ゼブラフィッシュ角膜実質外植片は皮膚創傷治癒における集団細胞の移動および再上皮化を研究するために

この手順の全体的な目標は、集団細胞遊走および上皮創傷治癒研究で使用するためのゼブラフィッシュ角膜細胞のexplan培養を確立することです。これは、麻酔をかけた成体のゼブラフィッシュから最初に上皮組織が付着した鱗を取り除くことによって達成されます。組織を付着させた鱗片を培養皿に入れ、細胞を接着させます。

次に、実験デザインで示された処理とともに培地を添加します。最後に、細胞をインキュベートし、ビデオ顕微鏡で所望の時間観察します。最終的には、さまざまなアッセイを使用して、遊走や細胞形態の変化、およびタンパク質やその他のマーカーの経時的な発現を実証できます。

この手法は、形質転換細胞培養法のような既存の方法と比較した場合の主な利点は、外植片培養が一次培養であり、in vivoで細胞の特性に密接に再構築されることです。この方法は、集団移動や上皮から間葉への移行の役割など、上皮創傷治癒分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。一般に、この方法に不慣れな個体は、鱗が成長面に付着しないか、特定の培養皿で成長しない可能性があるため、苦労します。

この手順を実演するのは、私の研究室の上級研究員であるJose Rap PanIN医学生のChana TIとAgnes Pasqualeです。この実験の準備として、市販の脱塩素剤を使用するか、水を24時間放置して約1.5リットルの水道水を脱塩素処理し、その後500ミリリットルを使用して3つの1リットルのビーカーをそれぞれ満たします。1つのビーカーにラベルを付けて、手順の前に魚を保持するためにラベルを付け、2番目のビーカーにラベルを付けます。

トリカ1ミリリットルあたり100マイクログラムを追加します。魚を麻酔するために、浅いトレイに氷を入れます。培地を室温まで温め、きれいな宝石商のピンセットを集めます。

ピンセットの先端を70%エタノールに浸し、ブンゼンバーナーに通してエタノールを燃焼させて清掃します。必要な数の魚を捕まえ、保持ビーカーに入れます。1匹の魚を麻酔ビーカーに移します。

テキストプロトコルに従って魚に麻酔をかけた後、氷に移し、尻尾をピンセットを持っている手に向けて水平に置きます。鱗を取り除くには、ピンセットを魚と平行に配置します。先端をスケールの端に付けた状態で、ピンセットの平らな面を魚の側面に少し押し込み、スケールが魚の体から浮き上がります。

ピンセットを使ってスケールをつかみ、それを摘み取り、ひっくり返さずに組織培養皿に入れます。この手順を繰り返し、大きな成体から最大12個の鱗を取り除き、鰓部、側線、およびひれを避けます。魚を回復ビーカーに入れ、麻酔の影響から回復することを確認するために監視します。

次に、魚を個々のタンクに移し、魚を21日間回復させて、完全なスケール再生を可能にします。実験にもよりますが、プラスチック1枚につき最大20個のはかりを配置します。35ミリメートルの組織培養処理皿、またはガラスあたり4〜6スケール。

下の皿は、スケールが皿に付着するのを待ってから、各培養皿に1.2ミリリットルの完全な培地を穏やかに加えます。X explan培養物を28°Cで所望の期間インキュベートし、処理の有無にかかわらず顕微鏡検査を実施します。細胞シートが入ったディッシュをインキュベーターから取り出した後、顕微鏡ステージにセットします。

4 倍の対物レンズを使用して、時間をかけて画像の撮影を容易にするために最初に焦点を合わせます。各セルシートの位置やステージ上のディッシュの向きをマークします。実験プロトコルに従って、さまざまな時点で細胞シートを撮影し、インキュベーターに戻す実験に静止画像のみが必要な場合は、セルシートを撮影します。

免疫蛍光顕微鏡用のサンプルを固定するには、室温で溶液を調製し、予温します。蛍光下でOSEサイトを表示するには、このビデオで前述したように、ガラス底の35ミリメートルディッシュ培養皿を使用してナスを育て、培地を取り出さずに、1.1 XPBS中の0.8ミリリットルの4%パラアルデヒドを各皿に加えます。室温で5分間インキュベートします。

次に、解決策を吸引します。各皿にさらに0.8ミリリットルの固定剤を加え、2回目の5分間のインキュベーション後、溶液を吸引します。外部リガンドまたはエピトープを使用しない限り、1つのXPBSインキュベートに0.5ミリリットルの0.2%TRITTON X 100を5分間インキュベートして細胞を透過します。

溶液を抜く前に、1つのXPBSに0.5ミリリットルの1%BSAを加え、インキュベーション後1時間または摂氏4度で一晩室温でインキュベートし、溶液を吸引して抗体染色を進めます。あるいは、1つのXPBSに1〜2ミリリットルの1%BSAを加え、摂氏4度で3〜4週間保存します。免疫蛍光染色を行います。

ここに示すテキストプロトコルによれば、角膜細胞のシートは、EXPLAN培養を確立してから数時間以内にスケールの下から移動するのを観察できます。時折、集合的に移動するシートから分離した個々に移動するケラチノサイトが観察されることがあります。シートの進行の初期速度は非常に速いですが、この速度は、培養の最初の48時間で細胞が広がると急速に遅くなります。

蛍光EDUで24時間標識した後、約10%の細胞が形質転換細胞株で見られるよりもはるかに低い速度で細胞分裂の証拠を示しているため、急激な増加は細胞増殖とは関連していません。X explanが確立されたときに処理を追加すると、一部の化合物は集団細胞移動を変化させます。例えば、ここに示すように、一部のMMP阻害剤は24時間後に細胞シート面積を減少させます。

培養において、可溶性RGD含有ペプチドを培養培地に添加して接着形成を阻害すると、シートの前縁のラメリーは急速に収縮し、続いてシートの前縁は剥離して収縮し、シート内またはリットルおよびフォロワー細胞内のタンパク質の局在を評価するために2分未満で、 この図のようにシート全体を固定して染色することができます。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば10〜15分で完了します。この手順を試行する際は、この手順に従って、細胞が培養皿に付着する時間を確保した後にのみ、予温培地を追加することを忘れないでください。

QPCRのような他の方法は、時間や治療条件に関連する遺伝子発現の変化など、追加の質問に答えるために実行できます。この手順を見た後、さまざまな手順で使用するための IDE explan カルチャを確立する方法について、はるかに理解できるはずです。