フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

この手順の全体的な目的は、組織 resident 細胞が、炎症時における白血球のリクルートを支持する血管内皮細胞の能力にどのような影響を与えるかを調べることです。これは、まずマイクロスライドモデルとフィルターモデルという2つのin vitro血管モデルのいずれかを用いて、内皮細胞と間葉系幹細胞の共培養系を構築することで達成されます。その後、フローアッセイの前に、これらの培養系にサイトカイン処理を行います。

次に、使用するモデルシステムに応じて変更を加えながら、フローベースの接着システムを段階的に組み立てます。最終ステップとして、白血球を血管内皮細胞上へ灌流させ、血流からのリクルートメントおよびその後の挙動を観察します。最終的に、これらの多細胞フローベース接着アッセイにより、間葉系幹細胞と血管内皮細胞のクロストークが炎症時の好中球リクルートメントを抑制することが示されました。

本手法は、白血球トラフィッキング分野における重要な疑問、例えば、間葉系幹細胞などの組織常在細胞がこのプロセスをどのように修飾するのか、また、慢性炎症や癌などの疾患においてこの変化は起こるのか、といった問いに答えるのに役立ちます。さらに、これらの知見を新たな治療戦略の開発に活用できる可能性があります。まず、テキストプロトコルに従ってマイクロスライドモデルまたはフィルターモデルを用い、血管内皮細胞と間葉系幹細胞の共培養系を構築し、フローシステムを組み立てます。

まず、ヒーターの電源を入れ、37 °Cに設定します。次に、プランジャーを外した20 mLシリンジと5 mLシリンジを3方活栓に取り付けます。続いて、バルブから3方活栓までの距離に相当する長さの2.4 mmチューブを測定し、切断します。

1.3 mmのチューブを8～10 mmの長さに切り、太いチューブの一端に挿入します。太いチューブ側を3方コックに取り付け、細いチューブの端を電子3方マイクロバルブのポートに接続して、洗浄リザーバーを作成します。

次に、マイクロポアテープを使用してタップをパースペックスチャンバーに取り付けます。続いて、長さ6〜8 mmの太いチューブと細いチューブを用意し、細いチューブを太いチューブの一端に挿入します。プランジャーを外した2 mLシリンジに、太いチューブの端を取り付けます。

次に、2 mLシリンジの細いチューブ端を電子マイクロバルブのポートに接続し、サンプルリザーバーを作成します。続いて、マイクロバルブから顕微鏡ステージの中心までの距離に合わせて、長い細いチューブを測定し、切断します。マイクロスライドモデルの場合は、細いチューブの端に8〜10 mmの太いチューブを装着してください。

次に、太いチューブの端にL字型コネクタを取り付けます。これはマイクロスライドまたはフィルターモデルに接続されます。細いチューブの端に、8〜10 mmのPortexブルーラインマノメーター接続チューブを取り付けます。

次に、細いチューブの端をマイクロバルブに取り付けます。このチューブが、洗浄液およびサンプルリザーバーの共通出力口となります。リザーバーに、ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水を満たします。

PBSAを流して気泡を取り除き、チューブ内をプライミングした後、マノメーターチューブを50 milliliterのガラスシリンジに接続します。マイクロスライドモデルの場合は、ガラスシリンジにつながるマノメーターチューブの末端に、10 to 12 millimeterの厚いチューブを接続するだけにしてください。厚いチューブの末端にL字型コネクタを取り付けます。

10 millilitersのPBSAを満たして、シリンジをプライミングします。チューブに接続されている側が上を向くようにシリンジを反転させ、すべての気泡を押し出した後、5 millilitersのPBSAを再度満たします。最後に、注入および抽出のため、ガラスシリンジをシリンジポンプにセットします。

フロー用のマイクロスライドを準備するため、ガラスシリンジのリフィル速度と直径を設定します。マイクロスライドを倒立位相差顕微鏡のステージに設置します。3方コックを回し、PBSAが入口チューブを流れるようにします。

L字型コネクタをマイクロスライドチャネルの入口ポートに接続します。次に、シリンジポンプからのL字型コネクタをチャネルの出口ポートに取り付けます。マイクロスライド上に滴下したPBSAを拭き取ります。

あるいは、フィルターモデルの場合、まず金属テンプレートを用いてパラフィルムをガラスカバースリップと同じサイズに切り出します。次に、金属テンプレートを使用してパラフィルムに20×4 mmのスロットを切り抜き、流路を作成します。このパラフィルム製ガスケットを用いて、ガラスカバースリップ上に流路の位置をマークします。

