Name: フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 学ぼう、炎症時の白血球補充における間質細胞の役割をin vitroモデルで解明する方法。内皮細胞と間葉系幹細胞の共培養系を用いて、好中球の接着と遊走動態を解析し、血管生物学の新たな治療戦略開発に貢献する知見を得る。

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臍帯は、バーミンガム女性医療NHSトラストの支援を受けて収集されました。HMMは、Arthritis Research UK Career Development Fellowship(19899)およびバーミンガム大学のSystems Science for Health(5212)の支援を受けました。

<ol><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+on+endothelium+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration.</a> Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+stroma+as+a+regulator+of+leukocyte+recruitment+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation.</a> Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).</li>
<li>Serhan, C. N., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation%3A+the+beginning+programs+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation: the beginning programs the end.</a> Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).</li>
<li>Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+leukocyte+recruitment+and+its+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies.</a> Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).</li>
<li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Ability+of+Exogenous+Chemotactic+Agents+to+Disrupt+Transendothelial+Migration+of+Flowing+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).</li>
<li>Smith, C. W., Rothlein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+an+endothelial+determinant+for+CD+18-dependent+human+neutrophil+adherence+and+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration.</a> The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).</li>
<li>Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-leukocyte+adhesion+molecule-1-dependent+and+leukocyte+%28CD11%2FCD18%29-dependent+mechanisms+contribute+to+polymorphonuclear+leukocyte+adhesion+to+cytokine-activated+human+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium.</a> J. Immunol. 142 (7), (1989).</li>
<li>Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Each+step+during+transendothelial+migration+of+flowing+neutrophils+is+regulated+by+the+stimulatory+concentration+of+tumour+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+adhesion+and+communication%22%5BJournal%5D)">Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha.</a> Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).</li>
<li>Piali, L., Weber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+receptor+CXCR3+mediates+rapid+and+shear-resistant+adhesion-induction+of+effector+T+lymphocytes+by+the+chemokines+IP10+and+Mig%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig.</a> European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).</li>
<li>McGettrick, H. M., Smith, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+from+different+sites+may+promote+or+inhibit+recruitment+of+flowing+lymphocytes+by+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells.</a> European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).</li>
<li>McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+kinetics+of+migrating+T+cells+suggest+active+retention+by+endothelial+cells+with+continual+bidirectional+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration.</a> Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).</li>
<li>McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+differentially+regulate+neutrophil+and+lymphocyte+recruitment+through+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium.</a> Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).</li>
<li>Tull, S. P., Yates, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+Fatty+acids+and+inflammation%3A+novel+interactions+reveal+a+new+step+in+neutrophil+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment.</a> PLoS biology. 7 (8), e1000177(2009).</li>
<li>Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+D2+regulates+CD4%2B+memory+T+cell+trafficking+across+blood+vascular+endothelium+and+primes+these+cells+for+clearance+across+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium.</a> Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).</li>
<li>Bradfield, P. F., Amft, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+fibroblast-like+synoviocytes+overexpress+the+chemokine+stromal+cell-derived+factor+1+%28CXCL12%29%2C+which+supports+distinct+patterns+and+rates+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cell+migration+within+synovial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue.</a> Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).</li>
<li>Filer, A., Parsonage, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+survival+of+leukocyte+subsets+mediated+by+synovial%2C+bone+marrow%2C+and+skin+fibroblasts%3A+site-specific+versus+activation-dependent+survival+of+T+cells+and+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils.</a> Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).</li>
<li>Lally, F., Smith, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+neutrophil+recruitment+in+a+coculture+model+of+the+rheumatoid+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium.</a> Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).</li>
<li>Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro.+model+for+analysing+neutrophil+migration+into+and+away+from+the+sub-endothelial+space%3A+Roles+of+flow+and+CD31%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31.</a> Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).</li>
<li>Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Pathology+of+Atherosclerosis+Smooth+Muscle+Cells+Prime+Cocultured+Endothelial+Cells+for+Enhanced+Leukocyte+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion.</a> Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).</li>
<li>Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+regulate+neutrophil+recruitment+by+glomerular+endothelial+cells+via+IL-6-mediated+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk.</a> Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).</li>
<li>Parsonage, G., Filer, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+address+code+defined+by+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">A stromal address code defined by fibroblasts.</a> Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).</li>
<li>Luu, N. T., McGettrick, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+mesenchymal+stem+cells+and+endothelial+cells+leads+to+downregulation+of+cytokine-induced+leukocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment.</a> Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).</li>
<li>Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-leukocyte+adhesion+molecules+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease.</a> Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).</li>
<li>Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endothelial+cell+surface+factor%28s%29+induced+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro.</a> 136 (12), 4548-4553 (1986).</li>
<li>Burton, V. J., Butler, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+of+migrating+leukocytes+by+the+basement+membrane+deposited+by+endothelial+cells+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture.</a> Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).</li>
<li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD31+Regulates+Direction+and+Rate+of+Neutrophil+Migration+over+and+under+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells.</a> Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).</li>
<li>McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+stromal+cells+on+lymphocyte+adhesion+and+migration+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells.</a> Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).</li>
<li>Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+and+dynamic+assays+of+cell+adhesion+relevant+to+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature.</a> Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).</li>
<li>Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+effects+of+stromal+cells+on+the+migration+of+lymphocytes+into+and+through+inflamed+tissue+using+3-D+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models.</a> Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).</li>
</ol>

