Name: 神経疾患の研究のための生成および使用方法hiPSC派生のNPCへのガイド (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶ、hiPSCから神経前駆細胞（NPC）を分化させる方法。デュアルSMAD阻害剤を用いた神経ロゼット形成と、レンチウイルス導入による遺伝子操作、神経球懸浮培養の技術を解説。神経疾患の細胞・分子メカニズム研究に活用可能です。

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Kristen Brennandは、ニューヨーク幹細胞財団のロバートソン調査員です。ブレナンド研究所は、Brain and Behavior Young Investigator Grant、National Institute of Health(NIH)の助成金R01 MH101454、およびNew York Stem Cell Foundationの支援を受けています。

1. hiPSC分化神経前駆細胞へ<ol><li>大（ただし、サブコンフルエント）のコロニーが胚様体（EB）中間体を介して神経分化のための準備ができるまで、マウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー層上で共培養（HES）メディア（ 表1）ヒト胚性幹細胞でhiPSCsを成長と拡大（ 図2）。ルーチンhiPSC培養条件は、他の場所16,17に記載されている。簡単に言うと、コラゲナーゼ（DMEM中に1mg / ml）で酵素的に通過その後、コンフルエントになるまでMEFフィーダー層上HES培地でhiPSCsを成長させ、約1拡大：7日ごとに3。 </li><li>ポリ-L-オルニチン/ラミニンを調製するためにプラスチック表面（ガラス面50グラム/ ml）のための滅菌水を10g / mlのポリ-L-オルニチンを有するプレート、被覆プレートをコーティングし、3-24時間、室温でインキュベートする。滅菌水で少なくとも一度洗った後、3-24時間、室温で滅菌PBSで5グラム/ mlのラミニンでコート。 注：プラスチックに包まれている場合、プレートが可能6ヶ月まで-20ºCのために保存。 </li><li> 1日目に、酵素的にDMEM / F12中に1mg / mlコラゲナーゼIVを使用して、プレートのような大きなコロニーから（例えば、マトリゲル上のTeSR 18として定義された培地中で成長、一般MEF上で成長し、またはhiPSCs）サブコンhiPSCsを持ち上げる。 注：37ºCでのインキュベーションの1-2時間後、コロニーが皿にフローティングされます。 </li><li>穏やかに2ミリリットル/ウェルのN2 / B27培地（ 表1）および非接着性6ウェルディッシュに移し（中に再懸濁1に3ウェルを組み合わせ、DMEM / F12に（遠心分離ではなく、沈降によって）1-2xをhiPSCコロニーを洗う型ウェル）19。 注：一晩、コロニーは「胚様体」（EBS）と呼ばれるフローティング球状のクラスターを形成することになる。かなりの細胞死を期待。 </li><li> 2日目に、プレートを傾けてEBを沈降させる。慎重にメディアを削除し、破片を除去するDMEM / F12で一回洗浄します。デュアルSMAD阻害剤（0.1M LDN193189と10M SB431542）12を補足したN2 / B27メディアにフィード</SUP&gt;。 </li><li>日3-7日、神経誘導は、デュアルSMAD阻害のコンテキストで発生します。 EBをラウンドしかし、嚢胞性ではないことを確認してください。 EBを0.1M LDN193189と10M SB431542を補足したN2 / B27メディアと一日おきにフィード。 </li><li>日7月14日、ポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングしたプレートにEBのメッ​​キに続いて、上の神経ロゼットは（apico-基底極性の神経上皮細胞のラウンドクラ​​スタとして特徴づけ、数日以内に出現し始めることを明視野顕微鏡を用いて確認してください。 図1）。 0.1M LDN193189、10M SB431542および1グラム/ mlのラミニンを補足したN2 / B27培地で一日おきに付着したEBを供給し続けます。 </li></ol>神経ロゼットの2収穫注：我々は、神経ロゼットが酵素的に神経ロゼットセレクション試薬20または類似の選択試薬を用いて回収することをお勧めします。神経ロゼットは、Th1、6ウェルポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングされたプレートに手動でピックアップすることができますがの方法は、さらに、NPCのために豊かにし、非神経細胞型を枯渇させるために、20日目でのピッキングの第二ラウンドを必要とすることが、ユーザのスキルに依存して、マスタに広範囲の訓練をとり、。 <ol><li> 14日目の神経ロゼットの酵素的選択のために、付着したEBから吸引メディアと6ウェルプレート用のウェルあたりの神経ロゼット選択試薬の1ミリリットルを追加します。 1時間37ºCでインキュベートする。 </li><li> P1000のピペットマンを使用すると、静かに各ウェルから酵素を除去。洗浄するためにウェルあたりDMEM / F12の1ミリリットルを追加します。 </li><li> P1000では、DMEM / F12の1ミリリットルを収集し、すぐにこのようにプレートからロゼットを取り外し、バックウェルにDMEM / F12を追放。ファルコンチューブにロゼットを収集します。 </li><li>ピペットDMEM / F12とすぐに別の1ミリリットルが残りロゼットを切り離すために、同じウェルに放出する。 （粉末化しないでください。ロゼット凝集体を分割しないようにしてください）​​。同じファルコンチューブに神経ロゼットを収集します。 </li><li>手順を繰り返し、必要に応じて2.4。ロゼットは、容易に切り離すていない場合は、MOを追加酵素を再し、プロセスを繰り返す（2.1〜2.4ステップ） </li><li> 3分間300×gで細胞をスピン。吸引しNPC培地（ 表1）2ml中の洗浄、および再懸濁ロゼット。転送細胞（1：1）、ポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングした6ウェルプレートに。 </li><li>日15-21からは、神経ロゼットが展開されます。 NPCメディアに一日おきにロゼットを養う。 </li><li>神経ロゼットの品質を評価し、平らな線維芽細胞様細胞が培養中で拡大されていないことを確認してください。 注：非ロゼットが解決しない場合は、NPCの文化は時々のAccutaseに拾っロゼットの唯一の最高の選択、手動ピッキングによって救済することができます。 37ºCで15分間解離する。ペレットを、24ウェルのポリ-L-オルニチン/ラミニン被覆プレート上にNPC培地で洗浄し、プレート。 </li></ol>神経前駆細胞の3.拡張注：hiPSC NPCはマトリゲルまたはポリ-L-オルニチン/ラミニンでコーティングしたプレートのいずれかで成長させることができる。当社は通常Matrigeを使用リットルプレートそれらはより迅速かつ低コストで製造することができる。 <ol><li>すぐに、マトリゲルでコーティングされたプレートを準備解凍し、24ミリリットルでマトリ1mgの凍結した一定分量を再懸濁冷たいDMEM / F12を、すぐに2つの6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルを配布する。 37ºCで少なくとも1時間インキュベートする。 NOTE：マトリゲルを洗浄しないだけ吸引する必要がある、使用直前に。 </li><li>一日おきのNPCを養う非常に高い密度で維持するか、またはそれらが自然発生的にニューロンに分化する。 より確立されたNPCは、通常、1分割されているが：：注としてまれに1回と隔週2：毎週4を、非常に低い通路NPCは1を分割することができる。 </li><li> 、スプリット最初の吸引メディアと6ウェルプレートのウェルあたり1ミリリットル暖かいのAccutase（1X）を追加する。 10〜15分間37ºCでインキュベートする。 </li><li>静かにできるだけ機械的ストレスを含むDMEM / F12を含む15ミリリットルチューブに剥離した細胞を移す。酵素にいる間の細胞を滴定しないでください。 spinniによるペレット細胞5分間千×gでngの。 </li><li>吸引し、6ウェルのオリジナルのウェルあたり〜1ミリリットルNPC培地中での洗浄、および再懸濁のNPC。 注：6ウェルディッシュのコンフルエントよく5-10万個の細胞を有することを期待する。これは、従来の再メッキ血球計数器を用いて細胞10μlのアリコートを計数することによって確認することができる。 </li><li> NPCは、ニューロンまたはニューロスフェアとして再懸濁、再プレートのNPCに続いて。 NPCは、6ウェルプレートのウェル当たりプレート約100万〜200万細胞を維持するために。ニューロスフェア形成の効率は、実験および細胞株の間で変動するが、200,000から1,000,000細胞を非接着性6ウェルプレートのウェルに播種された場合、一般的に最高の​​発生ができる。ニューロスフェアの凝集が発生した場合、播種した細胞の数を減少させる。ニューロン培地でNPC培地を交換し、6ウェルプレートのウェルあたりのニューロンに分化する、プレート約200,000細胞。 </li><li>免疫組織化学的にすべての確立されたNPCラインを検証する。十分な細胞物質はEXPANれていたらネスチンおよびSOX2のための抗体とDED、ラベルのNPC。検証済みNPCラインも4〜6週間ニューロンに分化し、およびIIIチューブリンとMAP2ABための抗体で標識されるべきである。 <ol><li> 10分間4℃でPBS中の4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。 PBS中1.0％トリトンで室温で15分間のNPCを透過性にし、次いで室温で30分間0.1％トリトン5％ロバ血清でブロックする。 </li><li> 4℃で一晩、0.1％トリトン5％ロバ血清中で一次抗体と共にインキュベートする。 注：私たちは、以下の抗体を推奨：ヤギ抗Sox2の、1：200。マウス抗ヒトネスチン、1：200。ウサギ抗βIIIチューブリン、1：500。マウス抗βIIIチューブリン、1：500。マウス抗MAP2AB、1：200。 （ 図2）。 </li><li> RTで1〜2時間、0.1％トリトンで5％ロバ血清中で、300：PBSで洗浄した後、1でヤギ、マウスまたはウサギへの適切な結合二次抗体と二次抗体の細胞を培養する。