神経疾患の研究のための生成および使用方法hiPSC派生のNPCへのガイド

この手順の全体的な目的は、神経疾患に寄与する細胞および分子メカニズムを研究するためのプラットフォームとして、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）から神経前駆細胞（NPCs）を生成することです。これはまず、dual Smad阻害剤を用いてhiPSCsを神経ロゼットへと分化させることで達成されます。次のステップでは、これらの神経ロゼットを回収し、増殖可能なNPC集団へと成長させます。

次に、スピン感染法を用いてレンチウイルス導入を行います。遺伝子発現を操作するために、効率を向上させるステップが用いられます。最終ステップでは、NPCを浮遊培養し、自発的にニューロスフェアを形成させます。

最終的に、このプラットフォームはさまざまな細胞表現型の解析に使用できます。例えば、遺伝子操作が神経細胞の遊走に及ぼす影響の測定などが挙げられます。このように、本手法は遊走などの細胞メカニズムに関する知見を提供することが可能です。

また、複製、酸化ストレス、アポトーシス、神経突起伸展などの他の生物学的プロセスの研究にも適用できます。ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）または高多能性幹細胞（PSC）の分化により、視覚的に確認可能な神経ロゼットが形成されます。神経ロゼットは、頂端-基底極性を持つ神経上皮細胞の円形クラスターとして特徴付けられ、14日目に酵素的に選択されます。接着した胚様体（eb）から培地を吸引し、6ウェルプレートの1ウェルあたり1 mLの神経ロゼット選択試薬を加え、37 °Cで1時間インキュベートします。

1時間後、P 1000ピペットマンを用いて各ウェルから酵素を穏やかに除去し、1ウェルあたり1 mLのD-M-E-M-F 12を加えます。ロゼットを洗浄するため、1 mLのD-M-E-M-F 12を回収し、すぐにウェルに戻して噴出させることで、プレートからロゼットを剥離させます。

ロゼットをファルコンチューブに回収します。さらに1 mLのD-M-E-M-F 12をピペットで採取し、同じウェルに素早く分注して、残りのロゼットを剥離させます。トリプシン処理は行わず、ロゼットの凝集塊を壊さないように注意してください。回収したニューラルロゼットを同じファルコンチューブに入れます。

すべての神経ロゼットを回収してもロゼットが容易に剥離しない場合は、さらに酵素を追加してこの手順を繰り返します。Falconチューブを300 Gで3分間遠心分離します。洗浄液を吸引し、再懸濁します。

ロゼットを2 mLの神経前駆細胞培地に懸濁させます。細胞をポリ-L-オルニチンおよびラミネートでコーティングした6ウェルプレートに移し、37 °Cで1週間培養します。当研究室では、神経前駆細胞（NPC）をMatrigelプレート上で培養し、2日ごとに培地を交換して非常に高い密度で維持しています。

NPCを分散させるには、まず培地を吸引し、次に6ウェルプレートの各ウェルに、温めたaccutaneを1 mLずつ加え、37 °Cで10〜15分間インキュベートします。剥離した細胞を、可能な限り機械的ストレスをかけないように、D-M-E-M-F 12を含む15 mLチューブに静かに移します。酵素処理中に細胞をトリチュレーションしないでください。1000 Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。遠心分離後、上清を吸引し、NPCを再懸濁します。

6ウェルプレートの元のウェルあたり約1 mLのNPC培地を用い、再懸濁と細胞計数後、コンフルエントな6ウェルプレートのウェルあたり500万から1,000万個の細胞が見込まれます。NPCを維持するために、6ウェルプレートのウェルあたり約100万から200万個の細胞でNPCプレートを継代します。ニューロスフィア形成の効率は実験や細胞株によって異なりますが、通常、非接着性の6ウェルプレートのウェルあたり20万から100万個の細胞を播種した場合に最適となります。凝集が発生する場合は、播種する細胞数を減らしてください。理想的には、細胞分割後1〜2日以内に実施します。

