Name: マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 学ぶマウス胎児脳の神経回路可視化法。双方向トレーサーと逆行性トレーサーを用いて、発生期の神経回路形成と単一細胞レベルのシナプス接続を解析します。この手法は発生神経科学の重要課題解明に貢献します。

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原稿に対する批判的なコメントをいただいたMichael Candlishに感謝します。このプロジェクトは、ウルリッヒ・ベームに対するドイツ研究振興協会の助成金BO1743/6およびSFB/TRR 152 P11およびZ02の支援を受けました。

注：倫理声明：動物を対象とする手順は、ハンブルク大学とザールラント大学の動物福祉委員会によって承認された。 1.準備と胚組織の固定<ol><li>胚を解剖し、動物を犠牲にする前に、組織のその後の固定のためのソリューションを準備するために必要なすべての機器を配置します。 注：常に（pHを7.4に調整し、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中4％PFA）新鮮な4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液を調製する。 </li><li>倫理的に承認された手順とタイミングを妊娠したメスのマウスを安楽死させる。 </li><li>プラットフォーム上にマウスを転送します。 70％エタノールで腹部の腹側を湿らせ、腹腔を露出させ、鋭いハサミを使って垂直切開する。 </li><li>胚チェーンを特定し、慎重に鈍鉗子を使用してそれを引き出し、氷冷PBSにそれを配置します。 </li><li>から個々の胚を削除する細かいハサミとピンセットを用いて、胚チェーン。胚の周りに余分な組織を除去し、氷冷PBSでそれらを洗ってください。 </li><li> （PFAに胚を転送する前に）小さな尾の生検を取り、性別の識別とトレーサー対立遺伝子の遺伝子型決定PCR用テール溶解バッファーでそれをインキュベートする。 </li><li>ほとんどの側面に胚か​​ら開始し、シェーカー上で氷の上の氷冷4％PFAを含むチューブに別々に各胚を移す。 </li><li>一定に振盪しながら氷上で1.5時間E13.5歳以下の年齢で胚を浸す。一定に振盪しながら氷上で2.5時間、年齢E14.5とE15.5で胚を浸す。 </li><li>胚の年齢E16.5歳以上の場合は、首を切るとPFA溶液に頭を浸漬する前に、外側の皮膚を除去。 E16.5胚の頭部が一定に振盪しながら氷上で4.5時間浸漬することができます。 </li><li>適切な固定後、氷冷PBSで胚を3回洗浄する。それらは沈むまで4℃でPBS溶液中の30％スクロース中に胚を移し下へ。 </li></ol> 2.凍結<ol><li>クライオ金型、クライオ手袋、フェザー級昆虫学鉗子、マーカーペン、最適切削温度化合物（OCT）：凍結プロセスを開始する前に必要なすべての材料を配置</li><li> （組織、日付と遺伝子型の向きに言及）恒久的なアルコール耐性マーカーでクライオモールドラベルを付けます。砕いたドライアイスのスラッシュとアイスバケットで100％エタノールを準備します。イソペンタンを含む内部のガラスビーカーを置きます。イソペンタンを冷却するために10分間待ちます。 </li><li>一方、ショ糖溶液から組織を除去する実験室のワイプを用いて組織の周りに余分なショ糖を拭き取る。組織をカバーするために十分な10月で予め標識低温金型に組織を移す。 10月中に気泡を避ける。特に組織の周りに。 </li><li>組織の損傷を避けるために、フェザー級昆虫学の鉗子を使用して、OCTで組織を向けます。クライオモルを転送することによって、凍結開始予め冷却したイソペンタン浴中dは。それが適切に凍結しないように10月にイソペンタンをかけないでください。 -80℃でアルミ箔とストア内のサンプルを包みます。 </li></ol> 3.凍結切片化<ol><li>クライオスタットを用いて、5のシリーズの中で14μmの薄い連続切片をカットし、免疫蛍光（IF）分析のためのSuperFrost®プラスガラススライド上に収集する。使用するまで-80℃でスライドを保管してください。 </li></ol>チラミドシグナル増幅（TSA）プロトコルを使用して4トレーサーの可視化<ol><li>染色に必要なバッファーと試薬を準備します。常に新鮮に利用当日にトリスNaClのトゥイーン（TNT）のバッファを準備します。 <ol><li> 1 Lの最終容量までのNaClとのddH 2 O 5の1 Mトリス塩酸pH7.5の、30ミリリットルの100ミリリットルを使用して、TNT緩衝液を準備する1ミリリットルピペットを用いてのTween 20の500を添加する。すべてのTween 20であることを保証するためにゆっくりとツイーン20を加え、上下に数回ピペットをフラッシュソリューション。 </li><li>ブロッキング試薬5グラムを追加1 Lの最終容量まで1 Mトリス塩酸pH7.5の、30のNaClとのddH 5 mlの2 Oの100ミリリットルを使用してトリスのNaClブロッキング（TNB）のバッファを準備します（付属キット）をゆっくりバッファに少しずつ攪拌しながら。 （これは30〜60分より長い時間がかかるべきではありません）完全にブロッキング試薬を溶解するために連続的に撹拌しながら55℃まで徐々にソリューションを熱し。均質な加熱は55℃の水浴を使用し達成するために。ソリューションは、乳白色に表示されます。使用する前に室温にソリューションを持参してください。長期保存のために-20℃で小分けし、保存。 </li><li>分子生物学/ HPLCグレードDMSO中（キットに付属）ビオチンチラミド試薬を再構成する。これに応じて、キットは、DMSOの適切な量は変化し得るために使用される。 4℃で保存溶液を保管してください。 注：それぞれのCreおよびR26対立遺伝子についてヘテロ接合性動物からの切片は、回路解析のために使用することができる。使用Sネガティブコントロールとして、それぞれ1 のCreまたは1 R26対立遺伝子を運ぶ同腹仔からections、。正確にダブルヘテロ接合動物からのスライドのようなネガティブコントロールスライドを扱います。また、ダブルヘテロ接合動物から一つの制御スライドを含むが、TSA試薬（増幅されていないコントロール）を除外。 </li></ol></li><li>鋭い新鮮なメスは、組織切片の周囲の過剰なOCTを除去し、PAPペンでセクションの周りに境界をマークする使用。 </li><li>室温（RT）で2〜3分間、スライドを乾燥させる。 5分ごとにTNTでRT 3Xでスライドを洗う。内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし、氷冷メタノール中で0.3％H 2 O 2溶液中に室温で30分間スライドをインキュベートする。 </li><li>室温で5分間ごとに、PBSで洗浄3X。組織透過性のためにPBS中0.5％トリトンX-100で10分間インキュベートする。 5分ごとにTNTでRT 3Xでスライドを洗う。 </li><li> TNBとのブロック30（スライドあたり、200〜300μlのブロッキング溶液）加湿チャンバー中室温で分。すべてのセクションが完全にTNBでカバーされていることを確認してください。スライドはステップ間で完全に乾くせてはいけない。 </li><li>過剰のブロッキングバッファーを切るとトレーサー認識する一次抗血清を適用するRTまたは一晩、4℃で2時間、TNB中に希釈し（1：1,000ヤギ抗WGA BLのため、1 15000ウサギGTT抗GFP）を。完全に組織切片（スライドあたり200〜300μl）をカバーするために十分なボリュームを使用してください。 注：ここで推奨プライマリ抗血清希釈液を調整しなければならないことがある。 </li><li> 5分で攪拌しながらそれぞれのTNTでRT 3Xでスライドを洗う。 </li><li> （：抗WGAのための500ウマ抗ヤギIgG、1：RTで1時間TNBにおける抗GFPのために5000ヤギ抗ウサギIgG 1）最初の抗血清のホストを認識し、ビオチン化二次抗血清でのセクションをインキュベートします。 </li><li> 5分で撹拌しながら、各RTでTNTを洗浄3X。 100ストレプトアビジン（SA）結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（SA-HRP、提供のWi：1でインキュベートする加湿チャンバー内で室温で30分間、TNB中キット）番目。 5分ごとにTNTでRT 3Xでスライドを洗う。一方、TSAを解凍。 </li><li> （キットに付属、BLの可視化とGTTのためのTSA +キット用TSAキットを使用）TSA増幅希釈剤中TSA 1:50に希釈する。 RTで正確に10分間、希釈したTSAでの組織切片をインキュベートします。使用直前にTSAを希釈し、理想的に前の洗浄工程の間に、将来の実験のために、残りの希釈されたTSA試薬を使用しないでください。常に新鮮な準備。 </li><li> 5分で攪拌しながらそれぞれのTNTでRT 3Xでスライドを洗う。 RTで30分間TNBで500のAlexa Fluor（登録商標）546ストレプトアビジンコンジュゲート：1でインキュベートする。 5分で攪拌しながらそれぞれのTNTでRT 3Xでスライドを洗う。 </li><li>核染色のために室温でPBS中の5％ビスベンズイミド溶液中で10分間インキュベートする。 5分で攪拌しながらそれぞれのTNTでRT 3Xでスライドを洗う。 Fluromount Gでマウントし、エピ蛍光または共焦点顕微鏡法を行う。 <em&gt;トラブルシューティング：トレーサー転送の有効性は、（使用のCreドライバ線によって決定される）を産生する細胞におけるROSA26遺伝子座の発現レベルに依存し、神経回路上（トレーサー、収束等の産生ニューロン数など ）を分析します。したがって、ここに推奨1次抗血清の希釈は、低または過剰な信号を防止するために調整されなければならない。背景は、常に適切な対照スライド（上記参照）を使用して分析されるべきである。 </li></ol>胚セクション5.τlacZ染色<ol><li>染色に必要なバッファーと試薬を準備します。常に新鮮に使用前のLacZバッファーCを準備します。 <ol><li> 1ミリリットルの70％ジメチルホルムアミド（DMF）のX-galを40gのを添加することにより5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド（X-galの）ストック溶液（40 mg / mlの）を調製。長期保存のために-20℃でアルミホイルや店舗で覆い。 </li><li>準備し、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）番目1ミリリットルの70％DMFにNBTを50g添加することによりOCK溶液（50 mg / mlで）。長期保存のために-20℃でアルミホイルや店舗で覆い。 </li><li> LacZの25％グルタルアルデヒドを80μl、4％PFAの5ミリリットル、1 MのMgCl 2、最終的に最大500のEGTAを100μl、1ミリリットルM 1のリン酸緩衝液pH7.4とのddH 2 O20μlのを使用して固定液の準備容量10ml。 </li><li> LacZを500 mMのEGTAを用いて、1 mlの1 MのMgCl 2、5ミリリットル、500ミリリットルの最終容量までの1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）とのddH 2 Oを50mlのバッファ準備する。 </li><li> 1mlのMののMgCl 2、500 mMのEGTA 5mlの5mlの1％デオキシコール酸ナトリウム、10％のNP-40を100ml、50 1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）の溶液とのddH 2 Oを使用してLacZのバッファBを準備500ミリリットルの最終容量まで。 </li><li>使用直前に新鮮な作り、アルミホイルで覆ったLacZ緩衝液Bの1mlにNBTストック溶液10μlおよびX-galストック溶液12.5μLを添加することにより、LacZの緩衝液Cを調製する。 </li></OL&gt; </li><li> （その間PAPペンでスライドを準備する）は、少なくとも10〜15分間室温でスライドを乾燥させます。 </li><li> LacZのセクションでは、化学ヒュームフード内部の加湿チャンバー内で室温で2分間固定液固定する。 PBSで3回洗浄を、2mMのMgCl 2を補った。 </li><li> LacZを持つスライドを室温で10分間、3回ずつ洗浄緩衝液のLacZ緩衝液Aでスライドを洗浄します。 5分間ずつのLacZ緩衝液Bで2回洗浄する。加湿チャンバー内で6時間または一晩30〜37℃でのLacZ緩衝液Cでスライドをインキュベートする。 注：LacZのバッファCの十分なボリュームを追加します。スライドは、インキュベーション中に完全に乾くべきではありません。 </li><li>適切なインキュベーションの後、PBSでスライドを洗浄は、2のMgCl 2を補った。のddH 2 Oで簡単にセクションをすすぐマイヤーのグリシンゼラチンでカバースリップ。微分干渉コントラスト（DIC）イメージング·セットアップを搭載した光学顕微鏡に適しています。 </li></ol> 6. GENDERおよびトレーサージェノタイピング<ol><li> 10ミリリットルの最終容量を補うために、1Mトリス塩酸pH8.5の、500 mMのEGTA、10％SDS、5 M NaClおよびのddH 2 O400μlの200μlの100μlを1ミリリットルを使用してテール溶解バッファーを準備します。 </li><li>尾の生検を含む各エッペンドルフチュー​​ブにテール溶解バッファー500μlのを追加します。を100mg / mlの最終濃度にプロテイナーゼKを加える。 55℃でシェーカー上で一晩インキュベートする。 </li><li> RTで10分間、17000×gで遠心分離サンプル。新しい遠心チューブに上清を移し。上清に500μlのイソプロパノールを加える。アップ及びダウンチューブを反転させて、少なくとも5分間混ぜる。 </li><li> RTで5分間17000×gで遠心機でスピン。上清を注ぐ。 70％エタノール200μlを追加します。少なくとも5分間振る。 </li><li> 5分間17000×gで遠心分離する。ピペットマン（オフかけないでください）​​で上清を取り除きます。 15〜30分間のウォーム室（37℃）でペレットを乾燥させる。 </li><li> 100μlの再懸濁ペレット低TE pHが8.0または水の広口径フィルターチップを使用。適切な溶解に一晩で1時間、55℃に入れ、37℃で。 4℃で保存。 </li><li> PCR反応（尾DNA1μlの、各プライマー2.5μlのDMSO、10 PM、25の各dNTPμM、及び1Mベタインを含む50μlの反応混合物）のためのDNA1μlのを使用してください。ジェノタイピングと性別識別のためのPCRプライマーは、 マテリアルの表に記載されている。 </li></ol>