を0.5μg/ mlのDAPI（4 &#39;、核染色細胞を可視化、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）、次いで、封入剤でマウントする。 </li></ol></li></ol> 4. NPC伝達<ol><li>トランスフェクトされた細胞21の割合を増加させるためにspinfection（1時間、1,000×gでのウイルスの存在下での細胞培養プレートの遠心分離）を使用する。 NPC培地で希釈感染の所望の多重度（MOI）の力価を測定培地を吸引し、関連する過剰発現（または制御）と交換してレンチウイルス（またはレトロウイルス）、（通常は1-10）、。 1.5ミリリットルを6ウェルプレートのウェル当たりの体積（または組織培養プレートの他のタイプの適切にスケーリングされたボリューム）を使用する。千×gでスピンとプレート遠心機で1時間37ºC。 注：理想的には、分割の1〜2日以内に、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターでのNPCを伝達する。商用または実験室で準備されたウイルスを使用しているかどうか、それが適切に連続希釈によって事前にウイルスのバッチを滴定するために役立ちます。 （ 図3）。 </li><li>セル画を低減するために、lular死、spinfectionの8時間以内にメディアを交換。 注：ウイルス統合および導入遺伝子の発現は、レポーター遺伝子蛍光によって24時間以内に検出可能であるべきである。 （ウイルスは蛍光レポーターを欠いている場合、これは評価するのがより困難であり、成功したトランスフェクションは最高の過剰発現製品のイムノブロット、免疫組織化学または定量PCRによって検証することができます。）全式は3〜7日かかる場合があります。追加のウイルスによる反復spinfectionsは、トランスフェクトされた細胞の割合を増加させるために必要とされ得る。再発spinfectionsは、毎日発生する可能性がありますが、そう頻繁である必要はありません。理想的には、蛍光レポーターを使用している場合、&gt; 80％の細胞が標識されるべきである。 </li></ol> 5.ニューロスフェア遊走アッセイ注：NPCの酵素的解離以下自発的にニューロスフェアの形、 - 細胞はNPC培地中の懸濁液中で培養される場合、（NPC拡張に使用されるものと同一の方法によっては3.3-3.6ステップ）。 <ol><li>簡単に言えば、解離する成長ニューロスフェアを生成するために非接着性のプレートで48時間NPC培地中のdのNPC。 （ 図4）。 </li><li>神経球の移行の場合は、96ウェルプレートに、むしろDMEMなく、ピッキングロスフェアの前に1〜2時間を冷たいNPCメディアを使用して新鮮なマトリプレートを準備します。井戸からマトリゲルを吸引しないでください。 </li><li>もともと胚性幹細胞由来のニューロスフェア22について公表したように、手動で細胞破片を除去するためにNPCのメディアで一度洗浄した後、顕微鏡下でNPC由来のニューロスフェアを選ぶ。マトリゲルコーティングした96ウェルプレートの各ウェルに一つのニューロスフェアを転送する。 </li><li>各96ウェルプレートにロスフェアに、冷たいNPC培地で希釈さらに0.5 mgのマトリゲルを追加します。 </li><li>手動でもピペットチップを使用しての途中で、個々の神経球をセンタリング。 注：これは、結果のばらつきを低減するために、同様のサイズのニューロスフェアを選択することが重要である。 </li><li>移行が48時間に発生した後、ワット細胞を固定することを許可する目的の免疫組織化学的マーカーを有するi番目の4％パラホルムアルデヒドと汚れ。 </li><li>半径方向の移行は、それらが完全に4倍の顕微鏡対物レンズを使用して、写真のニューロスフェアを決定しようとする場合。ウェルのエッジまたは分析からの第神経球を接触させ、任意の神経球を除外します。 注：マイグレーションがより長い48時間発生した場合は、結果の放射状の移行は可能性が4倍対物レンズを用いた画像に大きすぎることになる。 </li><li> NIH ImageJソフトウェア（ 図5）を使用して、各神経球からの平均の移行を測定します。これは、以下に記載の分析方法のいずれかを使用して行うことができる。 <ol><li>ラジアル移行： <ol><li>手動で結果として得られる形状の面積を計算するために測定します（Ctrl + M）関数を使用するフリーハンド選択ツールを使用して最も遠い移動細胞のエッジをトレース。面積を測定する前にエリアは[分析 ]タブの下に設定し測定ウィンドウにチェックされていることを確認してください。使用してください面積測定、円（A =πR2）の面積についての式の値は、半径（外側）を決定する。 </li><li>オリジナルのニューロスフェアのエッジをトレース、面積を測定し、同じように半径（内側）を計算します。外側と内側の半径との差である総放射状の移行を計算します。 </li></ol></li><li>最大の細胞移動： <ol><li>測定します（Ctrl + M）関数に続く直線選択ツールを使用して内側の神経球の端から5遠いセルの移動距離を測定します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

