 Znの比を割ることにより、標準のブラケットを実行します。 JMCリヨンのZn標準の一般的な外部精度は0.05パーミル/ AMU（2標準偏差、2 SD）です。 </li></ol>

<ol><li>Marechal, C. N., Telouk, P., Albarede, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+analysis+of+copper+and+zinc+isotopic+compositions+by+plasma-source+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Geology%22%5BJournal%5D)">Precise analysis of copper and zinc isotopic compositions by plasma-source mass spectrometry.</a> Chemical Geology. 156 (1), 251-273 (1999).</li>
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<li>Balter, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+Cu%2C+Fe%2C+and+Zn+isotopic+patterns+in+organs+and+body+fluids+of+mice+and+sheep%2C+with+emphasis+on+cellular+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Contrasting Cu, Fe, and Zn isotopic patterns in organs and body fluids of mice and sheep, with emphasis on cellular fractionation.</a> Metallomics. 5 (11), 1470-1482 (2010).</li>
<li>Urgast, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+isotope+ratio+imaging+of+rat+brain+thin+sections+from+stable+isotope+tracer+by+LA-MC-ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Zinc isotope ratio imaging of rat brain thin sections from stable isotope tracer by LA-MC-ICP-MS.</a> Metallomics. 4, 1057-1063 (2012).</li>
<li>Marin-Carbonne, J., Rollion-Bard, C., Luais, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+measurements+of+iron+isotopes+by+SIMS%3A+MC-ICP-MS+intercalibration+and+application+to+a+magnetite+crystal+from+the+Gunflint+chert%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Geol%22%5BJournal%5D)">In-situ measurements of iron isotopes by SIMS: MC-ICP-MS intercalibration and application to a magnetite crystal from the Gunflint chert.</a> Chem. Geol. 285 (1-4), 50-61 (2011).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

測定の再現性は、異なる分析セッション中に行うと同じサンプルの複製された分析によって評価されます。例6のために、私たちは同じ地上岩を7回繰り返しており、我々は表2に報告された結果を得ました。 （15〜17 例えば、隕石11-13、植物3-5、深海堆積物14、動物）、これまで任意の太陽系材料で測定同位体分別10の理論からとして期待されるように、結果は質量に従ってください依存法（ 図1参照）。 68 Znおよび64 Znの間の質量の差が66 Znおよび64 Znの間の差が2倍 ​​であるため、δ68 Znが、約二倍66のZn（ 図1）δです。これは、我々の測定は、そのデータを追い出すことになる（同重体干渉の自...

高精度（より良い100ppm以下/原子質量単位）の測定は、亜鉛安定同位体組成は約15年間、マルチコレクタプラズマソース質量分析計の開発のおかげで可能になった、それ以来、主に地球に適用されています惑星科学。医療分野への応用は、新規であり、亜鉛（ 例えば、アルツハイマー病）の代謝を変更する疾患のバイオマーカーとしての大きな可能性を持っています。本稿では、種々のマウス臓器で高精度に亜鉛の自然な安定同位体比を測定する方法を報告します。同じことが、ヒトサンプルに適用可能です。この方法は、臓器、原子の残りの部分からの亜鉛の化学的精製、その後、質量分析計での同位体比の分析の溶解で構成されています。 亜鉛同位体測定の質は、化学的精製（亜鉛の純度、低ブランクCOMPの品質に依存していますサンプル中のZnの存在量、手順の高い化学収率）にし、楽器のバイアスの制御にared。最終的な亜鉛画分の純度は、マトリックス効果を作成両方同重体干渉と非同重体干渉を除去するために必要とされます。同重体核種が直接干渉（ 例えば、64のNi）を作成します。非同重体干渉は、いわゆる「マトリックス」効果を生成し、サンプルが1と比較される純亜鉛の標準に比べてイオン化の条件を変更することにより、測定値の分析精度を変化させます。低ブランク（&lt;10 ngの）そのバイアス測定同位体組成を、外付けのZnによる試料のコンタミネーションがないことを示しています。亜鉛同位体は、イオン交換クロマトグラフィーの間に2分画できるように、すべてのZn原子の集合は、化学的手順は、完全な収率を有していなければならないことを意味する、いかなる同位体分別が起こらないことを保証します。最後に、質量分析測定中の楽器の同位体分別の補正は、「標準ブラケット &quot;メソッドを介して行われます。 そのため、正確な測定値を得るための主な困難は、他の原子または分子のクリーンで完全降伏化学的精製を製造、および質量分析計で楽器同位体分別の補正、外部汚染（ すなわち、低ブランク）を制御しています。本稿では、マウスの臓器と同様に質量分析の測定値からのZnを分離するために私たちの分析プロトコルを記述します。 抽出は、陰イオン交換樹脂のマイクロカラム（0.5μLおよび0.1μL）で希釈した酸（HBrを/ HNO 3メディア）の少量を使用して行われます。これは、完全な収率を有しており、測定値が66のZn / 64のZn比で50ppmのよりも優れた外部再現性を持っています。メタの別の利点ODが、それは非常に高速であるということです。この方法は、極めてよくつこれらの分析法が開発された地球科学に比べて多数のサンプルを分析する必要のある、医学に適合されます。