著者は、利益相反がないことを宣言します。

ここでは、炎症を起こした内皮によって循環好中球の動員を研究するための2 のin vitro「血管」のモデルについて説明します。これらのモデルの主な利点は、 生体内で起こるように、順番に白血球接着カスケードの各ステップを分析する能力である。我々は以前、TNFαで刺激されたEC 9,29を通じて用量依存的に好中球の接着の増加と転生を観察している。また、両モデルは、白血球動員上の間質細胞の効果を研究するために適合させることができる方法について説明します。ここでは、MSCは、Ibidiのマイクロスライドまたは多孔質フィルターの両側にECと共培養した。これは、両方の細胞型は、それによって互いの表現型応答を改変する、相互に通信することを可能にする。私たちは、MSCの存在は、TNFαで刺激されたECへの好中球の接着を抑制したことを、ここに示されており、これまでの研究23できた。これは間質細胞は、EC応答を改変することを示していますその後サイトカインおよびへの循環白血球の動員を変更します。 上述のモデルに加えて、Cel...

炎症は、微生物感染または白血球に入ると解像度1,2を可能にするために炎症を起こした組織からの出口の厳しい規制を必要とする組織損傷に対する防御応答である。内皮細胞（EC）、その行血管、循環白血球および組織常駐間質細胞の間のクロストークは、このプロセス3を調整するために不可欠である。しかし、白血球およびそれらの無効なクリアランスの制御されない動員は、慢性炎症性疾患4の発展を支える。健康および疾患における白血球動員の我々の現在の理解は不完全であり、より堅牢なモデルは、このプロセスを分析するために必要とされる。 後毛細血管細静脈の血管ECを通して血液から白血球の動員を支援するメカニズムはよく1,2,5に記載されている。循環白血球は、特殊な受容体（ 例えば、VCAM-1、E-セレクチン、P-セレクチン）によって捕捉される炎症性内皮上にアップレギュレートされている。これらの一時的な相互作用は、白血球が表面に結合したケモカインおよび白血球、6- 11で表さインテグリンを活性化する脂質由来メディエーター（起源の内皮または間質のいずれか）と対話することを可能にする。これは、次に接着性を安定化し、内皮を横断し、組織12〜15への移行を駆動する。組織内では、白血球がそれらの運動性、機能および生存16,17に影響を与える間質由来物質にさらされている募集。成長している証拠は、信号は、次のために募集プロセス条件白血球の各段階で受信したことを示唆している。しかし、白血球動員の我々の理解は不完全のままと非常に少ないが、組織内のコンポーネント整形白血球の動きについて知られている。 バーミンガムでは、からの白血球の動員を研究するためのin vitroでのいくつかの「血管」モデルを開発してきました流れ9,18,19。私たちは現在、白血球動員の血管のEC行為として即時の規制当局は、地元の微小環境の変化に対応していることを理解しています。具体的には、組織常駐間質細胞が活発に動員3におけるそれらの役割に影響を与えるために、隣接する血管ECと会話によって部分的に、炎症反応を調節することができる。我々は以前、様々な間質細胞は、組織特異的に接着および白血球の移動をサポートするECの能力を調節することが示されており、これらの効果は、慢性疾患13,16,20,21における変化したことになる。このように、間質細胞を各炎症反応22のコンテキストを定義する組織「アドレスコード」を確立する。より最近では、我々は、骨髄由来MSC（BMMSC）は強力両方の好中球の動員の低下につながる、サイトカインに対するECの応答をダウンレギュレートし、23リンパ球ことを実証した。 メカニズムGOVerning募集が明らかにin vitroでは、主に分離して単一の細胞型（ 例えば、EC）またはタンパク質を組み込んだアッセイを使用している。しかし、これらの研究を考慮に入れていない局所組織環境の影響（ すなわち、間質細胞の存在）の白血球の動員に関する組織へのそれらのその後の移行。ここでは、間質細胞は、特に間葉幹細胞た二フローベースの方法（MSC）を表すEC 23と共培養する。このようなモデルは、流れから白血球動員をサポートするために、特に能力、我々は、内皮応答に対する間質細胞の効果を調べることを可能にする。