我々は、NPCのにhiPSCsを区別することによりメソッド、hiPSC由来の神経細胞の遺伝子特性のかなりの部分が保存された神経細胞の種類を記載しており、それは、潜在的に疾患の病因8に貢献発達経路のためのプロキシとして機能することができる11。私たちは詳細なてきたようにさらに、NPCは確実に複製し、簡単に私たちが病気の素因の分子および生化学的研究のために適切であり得ると信じて神経細胞集団を、形質導入されている。 我々は、前脳、パターン化されたNPCを区別し、培養する方法を詳述してきたが、それらは容易に他の細胞運命にパターニングのNPCを生成するように適合させることができる。フローティングEBを最初に0.5mg / mLのDKK1、10mMのSB431542、0.5 mg / mlのノギン及び1mMのシクロパミンで処理する場合は、海馬のNPCはNPC培地中で拡大し、20 ngのを補充し、ニューロン培地中で分化させることができるが生成される/ mlのWNT3A 7 </suP&gt;。代わりに、100...

我々 1ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSCs）からインビトロで分化したニューロンおよびその他2,3の遺伝子発現研究は、hiPSCニューロンは、胎児ではなく、成人の脳組織に似ていることを示している。現在では、hiPSCベースのモデルではなく後期の特徴、神経疾患より、素因の研究のため、より適切な場合があります。我々は以前のNPCは、統合失調症1に貢献する分子経路を研究するために有用な細胞型であり得ることを示している、統合失調症hiPSC由来の神経細胞の遺伝子特性のかなりの部分が、統合失調症のhiPSC由来神経前駆細胞（NPCの）に保存されていることを報告している。我々は、他の統合失調症hiPSCのNPC 1,4-6における酸化ストレスおよび活性酸素種、サブスレッショルド環境ストレスに対する感受性およびミトコンドリア機能障害の増加、ならびにニューロンcと減少し、異常な移行が報告されているonnectivityと統合失調症のhiPSCニューロン5,7-10におけるシナプス機能。統合失調症hiPSC NPCの中で異常な移動及び/または酸化ストレスに貢献する分子の要因も統合失調症hiPSC由来の神経細胞における減少し、ニューロンの接続性の根底にある場合は、NPCが疾患の原因のメカニズムを研究するために、堅牢性の高い複製神経細胞集団である可能性があります。一つは、急速に多数の細胞を生成することができるし、ニューロン成熟のために数週間または数ヶ月待つ必要がないので、さらに、NPCベースのアッセイは、より大きな患者コホートの研究に適しており、ハイスループットスクリーニングにより適している。我々はすでに統合失調症1およびハンチントン病11のように多様な疾患において実証されているようにhiPSCのNPCは、潜在的に疾患の病因に貢献発達経路のためのプロキシとして機能することができると信じている。 hiPSCs、の初期の神経からのNPCを区別するために生産は、デュアルSMAD阻害（0.1mMのLDN193189および10mMのSB431542）12によって達成される。これらの小分子とシグナリングBMPおよびTGF拮抗することにより、内胚葉および中胚葉の指定は、神経分化を促進し、めっきの一週間以内に目に見える神経ロゼットの形成をもたらす、遮断される。神経パターニングは、おそらく神経ロゼット形成の期間中とその直後に、早期にこのプロセスで発生します。他の手がかりがない場合には、これらの原始的な神経細胞は、前前脳のような運命13を想定しています。すぐにNPCの拡大を通じて、神経ロゼット形成以下、および継続的な、前脳NPCはFGF2 8,14と培養される。これらは、二重系統可能性を有し、70〜80％のIII-チューブリン陽性ニューロン及び20-30％グリア線維性酸性タンパク質（GFAP） -陽性星状細胞（ 図1）の神経集団に分化させることができる。前脳のhiPSCニューロンの大半はVGLUT1陽性であるニューロンの約30％が、GAD67陽性（GABA作動性）であるが、したがって、おそらくグルタミン酸である8。 NPCは日常的に一貫性の分化プロファイルを維持し、核型異常を蓄積することなく、一方、in vitroで 10回以上継代する。グループが40倍以上15のNPCを継代報告している、しかし、私たちは10継代を超えて、NPCには、アストロサイト分化に増加傾向を示していることがわかります。 NPCは、複数の凍結融雪、よく耐え単に非接着プレートで培養することにより、ニューロスフェアとして成長に移行することができます。 NPCは、効率的に生化学的研究のために十分な材料を得るために急速な遺伝的摂動の分子·細胞影響の評価、および容易に拡張を可能にする、ウイルスベクターによって形質導入されている。ウイルスベクターの過剰発現及び/又は疾患関連遺伝子のノックダウン堅牢許すのでさらに、コントロールまたは患者のいずれかでneur由来らの細胞は、1つは、これらの操作上の遺伝的バックグラウンドの効果を試験するために、このプラットフォームを使用することができる。成熟した神経細胞を必要とするシナプスまたは活動に基づくアッセイに適していないが、NPCは、患者由来の神経細胞の多くの単純な分子または生化学分析のための実用的な代替手段かもしれません。