<table><tbody><tr><td>マルチコレクション誘導結合プラズマ質量分析計</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>陰イオン交換樹脂 AG1 X8 200-400</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1443-MSDS</td><td></td></tr><tr><td>テフロンビーカー</td><td>Savillex&nbsp;</td><td>200-015-12</td><td></td></tr><tr><td>縮縮性テフロン</td><td></td><td></td><td></td>を使用した自社製テフロンコラム</tr></tbody></table>

マウス臓器に印加される高精度の亜鉛同位体測定

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

我々は、マウスの臓器における高精度の亜鉛同位体比で測定するための手順を提示します。亜鉛は、マウスの臓器の間に自然に分画される5安定同位体（64 Znを、66のZn、67のZn、68 Znおよび70 Zn系）で構成されています。まず、Zn原子を解放するために、異なる臓器を溶解する方法を示しています。このステップは、HNO 3とH 2 O 2の混合物によって実現されます。それから、希のHBr / HNO 3媒体に陰イオン交換クロマトグラフィーによる同重体干渉（ 例えば 、Ni）の、より具体的には、他のすべての要素からの亜鉛原子を精製します。これらの最初の2つのステップは、高純度化学薬品を使用して、きれいな実験室で行われています。最後に、同位体比は、低解像度のマルチコレクタ誘導結合プラズマ質量分析計を用いて測定されます。サンプルはcorrecあるスプレーチャンバーと質量分析計により誘導される同位体分別を用いて注入されています標準（標準ブラケット技術）の比にサンプルの比率を比較することにより、テッド。この完全な典型的な手順は、50 ppmの（2 SD）再現性の同位体比を生成します。

1.5 NのHBrでは、主亜鉛種（ZnBr3-）陰イオン交換樹脂でフォーム非常に強い複合体は、他のほとんどの要素は、樹脂と相互作用しないながら。亜鉛は、その後、樹脂6,7から放出される2+ Znに亜鉛の分化を変化させる、希釈HNO 3に培地を変更することによって回収されます。 同位体比は、典型的には、標準に比べて千の偏差当たりの部として表現さ​​れています。 <img alt="式（1）" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52479/52479eq1.jpg" /> X = 66または68で使用される標準物質は、Zn「リヨン」標準JMC 3から0749 L 1です。 「リヨン」標準は、Zn同位体のデータを正規化するために最も広く使用される基準材料で...