<ol><li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
<li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>DeFalco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-assisted+mapping+of+neural+inputs+to+a+feeding+center+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus.</a> Science. 291, 2608-2613 (2001).</li>
<li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+arcuate+nucleus+kisspeptin+neurons+communicate+with+GnRH+neurons+in+utero%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero.</a> J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).</li>
<li>Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+approach+to+trace+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genetic approach to trace neural circuits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).</li>
<li>Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+trans-synaptic+transfer+of+green+fluorescent+protein+allows+the+genetic+mapping+of+neuronal+circuits+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).</li>
<li>De Roux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypogonadotropic+hypogonadism+due+to+loss+of+function+of+the+KiSS1-derived+peptide+receptor+GPR54%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).</li>
<li>Seminara, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GPR54+gene+as+a+regulator+of+puberty%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The GPR54 gene as a regulator of puberty.</a> N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+completion+of+puberty+in+female+mice+depend+on+estrogen+receptor+alpha-signaling+in+kisspeptin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).</li>
<li>Seibler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+copy+shRNA+configuration+for+ubiquitous+gene+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice.</a> Nucleic Acids Res. 33, e67(2005).</li>
<li>Semaan, S. J., Kauffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+on+the+epigenetic+and+transcriptional+regulation+of+the+Kiss1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).</li>
<li>Feil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-activated+site-specific+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ligand-activated site-specific recombination in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).</li>
</ol>