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#11330</td><td>HESメディア用</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#10565</td><td>ニューラルメディア</td></tr><tr><td>KO-Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>#10828</td><td>Needs to be lot testing</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>#35050</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#11140</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#17502-048</td><td>ロットテストが必要</td></tr><tr><td>B27-RA</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#12587-010</td><td>ロットテストが必要</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Life Technologies</td><td>#13256-029</td><td>PBS + 1% BSA</td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>#04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>#04-0010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>#450-02</td><td>PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>GDNF&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp;#450-10</td><td>PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>ジブチリル環状 AMP</td><td>Sigma</td> に再懸濁&<td>nbsp;#D0627</td><td>PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>Sigma</td> <td>#A0278</td><td>H20</td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent</td><td>Stemcell Technologies</td><td>&nbsp;#05832</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>InnovativeCell Technologies</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼIV</td><td>Life Technologies</td><td>#17104019</td><td></td></tr><tr><td>CF1 mEFs</td><td>Millipore</td> <td>#PMEF-CF</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, Natural Mouse 1 mg</td><td>Life Technologies</td><td>#23017-015</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD</td><td>#354230</td><td>10 mg / mlの冷DMEMで氷上に再懸濁し、2つの6ウェルプレート相当あたり1 mgを使用</td></tr><tr><td>組織培養処理された6ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>超低付着6ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗Sox2&nbsp;</td><td>サンタクルス</td><td>sc&shy;17320</td><td>1:200</td></tr><tr><td>マウス アンチヒューマン ネスティン</td><td>ミリポア</td><td>MAB5326</td><td>1:200</td></tr><tr><td>ウサギ アンチ -&β;III-チューブリン</td><td>コーヴァンス</td><td>PRB&shy;435P</td><td>は1:500マウス</td></tr><tr><td>アンチベータで使用します。III-チューブリン</td><td>コーヴァンス</td><td>MMS&shy;</td><td>1:500で</td>435P使用</tr><tr>1<td>:200</td>で<td>マウス反MAP2AB</td><td>シグマ</td><td>M1406</td>を使用</tr><tr><td>プレート遠心分離機</td>ベ<td>ックマンコールター</td><td>ベックマンコールターアレグラX-14(SX4750プレートキャリア付き)</td><td></td></tr></tbody></table>