マウスの臓器内の亜鉛同位体比を高精度で測定する技術を紹介します。

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

この手順の全体的な目的は、マウスの臓器における亜鉛同位体比を高精度に測定することです。まず、異なる臓器を酸で溶解してすべての原子を溶液中に遊離させ、続いて誤差の補正を行い、乾燥させた試料を臭化水素酸で再懸濁します。その後、コンディショニング済みの重力カラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、試料中の他のすべての元素から亜鉛を精製します。最後に、硝酸を用いて樹脂から亜鉛を溶出させます。最終ステップは、マルチコレクター誘導結合プラズマ質量分析計を用いて亜鉛同位体比を測定することです。最終的に、この同位体組成は、異なる器官における亜鉛同位体の平衡分布を測定することにより、体内の亜鉛バランスを変化させる疾患の診断に利用されます。したがって、本手法は、マウスの器官間における亜鉛の自然分布および輸送メカニズムに関する知見を提供するために開発されました。本手法はいかなる動物にも適用可能であり、最終的にはアルツハイマー病など、臓器間の亜鉛バランスを変化させる疾患の診断に利用できます。本手順を開始するにあたり、テキストプロトコルに従って材料とサンプルの準備を行い、ドラフトチャンバー内で化学精製作業を実施し、30%過酸化水素約1 mLと濃硝酸約1 mLの混合液を作成します。目的の臓器全体を15 mLのテフロン製ビーカーに入れます。次に、混合物をビーカーに加えます。有機物の酸化反応と二酸化炭素の放出による飛散を防ぐため、ビーカーの蓋は開けたまま数分間保持します。最後に、ビーカーをホットプレートに乗せ、約100°Cで数時間、あるいは溶液が完全に透明になるまで加熱します。次に、ビーカーの蓋を開け、ホットプレートを用いて約100 °Cで溶液を乾燥させます。サンプルが乾燥したら、サンプルに1 mLの臭化水素酸を加えます。ビーカーを密閉し、ホットプレートを用いて100 °Cで数時間溶解させます。その間に、500 µLカラムを準備します。500 µLのAg one x 8 200 400 mesh樹脂をカラムに加え、下に廃液ビーカーを置いたカラムラックにセットします。18.2 MΩ·cmの純水5 mLと0.5 N硝酸5 mLを交互に2回加えて樹脂を洗浄し、最後に5 mLの純水で洗浄します。最後に、5 mLの臭化水素で樹脂をコンディショニングします。次に、ビーカーをホットプレートから取り出し、超音波洗浄機に入れます。約30分間、ビーカーが室温になるまで冷却してください。ビーカーが冷却され、樹脂の洗浄が完了したら、ビーカーを開けます。シリンジにチップアダプターを取り付け、ピペットチップを装着します。次に、サンプルの1 mLをピペットで吸い取り、樹脂を乱さないよう非常にゆっくりと樹脂にロードします。すべての液体がカラムを通過した後、5 mLの臭化水素酸を加えます。臭化水素をカラムに通した後、廃棄ビーカーを清潔な15 milliliterビーカーに交換します。次に、硝酸を5 milliliter、2.5 millilitersずつ加えます。この段階で、亜鉛が樹脂から溶出します。硝酸がカラムを通過したら、ビーカーを取り出し、乾燥するまで100 °Cのホットプレートの上に置きます。カラムホルダーからカラムを取り外し、樹脂を廃棄します。サンプルが乾燥したら、同量の酸を用いて、より小さい100 µLのカラムでプロトコルを繰り返し、その後、乾燥するまでホットプレートの上に置きます。これで試料の質量分析準備が整いました。マルチコレクター誘導結合プラズマ質量分析計を用いて、亜鉛の同位体組成を分析します。テキストプロトコルにまとめられたパラメータに従って装置を設定してください。Faradayカップを配置し、$^{62}\text{Ni}$、$^{63}\text{Cu}$、$^{64}\text{Zn}$、$^{65}\text{Cu}$、$^{66}\text{Zn}$、$^{67}\text{Zn}$、および$^{68}\text{Zn}$の質量電荷比を収集します。次に、100 µL/minのテフロン製ネブライザーとスプレーチャンバーを用いて、0.1 M硝酸中の500 ppb亜鉛溶液を分析します。各試料について、1スキャンあたりの積分時間が8.389秒となる条件で30回のスキャンを測定します。ブランク溶液コントロールのオンピーク・ゼロ強度を差し引くことでバックグラウンドを補正し、ニッケル64のアイソバー干渉の可能性を補正します。ニッケル62ピークの強度を測定し、ニッケル64とニッケル62の比率が天然比であると仮定します。この値を装置の質量バイアスで補正し、テキストプロトコルに記載されている通り、質量64におけるニッケル64を除去します。各サンプルをJMC Leon亜鉛標準液の500 ppb標準溶液でブラケッティングすることにより、装置の質量バイアスを補正します。以下に、$\Delta^{68}\text{Zn}$ 対 $\Delta^{66}\text{Zn}$ の3同位体プロットとして、本手法で得られた代表的な結果を示します。異なる臓器において、すべての臓器は傾き2の直線上に位置しています。これは、同位体分別の質量依存性を示しており、マウスの各臓器が同位体的に区別可能であることを示しています。興味深いことに、赤血球と骨は、血清、脳、肝臓と比較してdelta Zinc 66が濃縮されています。この分画は、異なる臓器における亜鉛の異なる結合環境間での同位体の平衡分布によって十分に説明されます。ビデオを視聴することで、マウス臓器の高精度な亜鉛同位体測定の方法について十分に理解できるはずです。最大の困難は、サンプルへの外部亜鉛の混入を避けることであるため、清潔な研究室で作業し、高純度の化学試薬を使用することが不可欠であることに留意してください。