利益相反は宣言されていません。

遺伝的に定義されたニューロン集団の神経回路をトレースする導入遺伝子として経シナプストレーサーを発現するトレーサーまたはneurotopicウイルスの定位注射と比較していくつかの利点を有する。まず、トレーサーは、内因性タンパク質として産生されるので、任意の免疫応答を誘発しないと選択的な神経経路は、再現性の高い別の動物で分析することができる。これは、非侵襲的な方法であるため、第二に、それは、 子宮内で 、例えば、定位注射のために容易にアクセスできないニューロンから回路をトレースするために利用することができる。制限は、トレーサの検出が困難になる可能性経シナプス転送における一般的に低い有効性を含む。さらに、トレーサー分子は、すべてのシナプスに希釈されます。対照的に、神経向性ウイルスが複製し、ひいてはウイルス複製は、次にシナプスを横断した後に信号増幅をもたらす。しかし、ウイルス複製にも主要なlimitatです本質的なウイルスの細胞毒性による神経向性ウイルスの使用のイオン。遺伝的にいくつかの遺伝的経シナプストレーサーの特徴とは、神経向性ウイルスは、表1において比較される修正された。 <p ...

解剖パストレースは、脳と行動1との間の関係を解読するための最も一般的に使用さツールの一つです。神経回路のトレース技術の進歩は、マウス2における遺伝的に特定されニューロン集団から神経回路をトレースする能力を持つ神経科学を授けている。これらの技術的進歩にもかかわらず、それは特に、胚成熟中の神経回路の形成を解明するために依然として厳しい。現在までに開発さトレースの方法の多くは経シナプストレーサーまたは遺伝的に改変された神経向性ウイルスの定位注射（ 図1）2,3に基づいているためである。これらの技術は、発達中の脳、注射部位の再現性、注射部位の電位の炎症と最もimporに、接続性の空間的および時間的分解能を達成するような技術的に困難なトレーサー注射などのいくつかの固有の制限ものの神経向性ウイルスによるtantlyの細胞毒性は、それらの使用4を制限する。 別の方法は、遺伝子改変マウスでの導入遺伝子として経シナプストレーサーを表明することにある。我々は最近、この手法を変更し、すべての遺伝的に特定されニューロン集団5の神経回路をマッピングするために、バイナリ遺伝経シナプストレーシングシステムを開発した。 Cre介在した後に私たちの実験的な戦略は、双方向のトレーサー大麦レクチン（BL）6またはROSA 26座からGFP（GTT）7に融合した逆行性トレーサー破傷風毒素フラグメントCのいずれかを発現する二つの新しいノックインマウス系統に基づいており、再結合。ここでは、選択的にキスペプチンを作る神経細胞のBLとGTT、生殖軸8,9の成熟の調節に関与している神経ペプチドを表現するために、これらのマウス系統を使用していました。我々は、この技術は、キスの発達および成熟を可視化するために適していることを証明する雌マウスの脳5の胚発生時にpeptin神経回路。 育種戦略 R26-BL-IRES-τlacZ（BIZ）とR26-GFP-TTC（GTT）トレーサーラインがノックインされた組換えROSA26対立遺伝子を運ぶ菌株5。 R26-BIZとR26-GTT対立遺伝子は、2つのloxP部位5が隣接している強力な転写停止信号の存在に転写的に沈黙している。 BIZとGTT導入遺伝子の発現は、転写停止信号のCre媒介除去により活性化される。 R26-BIZとR26-GTT対立遺伝子は、単にのCreドライバラインと交配することによって独立して使用することができる。分析動物についてそれぞれCreおよびR26対立遺伝子についてヘテロ接合を使用することができる。 1 のCreまたは1 R26対立遺伝子を有する同腹仔は、それぞれ、対照として使用されるべきである。あるいは、トンを生成することも可能であるノックインriple のCre、R26-BIZとR26-GTT対立遺伝子を有する動物が、これは一つの追加のクロスが必要になります。

<table><tbody><tr><td>ビスベンズイミド(Hoechst 33258染料)</td><td>Sigma</td><td>14530-100MG</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>クライオモールド(ピール・ア・ウェイ)</td><td>Polyscience Inc.</td><td>18646A-1</td><td>22 x 22 x 20mm</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマ</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド (DMF)</td> <td>VWR 化学薬品</td><td>23470,293</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>フルオロマウント G</td><td>サザン バイオテック</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>シグマ</td><td>34988-7</td><td></td></tr><tr><td>イソペンタン (メチル 2-ブタン)</td> <td>Σ</td><td>M32631-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>カイザーのグリシン ゼラチン</td><td>メルク</td><td>1092420100</td><td></td></tr><tr><td>メタノール Σ</td><td></td><td>494437-1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Σ</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ROTH</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Σ</td><td>298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 substitute</td><td>Fluka</td><td>743.85</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Parafarmaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>ΣD6750-25G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td></td><td>ΣS7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロストスライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>FT4981GLPLUS</td><td></td></tr><tr><td>TSAキット</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL700</td><td></td></tr><tr><td>TSAプラスキット</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL749A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>ROTH</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ROTH</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>ROTH</td><td>2315.1</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>DIC イメージングを搭載した光学顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 Axio Vision ソフトウェア</td><td></td>を搭載した</tr><tr><td>Fluroscence 顕微鏡</td> Axio Vision ソフトウェア<td></td>を搭載した <td>Zeiss</td><td>Axioskop2</td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ anti-WGA (BL を認識)</td><td>ベクトルラボアトリーズ</td><td>AS-2024</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化ウマ抗ヤギ IgG</td><td>ベクターラボアトリーズ</td><td>BA-9500</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ抗ウサギ IgG</td><td>ベクターラボアトリーズ</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗 GFP (GTT を認識)</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗 GnRH</td><td>アフィニティーバイオ試薬</td><td>PA1-121</td><td></td></tr><tr><td>Dylight488-ロバ抗ウサギIgG Thermo</td><td>Scientific</td><td>SA5-10038</td><td></td></tr><tr><td>SA-Alexa Fluor 546</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primers</td></tr><tr><td>BL Fwd (BIZジェノタイピング用)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>ATGAAGATGATGAGCACCACCGC</td></tr><tr><td>BL Rev (BIZジェノタイピング用)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCCCTCGCCGCAGAACTC</td></tr><tr><td>Cre Fwd (Creジェノタイピング用)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG</td></tr><tr><td>Cre Rev (Cre ジェノタイピング用)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC</td></tr><tr><td>TTC Fwd (GTT ジェノタイピング用)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT</td></tr><tr><td>TTC Rev (GTT ジェノタイピング用)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA</td></tr><tr><td>XY Fwd (性別ジェノタイピング用)</td><td>ユーロフィン MWG オペロン</td><td></td><td>TGAAGCTTTTGGCTTTGA</td></tr><tr><td>XY Rev (性別ジェノタイピング用)</td><td>ユーロフィン MWG オペロン</td><td></td><td>CCGCTGCCAAATTCTTTG</td></tr><tr><td>ROSA26 FWD</td><td>ユーロフィン MWG オペロン</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr><tr><td>ROSA26 Rev</td><td>ユーロフィン MWG オペロン</td><td></td><td>GCAGATGGAGCGGGAGAAAT</td></tr><tr><td>SA Rev</td><td>ユーロフィン MWG オペロン</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr></tbody></table>

マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

解剖学的な経路追跡は、脳と行動の関係を解読するために極めて重要です。しかし、脳の胚成熟期における神経回路の形成を解明することは、これまでに開発されたほとんどの経シナプス追跡法が定位トレーサー注入に依存しているため、技術的に困難です。この問題を解決するために、マウスの脳における条件付き遺伝的経シナプストレースのためのバイナリ遺伝学的戦略を開発しました。この目的のために、Cre-mediated組換え後のROSA26遺伝子座から、双方向のtranssynaptic tracer barley lectin(BL)と逆行性transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment Cを選択的に発現させるために、2つの相補的なノックインマウス系統を作製しました。これらのマウスにおける細胞特異的トレーサー産生は遺伝的にコードされており、機械的なトレーサー注入に依存しません。したがって、私たちの実験的アプローチは、胚マウスの脳における神経回路形成を研究するのに適しています。さらに、シナプス間のトレーサー移動はシナプス活性に依存するため、これらのマウス系統は、脳の発達における遺伝的に定義されたニューロン集団間のコミュニケーションを単一細胞分解能で解析するために使用できます。ここでは、新規組換えROSA26対立遺伝子を用いたマウス胚の経シナプストレースの詳細なプロトコールを提供します。私たちは、この実験手法を利用して、発生中の雌マウス脳の生殖軸の成熟を支える神経回路を解明しました。

このセクションでは、R26-BIZ（B L-I RES-τlacのZ）とR26-GTT（G FP-TT C）の対立と協力を得ることができる代表的な結果を示している。ここでは、生殖軸を調整する神経回路の成熟を ​​分析するためにR26-BIZとR26-GTT対立遺伝子を使用しています。脊椎動物で複製することは、中央ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）を分泌する視床​​下部ニューロンの小さなサブセットによって制御されます。キスペプチン、のGnRHニューロンの強力な活性化は、しかしのGnRHとキスペプチンニューロン間の神経回路が発達メスのマウスの脳内で確立されたときに5を知られていなかった、のGnRHニューロンの活性を調節に関与している。まず、BIZとGTT導入遺伝子の発現を特異的胚におけるCre依存組換えによって活性化されることを示しているキスペプチン固有のCreドライバライン10を使用して、弓状核（ARC）におけるキスペプチンニューロン（ 図2）。</stron...

二元的な遺伝的戦略を利用して、Creを介した組換え後に相補的な経シナプストレーサーを発現するマウスの神経回路トレースのための詳細なプロトコルを提供します。細胞特異的トレーサー産生は遺伝的にコードされているため、私たちの実験的アプローチは、マウス胚の脳発生中の神経回路の形成と成熟を単一細胞分解能で研究するのに適しています。

