出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

この手順の全体的な目標は、出芽酵母の動的コアタンパク質であるNDC 10およびNDC 80のシミュレーションとユビキチン化を検出することです。これは、まず、SMT 3およびMTタグ付きNDC 10またはNDC 80を発現する酵母細胞を採取し、これらの細胞からタンパク質抽出物を作製することによって達成されます。第2のステップは、summationの検出のためのhissフラグタグ付きSMT 3コンジュゲートを精製するか、またはユビキチン化の検出のためのmik taggキネティックコアタンパク質を免疫沈殿させることです。

その後、ウェスタンブロット分析により、合計化またはユビキチン化が検出されます。最終的に、NDC 10およびNDC 80のラダーパターンの存在は、これらのタンパク質がシミュレートされ、ユビキチン化されていることを裏付けています。記載されているタンパク質精製法は、出芽酵母sacroにおけるconnicoタンパク質ND C 10およびNDC 80のシミュレーションとユビキチン化の両方を検出することを可能にする。

私のcci。この手法の主な利点は、私たちが作成した株が2つのエピトープ攻撃を持ち、1つはテストタンパク質に対する攻撃、もう1つはシミュレーションの検出を可能にすることです。これらのタグを使用すると、ポリクローナル血清の使用時に頻繁に観察される交差反応性によるバックグラウンドが減少します。

この手順のデモンストレーションは、私の研究室の研究員であるCanero Uniによって行われます。目的のタンパク質は、事前に調製し、摂氏マイナス 20 度で保存した酵母細胞ペレットから抽出されます。Resusは、0.5ミリリットルの氷冷緩衝液に細胞を懸濁します。

抽出物がニッケルニトリル、三酢酸、またはニッケルNTAスーパーフロービーズを使用したプルダウンアッセイ用である場合は、ギネバッファーを使用してください。抽出物が免疫沈降用である場合は、バッファーAを使用してください。チューブは常に氷の上に置いてください。

細胞懸濁液を2ミリリットルに移します。各チューブに2つのスクリューキャップを取り付けます。細胞懸濁液ビーズの体積に等しい量のガラスビーズを追加します。

室温で2分間ミニビーズビーターで細胞を叩き、次にチューブを氷の上に2〜3分間置きます。ビーズの叩きとアイシングを3回繰り返します。摂氏4度の高速で30〜60分間渦

顕微鏡で可視化して細胞をチェックし、細胞が溶解していることを確認します。溶解された細胞は、境界や明確な形状を欠き、暗いゴーストとして現れます。最適には、細胞の少なくとも80%を横たわらせる必要があります。

次に、プッシュピンを使用してチューブの底に穴を開けます。スクリューキャップをゆるく取り付け、チューブを15ミリリットルの円錐形チューブに入れます。Gの1000倍で1分間遠心分離します。

ライセートを収集するためには、抽出された蛋白質を4°Cで30分間Gの15、000倍のマイクロ遠心分離機の管遠心分離機にライセートを移す。タンパク質アッセイキットを使用して抽出したタンパク質の濃度を測定した後、すべての抽出物を標準化して、各抽出物に同じ量のタンパク質が含まれるようにします。適切なバッファーを使用して、総容量を1ミリリットルにします。

約5ミリグラムの総タンパク質は、50個のOD 600の細胞から得られます。抽出したタンパク質を全細胞抽出物として50マイクロリットル保存します。残りの950マイクロリットルのタンパク質抽出物は、後でMTタグ付きタンパク質のタンパク質精製または免疫沈降に使用されます。

50マイクロリットルの全細胞抽出物に50マイクロリットルの2 x lalyサンプルバッファーを加えます。サンプルを摂氏100度でヒートブロック内で3〜5分間インキュベートしてから、ウェスタンブロットで分析します。この手順は、精製に必要なニッケルNTAスーパーフロービーズを準備することから始めます。

低速遠心分離に必要な量のビーズを1分間取得します。上清を取り除き、ビーズをPBSで洗います。1ミリリットルのPBSを追加し、ビーズが再懸濁されるまでチューブの上部を下部に反転させます。

低速遠心分離でビーズを収集し、上清を除去します。この方法でビーズを合計5回洗います。ビーズを1ミリリットルのギネバッファーに懸濁し、処理するサンプルに対応する数のチューブに分注します。

