Name: 出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 学ぶ出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeの動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化を検出するタンパク質精製法。ウェスタンブロットで修飾を確認し、細胞分裂におけるタンパク質機能を理解する。

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私たちは、支援と助言をいただいたオリバー・カーシャー博士と、この論文に対する支援とコメントをいただいたバスライ研究室のメンバーに感謝します。この研究は、国立衛生研究所の学内研究プログラムの支援を受けました。

酵母細胞の1成長<ol><li>小さ ​​なフラスコにYPD（ 表1）30mlに酵母細胞を接種します。振とうしながら30℃で一晩インキュベートします。 </li><li> YPD 50mlに600 nmの（OD 600 = 0.2）で0.2の光学濃度に細胞を希釈し、振盪しながら30℃でインキュベートします。 </li><li> 600 nmの（OD 600 = 1.0）で1.0の光学密度に文化を育てます。 </li><li> 2,000×gで5分間遠心操作し細胞と上清を捨てます。 </li><li>細胞を洗浄するために2,000×gで5分間、40ミリリットル滅菌水と遠心機で細胞ペレットを再懸濁します。上清を捨て、-20℃で細胞ペレットを保存します。 </li></ol>タンパク質の2抽出<ol><li>またはNi-NTAスーパーフロービーズを用いたプルダウンアッセイの氷冷グアニジン緩衝液（表1）0.5mlに再懸濁細胞を、免疫沈降した（ 表1）をバッファ。すべての回で氷の上にチューブを保管してください。 </li><li> 2メートルへの転送Lスクリューキャップチューブ。 </li><li>ガラスビーズの同じ容量（ 材料表）を追加します。 </li><li> 2-3分間氷上に置く、その後、室温で2分間のミニビーズビーター（材料表）で細胞をビーズ破りました。この3回繰り返します。 </li><li> 30〜60分間、4℃で高速の渦。細胞が溶解されていることを確認するために顕微鏡下で可視化して細胞を確認してください。 注：溶解した細胞は、暗い幽霊が表示され、境界または規定された形状を欠くであろう。最適細胞の少なくとも80％が溶解されるべきです。 </li><li> 15ミリリットルコニカルチューブ（スクリューキャップが緩んでなければならない）コレクションに押しピンと場所を使用して、チューブの底に穴を穿刺。 </li><li>溶解物を収集するために1分間1000×gで遠心分離します。 </li><li>マイクロ遠心チューブにライセートを移します。 </li><li> 4°Cで30分間15,000×gで遠心分離は、抽出されたタンパク質を回収します。 </li><li>タンパク質ASSAを用いて抽出されたタンパク質の濃度を測定しますYキット（ 材料の表）と同量のタンパク質を含有するすべての抽出物を正規化します。適切な緩衝液で1ミリリットルの全容量を持参してください。 注：総タンパク質の約5 mgを50 OD 600細胞から得られます。 </li><li>全細胞抽出物（WCE）として（ステップ2.10から抽出した全タンパク質は、5mgである場合に250μgタンパク質）50μLを保存します。 2×Laemmliサンプルバッファー（ 表1）の50μlを添加して、3〜5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。負荷ウエスタンブロット分析（第5節：ウェスタンブロット分析）のためのSDS-PAGEゲルの各サンプルを10μl。 </li></ol> HF-SMT3コンジュゲートの3精製<ol><li> 1分間低速遠心（800-1,500 XG）による実験（サンプルあたりのビーズを100μl）のために必要なのNi-NTAスーパービーズ（ 材料表）を取得します。上清を取り除きます。 </li><li>反転トップオーバー：洗浄ビーズを1mlのPBS（材料表）で5倍底ビーズを再懸濁されるまで、低速遠心分離によりビーズを収集し、上清を除去します。 </li><li>グアニジン緩衝液（ 表1）1mlのビーズを中断し、処理対象のサンプルに対応する管の数にそれらをアリコート。低速遠心分離によりビーズを集め、上清を除去します。トップオーバー底を反転させてよく、ビーズを混ぜます。 注：トップオーバー底を反転させてよく、ビーズを混ぜます。 </li><li>のNi-NTAスーパービーズ100μlに：各サンプルについて、（タンパク質の抽出ステップ2.11から）残りのWCEの950μlを添加します。 </li><li>少なくとも4時間、または4℃で一晩、ロッキングプラットフォーム上でインキュベートします。 </li><li> 4°Cで1分間800-1,500×gで遠心分離します。 </li><li>上清（SUP）として50μLを保存します。 2×Laemmliサンプル緩衝液50μlを添加し、3〜5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。ウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲルにおける負荷10μlの各サンプルを（セクション5：ウェスタンブロット肛門ysis）。 </li><li>ロッキングプラットフォーム上で5〜10分間、グアニジン緩衝液1mlで一回ビーズを洗浄します。 </li><li>洗浄ビーズをロッキングプラットフォーム上で5〜10分間のバッファ（ 表1）を破る1mlの5倍。 </li><li> 2×Laemmliサンプルバッファー90μlの再懸濁ビーズ。 </li><li> 1 Mイミダゾールの10μlを添加します。 注：イミダゾールは、イミダゾールとビーズとの間の相互作用を競合に起因したNi-NTAビーズからのHisタグ化タンパク質を解離するのに役立ちます。 </li><li> 3-5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。 </li><li>ボルテックスし、30秒間13,000×gで遠心します。上清を新しいチューブに移します。 </li><li>ウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲル（：ウェスタンブロット分析セクション5）の各サンプルのロード10-20μL。 注：WCEの5 mgを使用した場合、10〜20μlを、入力の0.5〜1.0ミリグラムに相当します。 </li></ol> Myc標識動原体タンパク質の4免疫沈降<ol><li>抗c-Mycのアガロースアフ​​ィニティーゲルANを取得tibody（ 材料表）低速遠心分離（800-1,500 XG）による実験（サンプルあたりの樹脂の25μl）をするために必要な。上清を取り除きます。 </li><li>緩衝液A 1mlで洗浄樹脂5X：反転トップオーバーボトム樹脂を再懸濁されるまで、低速遠心分離によって樹脂を集め、上清を除去します。 </li><li>緩衝液A 1mlの樹脂をサスペンドし、処理対象のサンプルに対応する管の数にそれらをアリコート。低速遠心分離によって樹脂を集め、上清を除去します。 注：トップオーバー底を反転させて十分に樹脂を混ぜます。 </li><li>樹脂の25μlに：（タンパク質の抽出ステップ2.11から）残りのWCEの950μlを添加します。 </li><li>一晩4℃でロッキングプラットフォーム上でインキュベートします。 </li><li> 4°Cで1分間800-1,500×gで遠心分離します。 </li><li>上清（SUP）として50μLを保存します。 2×Laemmliサンプル緩衝液50μlを添加し、3〜5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。ローウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲル（：ウェスタンブロット分析セクション5）の各サンプルの10μlの広告。 </li><li>緩衝液A 1mlで洗浄樹脂5X：反転トップオーバーボトム樹脂を再懸濁されるまで、低速遠心分離によって樹脂を集め、上清を除去します。 </li><li> SUMEBサンプル緩衝液（ 表1）100μlの中に樹脂を再懸濁します。 注：SUMEBサンプル緩衝液を8 M尿素および1％SDS（強い変性条件）を含みます。 </li><li> 3-5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。 </li><li>ボルテックスし、30秒間13,000×gで遠心します。上清を新しいチューブに移します。 </li><li>ウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲル（：ウェスタンブロット分析セクション5）の各サンプルのロード10-20μL。 注：WCEの5 mgを使用した場合、10〜20μlを、入力の0.5〜1.0ミリグラムに相当します。 </li></ol> 5.ウェスタンブロット分析<ol><li> 4~12％のBis-Trisゲル（材料の表）とPERFにタンパク質抽出物をロードORM電気泳動は、90分間120 Vで（ランニング緩衝液： 材料の表）。 </li><li> 90分（： 材料の表転送バッファ）、30 Vで転写装置を用いてニトロセルロース膜（ 材料表）にゲルからタンパク質を転送します。 </li><li>室温で1時間の5％ミルク/ 1×TBST（ 表1）で膜をブロックします。 </li><li> 4℃で一晩、5％ミルク/ 1×TBST中で一次抗体（ 材料表）で膜をインキュベートします。千（抗Flagおよび抗Ubの抗体）または1：5,000（抗Myc抗体）一次抗体は、1の希釈を使用しています。 </li><li> 1×TBSTで10分間ずつの膜3回洗浄します。 </li><li>室温で1時間、5％ミルク/ 1×TBSTで二次抗体（ 材料表）で膜をインキュベートします。二次抗体の希釈5,000：1を使用してください。 </li><li> 1×TBSTで10分間ずつの膜3回洗浄します。 </li><li> ECL workiで膜をインキュベートngの溶液（ 材料表）5分間。 </li><li>青感性X線フィルムに膜（ 材料表）を公開し、自動現像機（ 材料表）を使用して開発しています。 </li></ol>