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

本実験の目的は、3つの異なる細胞標識システムを用いて、マウス胚脳における神経回路の発達を可視化することです。具体的には、双方向に移動するトランスシナプス追跡剤、逆行性にのみ移動する2つ目の追跡剤、そして標的細胞から移動しない3つ目の標識を用います。これにより、標的ニューロン、上流ニューロン、および下流ニューロンを特定することが可能です。本結果は、この実験プロトコルを用いることで、マウス胚の雌脳における神経回路の形成を単一細胞解像度で解析できることを示しています。この手法は、特定の神経回路がいつ形成され、胚発生の過程でどのように構築されるかといった、発達神経科学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。また、成体マウスにおける神経回路の追跡にも利用可能です。具体的には、遺伝的に特定されたニューロン間のシナプス活動の解析や、異なる実験条件が時間の経過とともに神経回路をどのように変調させるかの解析に活用できます。安楽死させた直後の妊娠マウスを用意します。腹部の腹側を70% ethanolで清掃し、垂直に切開して胚を露出させます。胚の列を取り出し、氷冷したPBSが入ったディッシュに移します。鈍端ピンセットを使用して個々の胚を取り出します。微細剪刀とピンセットを用いて溶液中で個々の胚を分離し、胚が完全に洗浄された時点で余分な組織を除去します。各胚から尾部の生検組織を少量採取し、性別判定およびジェノタイピング用のDNAを回収するため、溶解バッファーの入ったチューブに入れます。その後、胚を新しく調製した氷冷4% PFAへと移し、氷上で保持します。各胚の処理後、胚のサイズに応じて、攪拌しながらPFA中で少なくとも1.5時間インキュベートします。インキュベートが完了したら、固定した組織を、氷冷PBSで3回、1回あたり少なくとも5分間洗浄します。次に、胚を4°Cに保持した30%スクロース溶液に移します。組織が溶液に完全に沈んだら、凍結切片作成に進みます。まず、アルコール耐性のある油性マジックを使用して、クライオモールドにラベルを貼ります。次に、アイスバケット内で砕いたドライアイスを100% Ethanolに混ぜてスラリーを調製し、そのスラリーを用いてイソペンタンが入ったガラスビーカーを約10分間冷却します。待機している間に、組織をショ糖溶液から取り出し、標準的なラボ用ワイプで余分なショ糖を拭き取ります。次に、組織をあらかじめラベルを貼ったクライオモールドに移します。組織を覆うのに十分な量のOCTを加えてください。OCTの中に、特に組織の周囲に気泡が入らないように注意してください。次に、組織に最小限のダメージで済むよう、極細の昆虫用ピンセットを用いて組織の方向を調整します。必要に応じて、飛散させないように注意しながら、冷却したイソペンタンバス中でクライオモールドを凍結させます。凍結したモールドは、薄切りの際に使用できるよう、包んだ状態で-80°Cで保存することが可能です。これらを14 micronの厚さで、5枚ずつの連続切片に切り出します。5枚1組の切片をSuper Frost Plusガラススライドに回収してください。本プロトコルの溶液を調製する際は、Tween 20をTNTバッファーにゆっくりと加えてください。なお、TNTバッファーは調製後すぐに使用してください。次に、溶液をゆっくりと上下にピペッティングして混ぜ合わせます。TNB緩衝液を調製する際は、攪拌しながらブロッキング剤を少量ずつゆっくりと加えてください。その後、ウォーターバスを用いて溶液を55 °Cまで加熱します。溶液が乳白色になります。次に、組織の作業を開始するため、まずメスを使用して組織切片の周囲にある余分なOCTを除去します。その後、パップペンを用いて各切片の境界線をマークします。スライドを室温に戻します。次に、室温の1×PBSバッファーで3回洗浄し、各洗浄時間は5分間とします。続いて、氷冷した0.3%過酸化水素含有メタノール中でスライドを30分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチします。続いて、室温のPBSで5分間ずつ3回洗浄します。次に、組織を透過させるため、スライドをPBST中で10分間インキュベートします。その後、スライドをTNTで3回洗浄します。次に、加湿チャンバー内で、各スライドが浸る十分な量のTNBを用いて組織をブロッキングします。室温で30分間ブロッキングを行います。スライドを乾燥させないように注意してください。ブロッキングバッファーを完全に除いた後、トレーサーを結合させるために、TNBで希釈した一次抗体でスライド全体を覆います。室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。一次抗体を除去するため、室温でTNTを用いて、1回5分間の洗浄を3回行います。これらの洗浄の間、穏やかに攪拌してください。次に、切片を二次抗体溶液中で1時間インキュベートします。その後、室温で3回のTNT洗浄を行い、未結合の二次抗体を除去します。次に、加湿チャンバー内で、TNB中の1～100倍に希釈したストリッピング済みhavein結合西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて、組織を室温で30分間インキュベートし、同時にスライドをTNTで洗浄します。インキュベーション後、TSA溶液を新たに希釈して調製します。次に、この調製したばかりのTSA希釈液を組織に適用し、室温で正確に10分間静置します。TSAによるインキュベーションの正確なタイミングが極めて重要です。そのため、一度に大量のスライドを処理しようとせず、1回のステップにつき最大10枚までのスライドを処理してください。追加のスライドは、さらに洗浄を繰り返した後、処理されるまでTNT洗浄バッファー内で待機させることができます。組織を1:500に希釈したAlexa Fluor 546結合抗体に、TNB中で30分間インキュベートします。室温で、さらに3回のTNT洗浄を行い、ストリッピングしたハビタントコンジュゲートを除去します。次に、核染色のため、PBSで調製した5% BISベンゾ溶液を室温で10分間適用し、3回のTNT洗浄でBISベンゾ染色液を除去します。その後、FluoroMount Gでスライドを封入し、解析に進みます。記載されたプロトコルを用いて、R 26 BIZおよびR 26 GTTアレルを保持するマウスにおいて、生殖軸を制御する神経回路の成熟を解析した。導入遺伝子の発現は、Kisspeptin特異的Creドライバーラインを用い、弓状核の胚性kisspeptinニューロンにおけるCre依存的な組み換えによって活性化させた。kiss. IC R 26 BIZ由来の、kisspeptin（緑色）とBL（赤色）の二重免疫蛍光染色の結果である。KISS IC R 26 GTTマウスにおけるBLの活性化が示されている。二重免疫蛍光染色は、KISSPEPTINを緑色に、Creドライバーによって活性化されたGTTを赤色に示している。これらおよびその他の診断により、E 18.5の実験的胚において導入遺伝子が機能していることが証明された。弓状核のキスペプチンニューロンは、すでにGNRHと通信していることが判明した。Zを欠くニューロンはCREを発現するキスペプチンニューロンに限定されていたが、BLはトランスシナプス的に上流および下流のニューロンに転移していた。すべてのGnRHニューロンではないが、一部のGnRHニューロンにBLが含まれていた。したがって、胚性GNRHニューロンの一部のみが弓状核のkisspeptinニューロンとシナプス結合しています。GNRHニューロンには逆行性トレーサーが含まれていませんでした。GTTにより、これらのニューロンがkisspeptinニューロンの下流にあることが示されました。この手法を習得すれば、以下の手順に従って1日で実施することが可能です。また、二重免疫蛍光染色などの他の手法を用いることで、接続されたニューロンの生化学的性質を特定できます。本手法は、神経科学および発生生物学分野の研究者が、発生期および成体動物の両方において、単一細胞レベルの解像度で神経接続を探索するための道を切り開くものと期待されます。このビデオを視聴することで、マウスにおける神経回路の形成と成熟を視覚化する方法について深く理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