<table><tbody><tr><td>コラゲナーゼ Ia Σ</td><td></td><td>C2674</td><td>PBSで10 mL PBSで希釈し、最終濃度を10 mg/mlにします。-20°Cで保存してください。1mlアリコート中のC。</td></tr><tr><td>ダルベッコのPBS</td><td>シグマ</td><td>D8662</td><td>カルシウムと塩化マグネシウム入り。滅菌しておき、RTで保管してください。</td></tr><tr><td>1X Medium M199</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td>ウォーム in 37 &deg;使用前のCウォーターバス。</td></tr><tr><td>硫酸ゲンタマイシン</td><td></td><td>Sigma G1397</td> 4<td>°Cで保存し、M199 500 mlボトルに加えます。</td></tr><tr><td>ヒト上皮成長因子</td><td>シグマ</td><td>E9644-20</td><td>°Cで保存。10 の C & マイクロ;lアリコート。</td></tr><tr><td>子牛胎児血清(FCS)</td><td>シグマ</td><td>F9665</td><td>FCSは、分離されたECの成長と生存率を確認するためにバッチテストする必要があります。56°Cで熱不活性化し、-20°Cで10mlのアリコートで保存します。</td></tr><tr><td>アムホテリシンB</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td>強力で、1週間以内に毒性が生じるため、毎週新鮮な完全なHUVEC培地を調製する必要があります。-20°Cで保管します。1mlアリコート中のC。</td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td>ストックはエタノール中です。-20°Cで保管します。10 の C & マイクロ;lアリコート。</td></tr><tr><td>コラゲナーゼII型</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td>PBS中のストックを最終濃度100 mg / mlに希釈します。100 & マイクロの C;lアリコート。</td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>Sigma</td><td>H3631</td><td>PBS中のストックを最終濃度20,000 U/mlまで希釈し、-20°Cで保存してください。100 & マイクロの C;lアリコート。</td></tr><tr><td>100 & マイクロ;50mlセンチフュージチューブ用mセルストレーナー</td><td>サイエンティフィックラボ用品(SLS)</td><td>352360</td><td>他の市販のセルストレーナー(例:Greiner bio-one)も使用できます。</td></tr><tr><td>DMEM低グルコース</td><td>Biosera</td><td>LM-D1102/500</td><td>37°Cで温まる;使用前のCウォーターバス。</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシンミックス</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>-20°Cで保管。1mlアリコート中のC。</td></tr><tr><td>25cc組織培養フラスコ</td><td>SLS</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>75cc組織培養フラスコ</td><td>SLS</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>骨髄間葉系幹細胞バイアル</td><td>ロンザ</td><td>PT-2501</td><td>到着後、液体窒素で保存してください。セルは到着時には継代 2 にありますが、継代 0 に指定されています。通路3にExapanドし、後で使用するために液体窒素で保存します。</td></tr><tr><td>間葉系幹細胞増殖培地(MSCGM)</td><td>ロンザ</td><td>PT-3001</td><td>37°Cで温まる;使用前のCウォーターバス。Cell Tracker Green染色には、FCSを含まない培地を使用してください。</td></tr><tr><td>EDTA(0.02%)溶液</td><td>シグマ</td><td>E800844</td>°C<td>で4°Cで保存します。使用前のCウォーターバス。</td></tr><tr><td>トリプシン溶液</td><td>Sigma</td><td>T4424</td>は<td>-20°Cで保管します。2mlアリコート中のC。RTで解凍し、すぐに使用してください。</td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>Greiner bio-one</td><td>2019-02</td><td>細胞懸濁液を追加する前に、追加する前に氷上に置いてください。</td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冷凍コンテナ</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>RTの店舗。細胞を含むクライオバイアルを添加する場合は、-80°Cで保存してください。Cを24時間加熱してから、細胞を液体窒素に移します。</td></tr><tr><td>Ibidi u-Slide VI (0.4)、T/C処理済み、滅菌済み</td><td>Ibidi</td><td>IB-80606</td><td>代替モデルには、ガラスキャピラリー、Cellix Biochips(www.cellixltd.com)、BioFluxプレート(www.fluxionbio.com/bioflux/)、GlycoTechパラレルプレートフローチャンバー(http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html)があります。</td></tr><tr><td>セルトラッカーグリーン染料</td><td>ライフ</td>テクノロジーC292555555555555555555555555555555555555555555555555555555 <td></td><td>-20°Cで5mlに希釈し、予熱します(37°C;C) MSCGMの。