<ol><li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-1%3A+Ubiquitin+gains+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li>
<li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li>
<li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li>
<li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li>
<li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mub1%2FUbr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216(2013).</li>
<li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li>
<li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li>
<li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li>
<li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li>
<li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum%2Fnuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase-promoting+complex%2Fcyclosome+controls+HEC1+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li>
<li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIZ1%2FSIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li>
<li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158(2007).</li>
<li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+assembly%3A+if+you+build+it%2C+they+will+come%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

そのようなHA、Mycの、フラグ、GSTなどのエピトープタグは、広くタンパク質の生化学的分析のために使用されます。 HF-SMT3などNdc10やNdc80としてMyc標識動原体タンパク質、を有する株の構築は、SUMO化およびユビキチン化などのPTMの検出を容易にしています。 HF-SMT3アッセイをプルダウンNdc10とNdc80（ 図1）、SUMO化動原体タンパク質の検出を可能にします。修飾タンパク質は、HF-SMT3ない対照株では検出されなかったように抗Flag抗体を用いたアフィニティー精製プロトコルおよびウェスタンブロット分析は、HF-SMT3と標的タンパク質との間の相互作用の特異性を確立します。タンパク質基質上のMycタグの使用は、HF-SMT3複合体におけるSUMO化Ndc10とNdc80の存在を検証します。また、Ndc10とNdc80両方のSUMO化は、ノコダゾール処理細胞（ 図1Cおよび1D）に減少しました。ノコダゾールtreatmenに応じてNdc10のSUMO化の減少Tが、Ndc80は、以前Montpetit <em...

それぞれ、標的タンパク質へ;（S.セレビシエ 1 SMT3 SUMO）ユビキチンとSUMO化は、ユビキチンと小さなユビキチン様修飾剤の結合を可能にします。動原体蛋白質のPTMは、忠実な染色体の分離を確実にするために、異なる細胞周期の段階でそれらの細胞レベルおよびタンパク質 - タンパク質相互作用に影響を与えます。例えば、Cse4 / CENP-Aと外側動原体タンパク質DSN1の細胞レベルは、ゲノムの安定性2-5を確保するためのユビキチンを介したタンパク質分解によって調節されています。不正な動原体微小管の添付ファイルの不安定化は、直接微小管6-8と対話DAM1とNdc80複合体をリン酸化するIPL1 /オーロラBキナーゼを必要とします。 70以上の動原体タンパク質の同定にもかかわらず、PTMを、 例えば 、ユビキチンおよびSUMOとのこれらのタンパク質の修飾を調査する非常に少数の研究があります。主な制限は、PTMを維持する能力であります精製およびそのようなSUMO化、リン酸化、メチル化、および他のようなPTMを検出するためのカスタム抗体の不足時にS。 SUMO化動原体タンパク質の特性はNdc10、Cep3は、BIR1、およびNdc80カスタム抗体9を利用しました。さらに、Ndc10は、ユビキチン化10の基質として関与しています。ヒトHec1（S. cerevisiaeにおけるNdc80）も、APC / C-hCdh1 E3リガーゼ11によって規制、ユビキチン化の基質です。したがって、Ndc10とNdc80はSにSUMO化とユビキチン化の両方を検出するためのプロトコルの最適化のための良好な候補でありますセレビシエ 。 SUMO化の識別を容易にするために、我々は、HF-SMT3とMyc標識Ndc10またはNdc80を発現する株を構築しました。エピトープタグ（HF：のHis6フラッグ）の使用は、頻繁に候補タンパク質に対するポリクローナル血清で観察された交差反応性に背景を最小限に抑えることができます。私たちは、親和性のプロトコルを考案しましたHF-SMT3複合体を精製した後、精製SMT3準備にsumolyated Ndc10とNdc80の存在を検出するために、市販の抗フラッグ及び抗Myc抗体を用いました。ユビキチン化のために、我々はmycタグ動原体タンパク質のユビキチン化を保持する修飾された免疫沈降プロトコルを考案し、Ndc10とNdc80のユビキチン化を検出するために、市販の抗Ubの抗体を用いたウエスタンブロット分析を行いました。