発展途上のマウス脳への遺伝子導入法は、ユニークな手術法と電極の特殊な形状を用いて記述されます。このユニークな手法は、脳の発達の研究に多くの神経科学者を支援する時間的および空間的にプラスミドDNAのトランスフェクションすることができます。...

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

この資料では詳細に子宮内で大脳皮質およびマウスのE14.5における海馬をエレクトロポためのプロトコルについて説明します。また、このこれらの2つの脳領域で樹状突起と棘を研究する貴重な方法であることを示している。...

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

シナプス接続されたニューロンをトレースする方法が記載されている。我々は、目的の細胞集団は遺伝的に定義された種類の細胞からシナプス入力を受け取るかどうかを調べるために上流の細胞のTVAの特異性を利用する。...

遺伝的に定義された神経回路のトレースウイルス

出典: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains.J. Vis. 経験。...

マウス皮質介在ニューロン前駆細胞におけるアガロース包埋エレクトロポレーション支援遺伝子導入

発達神経生物学の根本的な問題はどのように神経細胞のネットワークが胚の脳の中で確立されています。ここでは、そのようなのCre /...

ニワトリ胚における軸索軌道とシナプスターゲットを追跡する後脳のエレクトロ

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マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーション

我々は、in vitroでの調製物を用いて脳核に順行性または逆行性トレーサー注射を介して、神経細胞とそのプロセスを標識する技術が記載されています。我々 は 、nラベリング精度を高めるために、蛍光標識されたマウスの変異体および基本光学機器を利用して、トレーサーエレクトロ体 ​​外 I既存の方法を変更しました。...

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

このプロトコルは、放射状に移動する皮質ニューロンの直接観察のための指示を提供する。 子宮内でのエレクトロポレーションでは、器官型スライス培養および時間経過共焦点画像化を組み合わせて、移動するニューロンにおける関心対象遺伝子の過剰発現または下方制御の影響を直接かつ動的に研究し、発生時のそれらの分化を分析する。...

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

脳における遺伝子の細胞の自律的機能損失を誘導することによって学ぶことができるまたは細胞のまばらな人口の機能を得る。ここでは、関数の vivoの損失を引き起こす floxed の遺伝子を持つ皮質ニューロンの開発のまばらな人口に Cre...

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

透過型電子顕微鏡と子宮内で伝達の組み合わせは、開発中に神経系の細かい微細構造の形態学的変化を研究するための強力なアプローチです。これらの併用は、神経可塑性の地形表現に関しての基になる構造の詳細の変更への深い洞察をことができます。...

子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぶマウス胎児脳の神経回路可視化法。双方向トレーサーと逆行性トレーサーを用いて、発生期の神経回路形成と単一細胞レベルのシナプス接続を解析します。この手法は発生神経科学の重要課題解明に貢献します。

マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

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