低速遠心分離でビーズを回収し、各サンプルの上清を除去します。全細胞抽出物の950マイクロリットルを追加します。ビーズの100マイクロリットルに早く調製しました。

摂氏4度のロッキングプラットフォーム上で少なくとも4時間または一晩インキュベートします。Gの800〜1500倍で、摂氏4度で1分間遠心分離します。上清を50マイクロリットル保存します。

この上清に 50 マイクロリットルの 2 x laly サンプルバッファーを加え、摂氏 100 度でヒートブロック内で 3 〜 5 分間インキュベートします。各サンプルの 10 マイクロリットルは、後でウェスタンブロットで分析します。ニッケルNTAスーパーフロービーズを1ミリリットルのギネバッファーで1回、室温のロッキングプラットフォームで5〜10分間洗浄します。

次に、ビーズを1ミリリットルの破砕緩衝液で5回洗浄し、最終洗浄後に破砕緩衝液でビーズを90マイクロリットルの2×lalyサンプル緩衝液に再懸濁します。10マイクロリットルの1モルイオールを追加して、彼のタグ付きタンパク質をニッケルNTから解離させます。ビーズは、摂氏100度でヒートブロック内で3〜5分間インキュベートします。その後、ボルテックスはGの13,000倍で30秒間遠心分離します。

上清を新しいチューブに移します。この手順を開始するには、低速遠心分離により必要な量の抗cmic aeroアフィニティーゲル抗体を採取します。上清を取り除き、レジンを緩衝液Aで洗浄し、1ミリリットルの緩衝液Aを加え、レジンが再懸濁するまで上を裏

低速遠心分離で樹脂を回収し、上清を除去します。合計5回洗います。1ミリリットルの緩衝液Aにレジンを懸濁し、処理するサンプルに対応する数のチューブに分注します。

低速遠心分離で樹脂を回収し、上清を除去します。950マイクロリットルの全細胞抽出物を25マイクロリットルの樹脂に加え、翌日に摂氏4度のロッキングプラットフォーム上で一晩インキュベートします。Gの800〜1500倍で、摂氏4度で1分間遠心分離します。

上清を50マイクロリットル保存します。この上清に50マイクロリットルの2×100マイクロリットルのサンプルバッファーを加え、ヒートブロック内で摂氏100度で3〜5分間インキュベートします。レジンをバッファーで洗浄し、1ミリリットルのバッファーを追加し、レジンが再懸濁されるまで上を下に反転させます。

低速遠心分離で樹脂を回収し、最終洗浄液から上清を取り除いた後、上清を除去します。レジンを100マイクロリットルのsumeサンプルバッファーに再懸濁し、100°Cのヒートブロック内で3〜5分間インキュベートします。その後、ボルテックスはGの13,000倍で30秒間遠心分離します。

上清を新しいチューブに移します。最後に、このプロトコルから収集されたすべてのサンプルをロードします。SDSのページでは、ウェスタンブロット解析用のゲル、ポリヒスタミンフラグタグ付きSMT 3またはHF SMT 3を発現する酵母株、およびMTタグ付きNDC 80およびNDC 10を使用して、キネティコタンパク質のシミュレーションを検出しました。

HF SMT 3基質をニッケルビーズを用いてアフィニティー精製し、アンチフラッグ抗体で検出しました。抗マイク抗体でプローブすると、HF SMTの3つの基質で合計されたNDC 80が検出されました。HF SMT 3を伴わないコントロール株に修飾タンパク質が存在しないことは、HF SMT 3とその標的タンパク質との間の相互作用の特異性を示しています。

さらに、NDC 80およびNDC 10のユビキチン化を検出するために、NOCO desole処理細胞においてNDC 80およびNDC 10の合計が減少する。ミックは、ND C 80またはND C 10を免疫沈降させ、抗MICおよび抗ユビキチン抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った 全細胞抽出物および上清の分析により、抗MICでプローブしたNDC 80 MおよびNDC 10 M免疫沈降サンプルの発現を確認したところ、NDC 80およびNDC 10が翻訳後修飾を含むことを示唆する複数の高分子量バンドが示された。抗ユビキチンでプローブした免疫沈降サンプルのラダーパターンは、ND C 80およびND C 10がユビキチン化されていることを示しました。

NDC 80およびNDC 10のはしごパターンは、プロテアソーム阻害剤MG1 32による治療によって強化されました。これらがポリユビキチン化を表していることをさらに確認する このビデオを見た後、コウモリNNのマウスとワクチン接種の検出を可能にするタンパク質精製技術についてよく理解しているはずです。