<table><tbody><tr><td>ガラスビーズ</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td>直径0.5 mm</td></tr><tr><td>ミニビーズビーター</td><td>BioSpec Products</td><td>#693</td><td>8細胞攪乱器</td></tr><tr><td>Ni-NTA スーパーフロー</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anti-c-Myc アガロース アフィニティ ゲル アントボディ ウサギで生産</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>モノクローナル抗フラグ M2 抗体 マウスで産生</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>一次抗体、希釈 1:1,000</td></tr><tr><td>c-Myc 抗体 (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>一次抗体、希釈 1:5,000</td></tr> 精製<tr><td>マウス抗体モノクローナル 9E10</td><td>コーヴァンス</td><td>MMS-150P</td><td>一次抗体、希釈 1:5,000</td></tr><tr><td>ユビキチン (P4G7)モノクローナル抗体</td><td>コーヴァンス</td><td>MMS-258R</td><td>一次抗体、希釈率 1:1,000</td></tr><tr><td>ECL Rabbit IgG、HRP 結合全抗体</td><td>GE GE ライフサイエンス</td><td>NA934V</td><td>二次抗体、希釈 1:5,000</td></tr><tr><td>ECL マウス IgG、HRP 結合全抗体</td><td>GE GE ライフサイエンス</td><td>NA931V</td><td>二次抗体、希釈率 1:5,000</td></tr><tr><td>DC タンパク質アッセイ</td><td>バイオ・ラッド</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロースメンブレン</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0.45 mm 孔径</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1.0 mm, 10 well</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>青色感受性 X 線フィルム</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>自動現像液</td><td>コダック</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>ノコダゾール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>セレック ケミカルズ</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

出芽酵母動原体タンパク質ndc10とndc80のsumo化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

このようなリン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、およびSUMO化などの翻訳後修飾（PTMを）は、多くのタンパク質の細胞機能を調節します。動原体DNAに関連付ける動原体タンパク質のPTMを、ゲノムの安定性を維持するために忠実な染色体分離を媒介します。このような質量分析およびウェスタンブロット分析のような生化学的アプローチは、最も一般的のPTMの同定のために使用されます。ここで、タンパク質精製法は、サッカロミセス·セレビシエに、Ndc10とNdc80、動原体タンパク質のSUMO化及びユビキチン化の両方の検出を可能にすることが記載されています。ポリヒスチジンFlagタグ付きSMT3（HF-SMT3）およびMyc標識Ndc10またはNdc80を発現株を構築し、私たちの研究のために使用しました。 SUMO化の検出のために、我々は、ニッケルビーズを用いて、HisタグSUMO化タンパク質をアフィニティー精製するためのプロトコルを考案し、SUMO化Ndc10 Aを検出するために抗Myc抗体を用いたウエスタンブロット分析を使用しましたND Ndc80。ユビキチン化の検出のために、我々はMyc標識タンパク質の免疫沈降のためのプロトコルを考案し、Ndc10とNdc80がユビキチン化されていることを示すために抗Ubの抗体を用いたウェスタンブロット分析を使用していました。我々の結果は、彼のフラッグで目的のエピトープタグ化タンパク質はSMT3株は、複数のPTMの検出を容易にタグ付けされたことを示しています。今後の研究では、この技術の利用は、特定のPTMに依存しているタンパク質相互作用を同定し、特徴付けるために許可する必要があります。

以前9,12に記載されているように動原体タンパク質Ndc80とNdc10のSUMO化を検出するために、HF-SMT3とMyc標識動原体タンパク質（Ndc80またはNdc10）を有する株は、（ 表2）を構築しました。 HF-SMT3結合体は、親和性のNi-NTAビーズを用いて精製しました。 HF-SMT3（ 図1A及び図1Bに示すように 、左パネル）を含まない対照株には存在しなかったSUMO基質のSUMO化形態の抗Flag抗体検出を可能と精製HF-SMT3のウエスタンブロット分析。予想されるように、SUMO基質の複数の形態は、HF-SMT3株で検出されました。 Ndc80とNdc10は抗Myc抗体を用いたウエスタンブロット分析を行うことにより、精製されたHF-SMT3複合体中に存在している場合我々は、次を決定しました。 Ndc80またはNdc10より高い分子量のものであった複数のバンドがはっきりと（ 図1Aおよび図1B、</stron...