</td></tr><tr><td>細胞計数室</td><td>Nexcelom</td><td>SD-100</td><td>あるいは、血球計算盤を使用することもできます。</td></tr><tr><td>セロメーター自動T4細胞カウンター</td><td>Nexcelom</td><td>Auto T4-203-0238</td><td></td></tr><tr><td>腫瘍壊死因子&アルファ;(TNF&alpha;)</td><td>R&D Systems</td><td>210-TA-100</td><td>PBSのストックを最終濃度100,000 U/mlまで希釈します。-80°Cで保存します。10 の C & マイクロ;lアリコート。</td></tr><tr><td>6ウェル、0.4 &micro;m PETトランズウェルフィルターSLS</td><td></td><td>353090</td><td></td></tr><tr><td>K2-EDTAを10mlチューブに入れます。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td> 4<td>°Cで保管してください。使用前にRTまで温めてください。</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>4°Cで保管し、使用前にRTまで温めてください。</td></tr><tr><td>10 mlの円形の底の管</td><td>アップルトンの森</td><td>SC211 142 AS</td><td></td></tr><tr><td>7.5% BSAの分率Vの解決</td><td>生命技術</td><td>15260-037</td><td>4 &deg;Cで貯蔵。</td></tr><tr><td>20 ml Plastipakシリンジ</td><td>BDファルコン</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Plastipakシリンジ</td><td>BDファルコン</td><td>302187</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Plastipakシリンジ</td><td>BDファルコン</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>3M低アレルギー性サージカルテープ 9 m x 2.5 cm</td><td>マイクロポア</td><td>1530-1</td> シ<td>リンジタップをパースペックスチャンバーの壁に固定するために使用します。</td></tr><tr><td>シリコンゴムチューブ、内径/外径(ID/OD)1/3mm(細いチューブ)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB68854</td><td>シリコンチューブを適切なサイズにカットします。電子マイクロバルブに直接つながるすべてのチューブは細くなければなりません。</td></tr><tr><td>2/4 mm(厚いチューブ)のシリコンゴムチューブID / OD</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB68855</td><td></td></tr><tr><td>ポルテックスブルーラインマノメーターチューブ</td><td>スミス</td><td>200/495/200</td><td>シリンジポンプにつながるチューブ。</td></tr><tr><td>ポンプ用3ウェイストップコック</td><td>BOCオーメダAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス50mlシリンジ</td><td>ポッパーマイクロメイト</td><td>550962</td><td>気泡を除去して使用前にプライミングする必要があります。</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>レイモンド・A・ラム</td><td></td><td>26 x 76 mm カバースリップ オーダーメイド。ロット番号2440980。</td></tr><tr><td>パラフィルムガスケット</td><td>アメリカンナショナル缶会社</td><td></td><td>アルミニウムテンプレートを使用してパラフィルムの26 x 76 mmピースをカットし、メス10aを使用してそれに20 x 4 mmのスロットをカットします。ガスケットの厚さは約133 & μ;mです。</td></tr><tr><td>2つのパースペックス平行プレート</td><td>ウォルフソン応用技術研究所</td><td></td><td>8本のネジで固定された平行プレートからなる特別に設計されたチャンバー。下部プレートには、中央に切り取られた表示スロットと、カバーガラス、フィルター、ガスケット用のスペースを確保するためにフライス加工された浅いくぼみがあります。上部パースペックスプレートには、流路上に配置された入口と出口の穴があります。</td></tr><tr><td>電子式3ウェイマイクロバルブ デッドスペース最小</td><td>Lee Products Ltd.</td><td>LFYA1226032H</td><td>12ボルトのDC電源に電子的に接続されています。</td></tr><tr><td>輸液/回収用シリンジポンプ (PHD2000)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2001</td><td>直径を29mmに設定し、補充(流量)速度を設定します。</td></tr><tr><td>L字型コネクタ</td><td>Labhut</td><td>LE876</td><td>Ibidiマイクロスライドチャネルの入口ポートと出口ポートに取り付けます。</td></tr><tr><td>ビデオカメラ</td><td>Qimaging</td><td>01-QIC-F-M-12-C</td><td>コンピュータに接続され、デジタルビデオの録画が可能です。</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td>Media Cybernetics</td><td>41N70000-61592</td><td>データ分析用。さまざまな動作を表示するセルに手動でタグを付けます。ローリング速度と移動速度を解析するためのセルの追跡。</td></tr><tr><td colspan="4">ここで説明する試薬の使用上の危険性の詳細については、製品データシートを参照してください。</td></tr></tbody></table>