6ウェルフィルターの端をガラスカバーのスリップに合わせます。フィルターがフローチャネルのマーキングを覆っていることを確認してください。タイプ10のメスを使用して、フィルターを注意深く切り出します。

次に、流路スロットがフィルターの中央に来るように注意しながら、パラフォームガスケットでフィルターを慎重に覆います。清潔なティッシュを用いて、気泡を押し出してください。その後、Perspexフローチャンバーの底板の凹みにカバーガラスを配置します。

上部のパースペックスプレートをガスケットの上に配置し、プレート同士をネジで固定します。3方コックを回して、PBSA洗浄バッファーがバルブを通過して流れるようにします。その後、マノメーターのチューブを上部パースペックスプレートのインレットポートに接続します。

気泡を取り除くため、PBSAをフローチャネルに流します。次に、シリンジポンプからのマノメーターチューブをパーデックスプレートの出口ポートに接続します。チャンバーの上部プレートに滴下したPBSAを拭き取ります。

最後に、チャンバーを倒立位相差顕微鏡のステージ上に置き、フィルター上の内皮細胞を可視化して内皮細胞上に白血球を灌流できるよう焦点を調整します。ピペットポンプをリフィルに設定し、焦点調整が完了したら実行ボタンを押します。内皮細胞単層を可視化するために、2 mLの精製好中球をサンプルリザーバーに入れ、2分間温めます。

次に、内皮細胞をPBSAで2分間洗浄します。バルブを開き、内皮細胞の上に好中球を灌流させます。好中球のボーラス投与を4分間行います。

バルブを閉じ、実験の残りの時間、洗浄リザーバーからPBSAを灌流させます。実験を行う際は、アッセイのいかなる時点においても気泡が通過しないように注意してください。気泡が通過すると、血管内皮細胞の単層が乱れ、接着した好中球が剥離してしまいます。好中球の流動中、または灌流後に、デジタル画像キャプチャソフトウェアを用いて好中球の動員を記録します。

インレットポートにあるチャネルの端に対物レンズを移動させ、ポートの中央を確認して、チャネルの中心を特定します。好中球のフロー中の記録として、フローチャネルの中心にある少なくとも5〜10個の視野をすべてデジタル記録してください。1つの視野で10秒ごとに1分間画像を撮影し、チャネルに沿って移動して別の視野を1分間記録します。

灌流後の記録を行うため、ボーラス投与の全期間にわたってこのプロセスを繰り返します。白血球の挙動を評価するため、フローチャネルの中心に沿って5〜10箇所の視野で10秒間の記録を行います。この10秒の間、1秒ごとに画像を撮影してください。

これにより、フローによる捕捉および接着好中球の挙動を分析するための十分な時間を確保できます。少なくとも10個の経細胞移動した好中球が含まれる単一の視野を、30秒間隔で5分間記録します。移動した細胞の速度を算出するために、別の10秒間の視野シリーズをさらに記録してください。

これにより、好中球が内皮単層を透過して遊走するための時間を確保します。最後に、シリンジポンプを停止し、流出チューブを取り除き、次に流入チューブを取り除きます。フローチャンバーを分解し、サンプルリザーバーをPBSAで洗浄します。後続のフィルターおよびマイクロスライドチャネルについても同様の操作を繰り返し、その後、テキストプロトコルに記載されている白血球のリクルートメントおよび挙動の解析へと進みます。マイクロスライドモデルにおいて、腫瘍壊死因子αによるサイトカイン刺激は、用量依存的に内皮への好中球接着を有意に増加させました。

さらに、内皮表面をローリングする好中球の割合において、TNF αの投与量に依存した減少が観察されました。これは、内皮単層を通過して経内皮遊走を行う好中球の割合において、投与量に依存した増加として反映されていました。フィルターベースのフローアッセイにおいても、同様の結果が観察されました。

例えば、TNF alpha刺激により、好中球の接着が用量依存的に増加しました。内皮細胞と骨髄由来間葉系幹細胞の共培養では、内皮細胞単独の場合と比較して、好中球の接着が有意に減少しました。また、マイクロスライドモデルで予想される通り、単独で培養しました。

同様に、フィルターベースのモデルを用いた場合でも同様の効果が観察され、単一培養と比較して共培養では接着が少ないことが確認されました。このビデオを視聴することで、炎症時に白血球の動員に影響を与えるために、ストローマ細胞が内皮細胞とどのようにコミュニケーションをとっているかを調べる方法について、十分に理解できたはずです。