この原稿は、出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において、動原体タンパク質、Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出について説明します。

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

本手順の全般的な目的は、出芽酵母のキネトコアタンパク質であるNDC 10およびNDC 80のSUMO化およびユビキチン化を検出することである。これはまず、His-FLAGタグ付きSMT3およびMycタグ付きNDC 10またはNDC 80を発現している酵母細胞を回収し、これらの細胞からタンパク質抽出液を調製することによって達成される。次のステップでは、SUMO化を検出するためにHis-FLAGタグ付きSMT3共役体を精製するか、あるいはユビキチン化を検出するためにMycタグ付きキネトコアタンパク質を免疫沈降させる。その後、ウェスタンブロット解析によってSUMO化またはユビキチン化を検出します。最終的に、NDC10およびNDC80にラダーパターンが認められることで、これらのタンパク質がSUMO化およびユビキチン化されていることが確認されます。上述のタンパク質精製法により、出芽酵母*Saccharomyces cerevisiae*におけるキネトコアタンパク質NDC10およびNDC80の両方のSUMO化およびユビキチン化を検出することが可能です。私のcci。この手法の主な利点は、作成した株が2つのエピトープ攻撃部位を持っていることです。一つはテストタンパク質に対するもので、もう一つはシミュレーションの検出を可能にするものです。これらのタグを使用することで、ポリクローナル血清を使用した際に頻繁に見られる交差反応によるバックグラウンドを低減できます。この手順のデモンストレーションは、私の研究室のリサーチフェローであるCanero Uniが行います。目的タンパク質を、あらかじめ調製し-20°Cで保存していた酵母細胞ペレットから抽出します。細胞を0.5 mLの氷冷バッファーに再懸濁してください。ニッケルニトリル、三酢酸、またはnickel NTA superflowビーズを用いたプルダウンアッセイに抽出液を使用する場合は、guineバッファーを使用してください。免疫沈殿に抽出液を使用する場合は、バッファーAを使用してください。チューブは常に氷上で保持してください。細胞懸濁液を2 mLずつ移します。各チューブにスクリューキャップを締めます。細胞懸濁液と同量のガラスビーズを加えます。ミニビードビーターを用いて、室温で2分間細胞を破砕し、その後チューブを氷上に2〜3分間置きます。このビード破砕と冷却を3回繰り返します。4°Cで30〜60分間、高速でボルテックス処理を行います。顕微鏡下で細胞を可視化して確認し、細胞が溶解していることを確かめます。溶解した細胞は暗いゴーストのように見え、境界や明確な形状が失われます。最適には、少なくとも80%の細胞が溶解している必要があります。次に、プッシュピンを使用してチューブの底に穴を開けます。スクリューキャップを軽く締め、チューブを15 milliliterのコニカルチューブに入れます。1000 times Gで1分間遠心分離します。ライセートを回収するため、ライセートをマイクロ遠心チューブに移し、4 °Cで15,000 ×gにて30分間遠心分離し、抽出タンパク質を回収します。タンパク質定量キットを用いて抽出タンパク質の濃度を測定した後、各抽出液に含まれるタンパク質量が同一になるように規格化します。適切なバッファーを用いて、全量を1 mLに調整してください。50 OD 600の細胞から、約5 mgの全タンパク質が得られます。抽出したタンパク質のうち50 µLを全細胞抽出液として保存します。残りの950 µLのタンパク質抽出液は、後のタンパク質精製またはMTタグ付きタンパク質の免疫沈殿に使用します。50 µLの2x Laemmliサンプルバッファーを、50 µLの全細胞抽出液に加えます。ウェスタンブロッティングで分析する前に、サンプルをヒートブロックを用いて100 °Cで3〜5分間インキュベートします。まず、精製に必要なニッケルNTA Superflowビーズを準備することからこの手順を開始してください。低速遠心分離を1分間行い、必要な量のビーズを回収します。上清を除去し、PBSでビーズを洗浄します。1 mLのPBSを加え、ビーズが再懸濁されるまでチューブを上下に反転させます。低速遠心分離でビーズを回収し、上清を除去します。この手順でビーズの洗浄を計5回繰り返します。ビーズを1 mLのguine bufferに懸濁し、処理するサンプル数分のチューブに分注します。低速遠心分離によってビーズを回収し、各サンプルの上清を除去します。