全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

この手順の全体的な目的は、腸組織からヒト腸管上皮細胞を回収することです。まず、腸粘膜をその下の粘膜下組織から剥離させます。次に、粘膜をEDTAとともにインキュベートし、上皮を結合組織から解離させます。

次に、分離した上皮から腸管陰窩を分離します。最後に、腸管陰窩を基底膜マトリックス中で培養します。最終的に、免疫組織化学的手法を用いて、培養されたOIDの上皮組織化および特定の上皮マーカーを確認します。

この手法の意義は、患者固有の生検組織からOIDを生成できるようになったことです。これにより、これまで不可能であった、実験室で実際の組織を用いて腸疾患の研究や診断を行うことが可能になります。テキストプロトコルに従って緩衝液と試薬を調製した後、組織が届いた時点で、基底膜を氷上で解凍し、24ウェルプレートを37 °Cの二酸化炭素インキュベーターでプレインキュベートします。カルシウムおよびマグネシウム不含のKO PBSまたはDPBSを用いて、DPBSが透明になるまで組織を洗浄してください。

組織を、氷冷したDPBSを満たしたシリコンコーティング済みのガラス製ペトリ皿に、粘膜側を上に向けて置きます。次に、ミニュチンピンを用いて組織を伸ばしながら固定します。続いて、解剖顕微鏡下で、マイクロ解剖用ハサミと微細先端の曲げピンセットを使用し、粘膜下層および結合組織から下層の粘膜を剥離します。その後、粘膜側を上にした状態で、剥離した粘膜をシリコンコーティング済みのガラス製ペトリ皿の上で平らに伸ばして固定します。

曲がったピンセットを使用して、粘膜の表面をそっと掻き出します。この工程は、調製物の品質を向上させるために必要です。粘膜を、調製したばかりの2 mM EDTAキレート緩衝液で覆います。

その後、解剖顕微鏡下でテキストプロトコルに従い、組織を氷上で3〜4回洗浄します。曲がったピンセットを使用して粘膜を優しく掻き取り、ピペットで腸管陰窩を放出させます。ペトリ皿から陰窩懸濁液を静かに取り出し、50 mLコニカルチューブに移します。その後、組織を確認し、ほぼすべての陰窩が粘膜から除去されていることを確認してください。

クリプト懸濁液を150 µmのフィルターで2回ろ過し、顕微鏡でろ過液を確認します。テキストプロトコルに従ってクリプト懸濁液を洗浄し、必要な数のクリプトを5 mLラウンド底チューブに移した後、クリプト画分を150 G、4 °Cで10分間遠心分離します。次に、あらかじめ冷却したピペットチップを用いて上清を除去し、基底膜マトリックスでクリプトペレットを再懸濁します。

あらかじめ温めておいたプレートの各ウェルに、基底膜マトリックス中のcrypt懸濁液を50 µLずつ、ウェルの中央にゆっくりと分注します。基底膜マトリックスを完全に重合させるため、プレートを37 °C、5% CO2インキュベーターで30分間インキュベートします。その後、2.5 µMのCHIR 9 0 2 2 1を添加したcomplete human mini gut mediumを500 µL、基底膜マトリックスの上に重層します。

Thienらは、2日後に培地を交換し、その後は1日おきに培地を交換して組織をインキュベートした。この図は、全組織から新鮮に単離したクリプトの典型的な例を示している。生検から単離されるクリプトの数は、全組織からよりも少ない。

通常、1回のパスで2箇所の生検採取が行われます。各生検採取により10平方ミリメートルの表面積が得られ、1回あたり平均50〜100個のクリプト（腸腺）が回収されます。培養および基底膜マトリックスによる5〜6日間の培養後、クリプトは凝集して、小腸の場合はエンテロスフィアを、大腸の場合はコロノスフィアを形成し、7日後に継代されます。

ここで示した生検から作製されたオルガノイド（OIDs）は、播種時の密度が低い場合に同様の成長過程をたどります。そのため、通常は培養開始から10〜12日後にパッキングを行います。ここで示したように、OIDsはともに管腔側を持ち、上皮によって裏打ちされています。

増殖細胞はOIDs内で観察され、芽の先端に位置しています。E-カドヘリン（緑色）で染色したOIDsの共焦点画像により、上皮細胞が示されています。この図は、上皮細胞接着分子遺伝子の先天性変異による嚢胞性線維症およびタフティング腸症を患う患者由来の腸管の成長を示しています。

この手順、またはリアルタイムPCRやウェスタンブロッティングのような手法を用いることで、目的の遺伝子やプローブに関するさらなる疑問を解消することができます。このビデオを視聴することで、ヒトCRISPRを一貫して単離する方法を十分に理解し、ラボで効率的にエンティティを生成して、患者固有の疑問に対する回答を得ることができるようになります。