マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

次の実験の目標は、双方向に移動するトランスシナプストレーサー、逆行性でのみ移動する第2のトレーサー、および標的細胞から移動しない第3の標識を使用して、3つの異なる細胞標識システムを使用して、胚マウス脳の神経回路の発達を視覚化することです。標的ニューロンの上流ニューロンと下流ニューロンを特定することが可能です。この結果は、この実験プロトコルを使用して、胚の雌マウス脳の神経回路の形成を単一細胞の分解能で解析できることを示しています。

この方法は、特定の神経回路がいつ形成され、胚発生中にどのように組織化されるかなど、発生神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、成体マウスの神経回路の追跡にも使用できます。具体的には、遺伝的に同定されたニューロン間のシナプス活動の解析に利用でき、さまざまな実験条件が時間の経過とともに神経回路をどのように調節するかを解析するために使用できます。

安楽死させたばかりの妊娠中のマウスから始めます。腹部の腹側を70%エタノールで洗浄し、次に垂直に切開して胚を露出させます。胚の鎖を取り除き、皿の中の氷冷PBSの皿に移します。

鈍い鉗子を使用して個々の胚を取り出します。細いハサミと鉗子を使用して個々の胚を溶液中で分離し、胚が完全に洗浄されたときに余分な組織を取り除きます。各胚から小さな尾部生検を行い、溶解バッファーのチューブに入れて、性別の特定とジェノタイピングのためにDNAを収集します。

次に、胚を新しくできた氷冷、氷上の4%PFAに移します。各胚を処理した後、サイズにもよりますが、少なくとも1.5時間攪拌しながらPFAでインキュベートします。インキュベーションが完了したら。

固定ティッシュを氷冷PBSで3回、1回の洗浄につき少なくとも5分間洗浄します。次に、胚を摂氏4度に保たれた30%ショ糖溶液に移します。組織が溶液に完全に浸かったら、凍結切片処理を進めます。

まず、永久的な耐アルコール性マーカーを使用してクライオモールドを標識することから始めます。次に、砕いたドライアイスを100%エタノールで氷のバケツに調製し、スラリーを使用してisop pentaneのガラスビーカーで約10分間冷却します。待っている間に、ショ糖溶液から組織を取り除き、標準的な実験室用ワイプで余分なスクロースを拭き取ります。

次に、組織を事前に標識したクライオ型に移します。組織を覆うのに十分なOCTがあります。OCT内、特に組織の周囲に気泡を形成しないでください。

次に、フェザーウェイト昆虫鉗子を使用して組織の向きを合わせ、損傷を最小限に抑えます。冷却されたiso pentane浴でクライオ型を凍結し、必要に応じて飛沫を発生させないようにします。凍結した型は、マイナス80°Cで包んで保管し、型を切断することができます。

それらを14ミクロンの厚さのシリアルセクションに5つのシリーズにカットします。スーパーフロストプラススライドガラスで各5スライスシリーズを収集します。このプロトコルの溶液を調製するときは、tween 20をTNTバッファーにゆっくりと追加してください。

次に、溶液をゆっくりと上下に洗い流して混合します。TNBバッファーを調製する際には、攪拌しながらブロッキング試薬を少しずつゆっくりと加えます。次に、ウォーターバスを使用して溶液を摂氏55度に加熱します。

溶液は乳白色になります。さて、組織の作業を開始するには、まずメスを使用して、組織切片を囲む余分なOCTを取り除きます。次に、パップペンを使用して各セクションの境界をマークします。

スライドを室温に戻します。その後、室温で1つのXPBSバッファーで洗浄し、各洗浄を3回5分間にする必要があります。次に、スライドを氷冷、0.3%過酸化水素メタノール中で30分間インキュベートすることにより、内因性ペルオキシダーゼ活性を急冷します。

これに続いて、PBSで室温で3回、1回の洗濯につき5分間洗浄します。次に、スライドをPBSTで10分間インキュベートして、組織に浸透させます。今回は、スライドをTNTで3回洗います。

加湿チャンバーで、各スライドを覆うのに十分なTNBで組織をブロックします。ブロックを室温で30分放置します。スライドを乾かさないでください。

ブロッキングバッファーを排出した後、スライドをTNB中の一次抗体で完全に覆い、トレーサーに結合します。室温で2時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。一次抗体を除去するには、スライドをTNTで室温で3回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。

これらの洗浄中は、穏やかに攪拌してください。次に、二次抗体溶液中の切片を1時間インキュベートします。室温で室温で、TNT洗浄を3回使用して、結合していない二次抗体を除去します。

次に、加湿チャンバー内で、TNB中の1〜100個の剥ぎ取りハベイン結合ウマワサビペルオキシダーゼで組織をインキュベートし、室温で30分間、スライドをTNTで洗浄します。インキュベーション後、TSA溶液を新たに希釈します。次に、新たに作成したTSA希釈液を室温で正確に10分間組織に塗布します。

TSAインキュベーションの正確なタイミングは非常に重要です。したがって、私たちの手で一度に多くのスライドを処理しようとしないでください。1ステップで最大10枚のスライドを処理できます。

追加のスライドは、別の洗浄ラウンドの後に処理されるまでTNT洗浄バッファーで待機できます。1〜500個のAlexaフロア5 46を剥がして組織をインキュベートします。TNBで30分間コンジュゲートに入れます。

室温で、剥がれた居住者の抱合体をさらに3つのTNTバスで取り除きます。.次に、核染色のために、5%BISベンザ溶液をPBSに室温で10分間適用し、3回のTNT洗浄でBISベンゾジアゼピン染色を除去します。次に、スライドをfluoro Mount Gにマウントし、分析を進めます。

記載されたプロトコルを用いて、生殖軸を調節する神経回路の成熟を、R 26 BIZおよびR 26 GTT対立遺伝子を保有するマウスで分析した。導入遺伝子の発現は、キスペプチン特異的なクリードドライバーラインを使用して、弓状核の胚性キスペプチンニューロンにおけるクリード依存性組換えによって活性化されました。キスペプチン特異的なクリードドライバーラインは、キスから緑色でキスペプチン、赤色でBLの二重免疫蛍光法を使用しました。アイシーアール26ビズ。

マウスはKISS IC R 26 GTTでBLの活性化を示し、マウスの二重免疫蛍光法はキスペプチンを緑で、GTTはクリードライバーによって活性化された赤を示しています。これらおよびその他の診断法により、導入遺伝子がE 18.5実験胚で機能していることが実証されました。弓状核内の彼のピピンニューロンは、すでにGNRHと連絡していることがわかりました。

ニューロンの欠如Zはキスペプチンニューロンを発現するCREに限定され、BLは上流および下流のニューロンにシナプス的に移行されました。すべてではありませんが、一部です。GNRHニューロンにはblが含まれていました。

したがって、胚性GNRHニューロンのサブセットのみが弓状核キスペプチンニューロンにシナプス的に結合しています。GNRHニューロンには逆行性トレーサーは含まれていませんでした。これらのニューロンがキスペプチンニューロンの下流にあることを実証するGTT。

一度習得すると、この手順の後、1日でこのテクニックを実行することができます。二重免疫蛍光法などの他の方法を利用して、接続されたニューロンの生化学的性質を同定することができます。この技術は、神経科学と発生生物学の分野の研究者が、発生中および成体動物の両方で単一細胞の解像度で神経接続を探求するための道を開くはずです。

このビデオを見れば、マウスの神経回路の形成と成熟を視覚化する方法を十分に理解できるはずです。