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

間質細胞は、隣接する内皮細胞とのクロストークを通じて炎症の間に循環白血球の動員を調節する。ここでは、炎症を起こした内皮細胞によって流れから循環好中球の動員を研究するための2 のin vitro「血管」のモデルについて説明します。これらのモデルの主な利点は、 生体内で起こるように、順番に白血球接着カスケードの各ステップを分析する能力である。また、両方のモデルは、白血球動員を調節する際に、この場合、間葉系幹細胞（MSC）は、間質細胞の役割を研究するために適合させることができる方法を記載している。 初代内皮細胞は、Ibidiマイクロスライド上または24時間トランスウェルフィルターの両側に直接接触したヒトMSCを単独で、または一緒に培養した。培養物を、4時間、腫瘍壊死因子α（TNFα）で刺激し、フローベースの接着アッセイに組み入れた。好中球のボーラスを灌流した4分間の内皮上。好中球と内皮との相互作用を流れるの捕獲は位相差顕微鏡により可視化した。 両方のモデルでは、サイトカイン刺激は、用量依存的に流れる好中球の内皮細胞の動員を増加させた。動員された好中球の挙動の分析は、ローリングの用量依存的減少および内皮を通じて遊走の用量依存的増加を示した。共培養では、MSCは、TNFαで刺激された内皮への好中球の接着を抑制した。 当社のフローベースの接着モデルが循環から白血球動員の初期段階を模倣する。白血球に加えて、彼らはそのような治療的に投与MSCまたは循環腫瘍細胞のような他の細胞型の動員を調べるために使用することができる。我々の多層共培養モデルは、MSCが炎症性サイトカインに対する応答を変更するために内皮と通信することが示されている、alteri好中球の動員をngの。このようなモデルを用いてさらに研究が完全に炎症中の白血球の動員をどのように影響するか、間質の異なる組織や条件から細胞（炎症性疾患または癌）を理解するために必要とされている。

当初、我々はIbidiのマイクロスライドモデル（ - 9第7節 ） を使用して、フローからの好中球の募集にTNFαでECを刺激する効果を分析した。 TNFα、任意の好中球は、内皮単層に付着した小さな場合（ 図2A）の非存在下で。これは、25,26を結合サポートするために必要な接着分子（セレクチン）またはケモカインを発現しないEC休止/未処理として、期待された。対照的に、サイトカイン刺激は、用量依存的に有意に（ 図2A）において内皮への好中球の接着を増加させた。接着は通常、検定の過程で安定している。未処理の内皮への白血球の結合は、ECが活性化されるのいずれか（ すなわち、培養プロセス中のLPSで汚染）および/ ​​または好中球は、分離プロセス中に活性化されたことを示している。実際に、LPSは、E-セレクチン、ICAM-1の発現およびVCを増加させることが示されたAM-1、それらが好中球に結合することができるようにECの表面上の25-27。 </...