トランスフェクション効率を高めるため、NP NPCsにレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを導入する必要があります。スピン感染法を用いてください。各ウェルから培地を吸引し、目的の感染多重度（MOI）に希釈してタイター調整した、適切な過剰発現用またはコントロール用のレンチウイルスまたはレトロウイルスに交換します。

NPC培地を使用し、6ウェルプレートの1ウェルあたり1.5 millilitersを用います。プレート遠心機を用いて、1000 G、室温で1時間遠心分離します。遠心後、細胞死を軽減するため、プレートをインキュベーターに戻します。遠心感染から8時間以内に培地を交換してください。

まず、NPC由来のNEUROSPHERESをNPC培地で1回洗浄し、細胞残渣を除去します。プレートを45度の角度に傾けてニューロスフィアを沈殿させた後、ニューロスフィアを吸引しないように注意しながら、できるだけ多くの培地を取り除きます。その後、新鮮な培地に交換します。

次に、P 200 ピペットを用い、顕微鏡下で NPC 由来の NEUROSPHERES を手作業でピックアップし、Matrigel コーティング済みの 96 ウェルプレートの各ウェルに 1 つずつ移します。結果のばらつきを抑えるため、同程度のサイズの neurospheres を選択することが重要です。各 96 ウェルプレートの neurospheres に、冷えた NPC 培地で希釈した Matrigel 0.5 milligrams をさらに添加します。

ピペットチップを用いて、個々のニューロスフィアをウェルの中心に手動で配置します。その後、ニューロスフィアの遊走を48時間行わせます。所望の免疫組織化学マーカーで細胞を固定および染色した後、4xの顕微鏡対物レンズを用いてニューロスフィア全体を撮影します。放射状遊走の測定には、ImageJソフトウェアを使用してください。

フリーハンド選択ツールを使用して、最も遠くまで遊走した細胞の縁を手動でトレースします。「Analyze」タブにある「set measurements」ウィンドウで、「area」にチェックが入っていることを確認してください。その後、「measure」機能を使用して、得られた形状の面積を算出します。

面積の測定値と円の面積の公式を用いて、同様に外径を決定し、元のニューロスフェアの縁をトレースします。面積を測定し、内径を算出します。外径と内径の差として、総放射状移動量を算出します。

これらの画像は、高分化能PSCから胚様体、神経ロゼット、NPC、そして神経細胞へと至る高分化能PSCの神経分化の段階を示しています。検証の結果、NPCの大部分の細胞で、NPCマーカーであるnestinおよび神経幹細胞転写因子SOX2の発現が確認されました。また、すべてのNPC集団においてβ3-tubulinの染色が見られます。さらに、NPCは神経幹細胞転写因子PAX6および前脳前駆細胞マーカーを発現しています。

TBR2は発現しているが、LMX1AやFOXA2などの中脳マーカーを発現していない高品質なPSC由来NPCは、緑色で示されるβ3-tubulin陽性ニューロンへ70〜80%、赤色で示されるglial fibrillary acidic protein陽性アストロサイトへ20〜30%分化できる。高品質なNPCのほとんどの細胞ではnestinとSOX2が発現しているが、低品質なNPCではSOX2陰性およびnestin陰性の細胞が斑状に存在するのみである。高品質なNPCから分化した4週齢のニューロンは、MAP2ABおよびβ3-tubulinを発現している。

高タイターのレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを用いて導入に成功すると、細胞の80%以上が蛍光レポーターで標識されます。ベクターに組み込まれたニューロスフィア形成能により、サイズが比較的均一なニューロスフィア集団が得られ、これらは培養状態で約1週間生存し続けることができます。

定期的にな餌やりを行うことで、マトリゲル中での48時間の移行前後のこれらの明視野像に示されるように、健康なニューロスフェアではニューロスフェアの移行が堅牢に起こります。この手法は、統合失調症分野の研究者が、ヒトiPS細胞由来のNPCにおけるニューロン移行を探索する道を開きました。レトロウイルスを用いた操作は潜在的に危険である可能性があるため、ウイルスが存在する可能性のあるすべての組織培養作業は、BSL-2+条件下で行う必要があることに留意してください。