あらかじめ調製した全細胞抽出液 950 µLを、100 µLのビーズに加えます。ロッキングプラットフォームを用いて、4 °Cで少なくとも4時間、または一晩インキュベートします。4 °Cで800〜1500 ×g、1分間遠心分離します。上清を50 µL回収します。この上清に 50 µL の 2x Laemmli サンプルバッファーを加え、ヒートブロックを用いて 100 °C で 3〜5 分間インキュベートします。その後、各サンプルの 10 µL をウェスタンブロッティングで解析します。ニッケル NTA Superflow ビーズを 1 mL の Guine バッファーで一度洗浄し、室温のロッキングプラットフォーム上で 5〜10 分間静置します。次に、ビーズを1 mLのbreaking bufferで5回洗浄します。breaking bufferでの最後の洗浄後、ビーズを90 µLの2× laly sample bufferに再懸濁します。Ni-NTAビーズからHisタグ付きタンパク質を解離させやすくするため、1 M imidazoleを10 µL加えます。ヒートブロックを用いて100 °Cで3〜5分間インキュベートします。ボルテックスした後、13,000 ×gで30秒間遠心分離します。上清を新しいチューブに移します。この手順を開始するために、低速遠心分離によって必要な量のanti cmic aero アフィニティーゲル抗体を得ます。上清を除去し、バッファーAでレジンを洗浄します。1 mLのバッファーAを加え、レジンが再懸濁されるまで上下に反転させて混ぜ合わせます。低速遠心分離によって樹脂を回収し、上澄み液を除去する。計5回洗浄を行う。樹脂を1 mLのバッファーAに懸濁させ、処理するサンプル数に応じた数のチューブに分注する。低速遠心分離によってレジンを回収し、上清を除去する。25 µLのレジンに950 µLの全細胞抽出液を加える。ロッキングプラットフォームを用い、4 °Cで一晩インキュベートし、翌日に回収する。4 °Cで800〜1500 ×gで1分間遠心分離する。上清を50 µL回収します。この上清に2x lam ly サンプルバッファーを50 µL加え、ヒートブロックを用いて100 °Cで3～5分間インキュベートします。レジンをバッファーAで洗浄します。バッファーAを1 mL加え、レジンが再懸濁されるまで上下に反転させて混ぜ合わせます。低速遠心分離でレジンを回収し、最終洗浄後の上清を除去します。レジンを100 µLのsumeサンプルバッファーに再懸濁し、ヒートブロックを用いて100 °Cで3〜5分間インキュベートします。ボルテックスミキサーで撹拌した後、13,000 ×gで30秒間遠心分離します。上清を新しいチューブに移します。最後に、本プロトコルで回収したすべてのサンプルをロードします。Western blot解析用のSDS-PAGEゲルにおいて、polyhistidine flagタグ付きSMT3（HF-SMT3）およびMTタグ付きNDC80およびNDC10を発現する酵母株を用いて、キネトコアタンパク質の共局在を検出しました。HF SMT three基質をニッケルビーズを用いてアフィニティー精製し、Anti-Flag抗体で検出しました。anti mic抗体でプローブしたところ、HF SMT three基質中にSUMO化されたNDC 80が検出されました。HF SMT threeを欠いたコントロール株において修飾タンパク質が認められないことは、HF SMT threeとその標的タンパク質との相互作用の特異性を示しています。さらに、NDC 80およびNDC 10のユビキチン化を検出するため、NOCO desole処理細胞においてNDC 80およびNDC 10の総量を減少させた。Mycタグ付きのNDC 80またはNDC 10を免疫沈降させ、抗Myc抗体および抗ユビキチン抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。全細胞抽出液および上清の分析により、NDC 80 MおよびNDC 10 Mの発現が確認された。抗MICで検出した免疫沈降サンプルでは、複数の高分子量バンドが認められ、NDC 80およびNDC 10に翻訳後修飾が含まれていることが示唆された。抗ユビキチンで検出した免疫沈降サンプルのラダリングパターンにより、NDC 80およびNDC 10がユビキチン化されていることが示された。NDC 80およびNDC 10のラダリングパターンは、プロテアソーム阻害剤MG 1 32による処理によって増強されました。これにより、これらがポリユビキチン化を表していることがさらに確認されました。このビデオを視聴することで、bat NNの検出およびワクチン接種を可能にするタンパク質精製技術について十分に理解できるはずです。