流れから白血球を募集する炎症を起こした内皮の能力は、間葉系間質細胞によって調節されている。我々は、フローからの好中球動員を評価し、間葉系間質細胞は、このプロセスの調節に果たす役割を調べるために使用することができる一次ヒト細胞を組み込んだ2 のインビトロモデルを記述する。

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

この手順の全体的な目的は、組織 resident 細胞が、炎症時における白血球のリクルートを支持する血管内皮細胞の能力にどのような影響を与えるかを調べることです。これは、まずマイクロスライドモデルとフィルターモデルという2つのin vitro血管モデルのいずれかを用いて、内皮細胞と間葉系幹細胞の共培養系を構築することで達成されます。その後、フローアッセイの前に、これらの培養系にサイトカイン処理を行います。次に、使用するモデルシステムに応じて変更を加えながら、フローベースの接着システムを段階的に組み立てます。最終ステップとして、白血球を血管内皮細胞上へ灌流させ、血流からのリクルートメントおよびその後の挙動を観察します。最終的に、これらの多細胞フローベース接着アッセイにより、間葉系幹細胞と血管内皮細胞のクロストークが炎症時の好中球リクルートメントを抑制することが示されました。本手法は、白血球トラフィッキング分野における重要な疑問、例えば、間葉系幹細胞などの組織常在細胞がこのプロセスをどのように修飾するのか、また、慢性炎症や癌などの疾患においてこの変化は起こるのか、といった問いに答えるのに役立ちます。さらに、これらの知見を新たな治療戦略の開発に活用できる可能性があります。まず、テキストプロトコルに従ってマイクロスライドモデルまたはフィルターモデルを用い、血管内皮細胞と間葉系幹細胞の共培養系を構築し、フローシステムを組み立てます。まず、ヒーターの電源を入れ、37 °Cに設定します。次に、プランジャーを外した20 mLシリンジと5 mLシリンジを3方活栓に取り付けます。続いて、バルブから3方活栓までの距離に相当する長さの2.4 mmチューブを測定し、切断します。1.3 mmのチューブを8～10 mmの長さに切り、太いチューブの一端に挿入します。太いチューブ側を3方コックに取り付け、細いチューブの端を電子3方マイクロバルブのポートに接続して、洗浄リザーバーを作成します。次に、マイクロポアテープを使用してタップをパースペックスチャンバーに取り付けます。続いて、長さ6〜8 mmの太いチューブと細いチューブを用意し、細いチューブを太いチューブの一端に挿入します。プランジャーを外した2 mLシリンジに、太いチューブの端を取り付けます。次に、2 mLシリンジの細いチューブ端を電子マイクロバルブのポートに接続し、サンプルリザーバーを作成します。続いて、マイクロバルブから顕微鏡ステージの中心までの距離に合わせて、長い細いチューブを測定し、切断します。マイクロスライドモデルの場合は、細いチューブの端に8〜10 mmの太いチューブを装着してください。次に、太いチューブの端にL字型コネクタを取り付けます。これはマイクロスライドまたはフィルターモデルに接続されます。細いチューブの端に、8〜10 mmのPortexブルーラインマノメーター接続チューブを取り付けます。次に、細いチューブの端をマイクロバルブに取り付けます。このチューブが、洗浄液およびサンプルリザーバーの共通出力口となります。リザーバーに、ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水を満たします。PBSAを流して気泡を取り除き、チューブ内をプライミングした後、マノメーターチューブを50 milliliterのガラスシリンジに接続します。マイクロスライドモデルの場合は、ガラスシリンジにつながるマノメーターチューブの末端に、10 to 12 millimeterの厚いチューブを接続するだけにしてください。厚いチューブの末端にL字型コネクタを取り付けます。10 millilitersのPBSAを満たして、シリンジをプライミングします。チューブに接続されている側が上を向くようにシリンジを反転させ、すべての気泡を押し出した後、5 millilitersのPBSAを再度満たします。最後に、注入および抽出のため、ガラスシリンジをシリンジポンプにセットします。フロー用のマイクロスライドを準備するため、ガラスシリンジのリフィル速度と直径を設定します。マイクロスライドを倒立位相差顕微鏡のステージに設置します。3方コックを回し、PBSAが入口チューブを流れるようにします。L字型コネクタをマイクロスライドチャネルの入口ポートに接続します。次に、シリンジポンプからのL字型コネクタをチャネルの出口ポートに取り付けます。マイクロスライド上に滴下したPBSAを拭き取ります。あるいは、フィルターモデルの場合、まず金属テンプレートを用いてパラフィルムをガラスカバースリップと同じサイズに切り出します。次に、金属テンプレートを使用してパラフィルムに20×4 mmのスロットを切り抜き、流路を作成します。