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JoVE Journal

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化学

卵巣がんの転移は、多数のびまん性腹腔内病変を特徴としており、腫瘍負荷の正確な視覚的定量化は困難です。 ここでは、赤色蛍光タンパク質(RFP)標識腫瘍細胞と光学イメージングを使用して、転移性腫瘍量のin situおよびex...

腹腔内卵巣癌転移の定量

ここでは、プレターゲティングと生体直交化学のための三座99mTc(I)キレート-テトラジン誘導体の放射性標識とin vivo試験のためのプロトコルについて説明します。...

の調製と評価<sup&gt; 99メートル</sup&gt; Tc標識三座キレートバイオ直交化学反応を用いて事前ターゲティングするため

このプロトコルでは、体組成計と体組成とマウスの代謝パラメーターを特徴づける代謝動物監視システムの使用について説明します。高脂肪食摂取による肥満モデルは、これらの技術の適用のための例として使用されます。...

身体組成と高脂肪給電マウスにおける代謝ケージ分析

培養一次または確立された細胞株は、動物モデルを使用する前に初期のアプローチとして、基本的な生物学的および機械的な質問に対処するために一般的に使用される。このプロトコルは、亜鉛 (Zn)...

哺乳類細胞内の細胞内亜鉛プールを測定するための原子吸光度分光法

このプロトコルの目的は、感染後にマウスの複数の器官からジカウイルスを分離および定量化することによってウイルス性疾患を調査するために使用される技術を実証することです。...

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

フローサイトメトリーを必要としない固定/凍結保存組織サンプル内で、肝細胞数および核プロイドの変化を測定するための堅牢で費用対効果の高い柔軟な方法を提示します。私たちのアプローチは、肝臓の損傷や病気の進行を追跡するのに理想的な肝臓細胞学の強力なサンプル全体の署名を提供します。...

マウスにおける肝細胞核プロイドの推定に対するSitu法におけるハイスループット

二重樹脂鋳造マイクロコンピュータ断層撮影(ダクト)は、2つの管状システムの視覚化、デジタル化、セグメンテーションを同時に可能にし、臓器アーキテクチャの3D解析を容易にします。ダクトは、2つの放射不透明樹脂の 元生体 注入とそれに続くマイクロコンピュータ断層撮影スキャンと断層撮影データのセグメンテーションを組み合わせたものです。...

ダクト:3D肝臓解析のためのマイクロコンピュータ断層撮影に続く二重樹脂鋳造

この記事では、マウス妊娠中の鉄輸送の研究のために、トランスフェリン結合非放射性同位体鉄を調製および投与する方法を示します。胎児胎盤区画中の同位体鉄を定量するためのアプローチも記載されている。...

非放射性鉄同位体を用いたマウス胎盤 を 横切る鉄輸送の定量

この論文では、ヒト特異的抗CD19モノクローナル抗体の放射性標識法と、 in vivo PETイメージング、 ex vivo...

陽電子放射断層撮影法を用いた実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスモデルにおけるCD19+ B細胞のイメージング

この論文では、新しい放射性標識プローブ(...

68Ga標識ナノ分子の放射合成、品質管理、および小動物陽電子放出断層撮影イメージング

学ぶマウス臓器の高精度亜鉛同位体測定法。イオン交換クロマトグラフィーと質量分析を用いて、亜鉛の分布と輸送メカニズムを解明し、神経変性疾患の診断に貢献する技術です。

マウス臓器に印加される高精度の亜鉛同位体測定

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