protein-purification-technique-that-allows-detection-sumoylation

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ユビキチン化は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。この変更に関与する遺伝子の変異が様々なヒト疾患に関連付けられています。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明...

タンパク質のユビキチン化の検出

CO浄化ヌクレアーゼ及びプロテアーゼによって従来の方法で精製した真核生物リボソームの調製品の汚染は否定的に下流の生化学的および構造解析に影響を与えます。迅速かつ簡単なクロマトグラフィー精製法は、モデル系として、酵母のリボソームを使用してこの問題を解決するために使用されます。...

高活性酵母のリボソームのクロマトグラフィー精製

このビデオでは、複雑なペプチド混合物から残留ジグリシンペプチドを含むユビキチン化ペプチドを抽出し精製する方法について説明しています。提示された方法は、タンパク質中の元のユビキチン化部位を同定するのに役立つ可能性があります。...

ユビキチン化ペプチドの免疫親和性ベースの抽出:精製ペプチド画分からユビキチンタグ付きペプチドを選択的に抽出する技術

このビデオでは、シーケンシャル酵素カスケードを用いた基質タンパク質のSUMO化のin...

SUMO化アッセイ:イムノブロッティングにより基質タンパク質のSUM化状態を検出するIn vitro技術

高品質の酵母細胞抽出物の調製は、個々のタンパク質または全体プロテオームの解析に必要な最初のステップである。ここでは、タンパク質機能、相互作用、および翻訳後修飾を維持するために最適化された出芽酵母細胞のための、高速で効率的、かつ信頼性の高い均質化プロトコルが記載されている。...

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

ユビキチンリ ガーゼとは異なりいくつかの相撲 E3 リガーゼが同定されています。この変更された体外sumo 化プロトコルの in vitro再構成法による新規相撲 E3...

体外相撲 E3 リガーゼ活性を研究する sumo 化アッセイ

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。...

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

CENP-Aのユビキタスは、細胞分裂間の二量体化によって受け継がれ、細胞の生存率に不可欠なセントロメレでのCENP-A沈着にとって重要な要件です。ここでは、EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A)...

EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) のユビキタス性を同定するための質量分析分析

このプロトコルは、例としてp53腫瘍抑制タンパク質を使用して哺乳動物細胞からユビキチン化タンパク質を精製するための段階的な方法を記載している。ユビキチン化p53タンパク質を、ストリンジェントな非変性および変性条件下で細胞から精製した。...

哺乳類細胞からのユビキチン化p53タンパク質の精製

本プロトコルは、トポイソメラーゼ阻害剤およびホルムアルデヒドによって誘導されるユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化を含む、DNA-タンパク質架橋(DPC)およびそれらの翻訳後修飾(PTM)を検出および定量するための改変方法を強調し、それによってDPCおよびそのPTMの形成および修復の研究を可能にする。...

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

ユビキチン化は細胞内タンパク質機能の重要な調節因子です。ここでは、哺乳類細胞における基質タンパク質のユビキチン化レベルを検出するための2つの細胞溶解法を説明し、それらのユビキチン化レベルの解析効果を比較します。HEK293T細胞内のタンパク質過剰発現は一時的なトランスフェクションによって誘導され、ウビキチン化タンパク質はウェスタンブロット解析によって検出されました。...

SMAD2/SMURF2をモデルとした哺乳類細胞溶解液におけるユビキチン検出の比較戦略

学ぶ出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeの動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化を検出するタンパク質精製法。ウェスタンブロットで修飾を確認し、細胞分裂におけるタンパク質機能を理解する。

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

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