このパラフィルム製ガスケットを用いて、ガラスカバースリップ上に流路の位置をマークします。6ウェルフィルターの端をガラスカバーのスリップに合わせます。フィルターがフローチャネルのマーキングを覆っていることを確認してください。タイプ10のメスを使用して、フィルターを注意深く切り出します。次に、流路スロットがフィルターの中央に来るように注意しながら、パラフォームガスケットでフィルターを慎重に覆います。清潔なティッシュを用いて、気泡を押し出してください。その後、Perspexフローチャンバーの底板の凹みにカバーガラスを配置します。上部のパースペックスプレートをガスケットの上に配置し、プレート同士をネジで固定します。3方コックを回して、PBSA洗浄バッファーがバルブを通過して流れるようにします。その後、マノメーターのチューブを上部パースペックスプレートのインレットポートに接続します。気泡を取り除くため、PBSAをフローチャネルに流します。次に、シリンジポンプからのマノメーターチューブをパーデックスプレートの出口ポートに接続します。チャンバーの上部プレートに滴下したPBSAを拭き取ります。最後に、チャンバーを倒立位相差顕微鏡のステージ上に置き、フィルター上の内皮細胞を可視化して内皮細胞上に白血球を灌流できるよう焦点を調整します。ピペットポンプをリフィルに設定し、焦点調整が完了したら実行ボタンを押します。内皮細胞単層を可視化するために、2 mLの精製好中球をサンプルリザーバーに入れ、2分間温めます。次に、内皮細胞をPBSAで2分間洗浄します。バルブを開き、内皮細胞の上に好中球を灌流させます。好中球のボーラス投与を4分間行います。バルブを閉じ、実験の残りの時間、洗浄リザーバーからPBSAを灌流させます。実験を行う際は、アッセイのいかなる時点においても気泡が通過しないように注意してください。気泡が通過すると、血管内皮細胞の単層が乱れ、接着した好中球が剥離してしまいます。好中球の流動中、または灌流後に、デジタル画像キャプチャソフトウェアを用いて好中球の動員を記録します。インレットポートにあるチャネルの端に対物レンズを移動させ、ポートの中央を確認して、チャネルの中心を特定します。好中球のフロー中の記録として、フローチャネルの中心にある少なくとも5〜10個の視野をすべてデジタル記録してください。1つの視野で10秒ごとに1分間画像を撮影し、チャネルに沿って移動して別の視野を1分間記録します。灌流後の記録を行うため、ボーラス投与の全期間にわたってこのプロセスを繰り返します。白血球の挙動を評価するため、フローチャネルの中心に沿って5〜10箇所の視野で10秒間の記録を行います。この10秒の間、1秒ごとに画像を撮影してください。これにより、フローによる捕捉および接着好中球の挙動を分析するための十分な時間を確保できます。少なくとも10個の経細胞移動した好中球が含まれる単一の視野を、30秒間隔で5分間記録します。移動した細胞の速度を算出するために、別の10秒間の視野シリーズをさらに記録してください。これにより、好中球が内皮単層を透過して遊走するための時間を確保します。最後に、シリンジポンプを停止し、流出チューブを取り除き、次に流入チューブを取り除きます。フローチャンバーを分解し、サンプルリザーバーをPBSAで洗浄します。後続のフィルターおよびマイクロスライドチャネルについても同様の操作を繰り返し、その後、テキストプロトコルに記載されている白血球のリクルートメントおよび挙動の解析へと進みます。マイクロスライドモデルにおいて、腫瘍壊死因子αによるサイトカイン刺激は、用量依存的に内皮への好中球接着を有意に増加させました。さらに、内皮表面をローリングする好中球の割合において、TNF αの投与量に依存した減少が観察されました。これは、内皮単層を通過して経内皮遊走を行う好中球の割合において、投与量に依存した増加として反映されていました。フィルターベースのフローアッセイにおいても、同様の結果が観察されました。例えば、TNF alpha刺激により、好中球の接着が用量依存的に増加しました。内皮細胞と骨髄由来間葉系幹細胞の共培養では、内皮細胞単独の場合と比較して、好中球の接着が有意に減少しました。また、マイクロスライドモデルで予想される通り、単独で培養しました。同様に、フィルターベースのモデルを用いた場合でも同様の効果が観察され、単一培養と比較して共培養では接着が少ないことが確認されました。このビデオを視聴することで、炎症時に白血球の動員に影響を与えるために、ストローマ細胞が内皮細胞とどのようにコミュニケーションをとっているかを調べる方法について、十分に理解できたはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、白血球と内皮細胞などの細胞パートナーとの相互作用を特徴付ける層流ベースのアッセイを実演しています。この方法は、血管細胞の無傷で合流する層に灌流した場合の白血球の接着、接着解除、および転走に関する動的な洞察を提供します。...

白血球と内皮細胞との間の相互作用を研究するための層流ベースのアッセイ

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白血球動員に及ぼす間質細胞の影響に関するIn vitroフロー調査

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生理フローの状況の下で循環細胞のケモカイン指向溢出を研究する新規三次元フローチャンバーデバイス

肝臓への白血球の動員は、固有の肝臓類洞内皮細胞で裏打ちされている肝正弦波の特殊なチャネル内に発生します。生理学的な剪断応力の条件下でヒト肝臓シヌソイド内皮を通過する白血球動員の位相差顕微鏡は、このプロセスの根底にある分子機構の解明を容易にすることができる。...

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

ここでは、調査員は、マウスの循環系に内皮由来の接着分子でコーティングされたチャンバーを接続することにより、ex vivoでの白血球動員のダイナミクスを評価することを可能にするプロトコルを提示する。それは相対的な生物学的条件下で、白血球の評価を可能にするため、この方法は重要な利点を提供しています。...

におけるフローの状況の下で白血球 - 内皮相互作用を評価するエクスビボ Autoperfusedマイクロフローチャンバーアッセイ

骨髄の組織学的データを定量的に分析する戦略が提示されます。組織切片中の蛍光標識細胞の共焦点顕微鏡検査により、2次元画像が得られ、自動的に解析されます。異なる細胞タイプの共局在解析をシミュレーション画像からのデータと比較し、細胞相互作用に関する定量的な情報を提供します。...

造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

炎症時に血管壁の損傷後、白血球は血管細胞と血小板との対話熱心。ここでは、白血球や細胞パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを特徴付ける簡単流アッセイについて述べる。...

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体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

辺縁帯 B 細胞 (MZBs) は、流れを自分の移行パスを再定位せん断流の力に対応します。このプロトコルは、記録し、流体工学ユニット、ポンプ、顕微鏡イメージング システム、フリー...

生体外でマウス縁帯 B 細胞のせん断流動誘起移行の解析

このプロトコルでは、生理学的に関連する微小血管環境を再現し、白血球接着/遊走カスケード全体を再現することができる生体模倣マイクロ流体アッセイが、炎症性疾患における白血球 - 内皮細胞相互作用を研究するために採用される。...

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。...

マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

学ぼう、炎症時の白血球補充における間質細胞の役割をin vitroモデルで解明する方法。内皮細胞と間葉系幹細胞の共培養系を用いて、好中球の接着と遊走動態を解析し、血管生物学の新たな治療戦略開発に貢献する知見を得る。

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

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