神経疾患の研究のための生成および使用方法hipsc派生のnpcへのガイド

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

多くの疾患は症状が現れる前に長期間の疾患進行を含むため、疾患発生の根本的な原因を特定するのに理想的ではありません。患者や健常者から採取した線維芽細胞は、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)に効率的に再プログラムされ、その後、神経前駆細胞(NPC)やニューロンに分化してこれらの疾患の研究を行うことができるため、患者の症状発症前に発生した発生事象を再現することが可能になりました。私たちは、ヒトiPS細胞をNPCに効率的に分化させる方法を提示します。NPCは、機能的なニューロンへのさらなる分化が可能なだけでなく、頑健に継代、凍結融解、または移行してニューロスフェアとして成長することもでき、複製、遊走、酸化ストレス、アポトーシスなどの細胞表現型に影響を与える分子因子を特定するための迅速な遺伝子スクリーニングを可能にします。患者由来の hiPSC NPC は、遺伝子発現の操作による細胞または分子の影響の経験的試験に最適な独自のプラットフォームです。

ニューラルロゼットapico -基底極性の神経上皮細胞のラウンドのクラスターとしての特徴的な外観（ 図1）により、明視野顕微鏡を用いて、形態学的に同定することができる。 NPCは、非常に高い細胞密度で典型的に培養されても、すぐに継代の後、わずかに錐体状の細胞体と双極神経構造が見える（ 図1D）である。 IIIチューブリン染色はNPCの一部の割合が絶えず文化（ 図1F）内の神経分化を開始していることを示す、すべてのNPC集団においても見えるけれども検証済みのNPCは、細胞の大部分でネスチン及びSOX2を発現する。そのようなLmx1aのとFOXA2として中脳マーカーが（ 図1G-I）ではないが、このようなSOX2とPAX6、及びそのようなTBR2などの前脳の神経前駆細胞、などの神経幹細胞のマーカーは、また、NPCの中で表現されている。大規模フラット線維芽細胞様細胞のかなりの割合以内<html> NPC集団は、神経分化（ 図2）は、以下の多数のニューロンを生じる可能性が低いも...

このプロトコルは、神経前駆細胞がヒト人工多能性幹細胞からどのように分化できるかを説明しています。これにより、多くの神経障害における疾患の病因に寄与する発生経路を特定するために使用できる、堅牢で複製的な神経細胞集団を生成することができます。

神経疾患の研究のための生成および使用方法hiPSC派生のNPCへのガイド

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

この手順の全体的な目的は、神経疾患に寄与する細胞および分子メカニズムを研究するためのプラットフォームとして、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）から神経前駆細胞（NPCs）を生成することです。これはまず、dual Smad阻害剤を用いてhiPSCsを神経ロゼットへと分化させることで達成されます。次のステップでは、これらの神経ロゼットを回収し、増殖可能なNPC集団へと成長させます。次に、スピン感染法を用いてレンチウイルス導入を行います。遺伝子発現を操作するために、効率を向上させるステップが用いられます。最終ステップでは、NPCを浮遊培養し、自発的にニューロスフェアを形成させます。最終的に、このプラットフォームはさまざまな細胞表現型の解析に使用できます。例えば、遺伝子操作が神経細胞の遊走に及ぼす影響の測定などが挙げられます。このように、本手法は遊走などの細胞メカニズムに関する知見を提供することが可能です。また、複製、酸化ストレス、アポトーシス、神経突起伸展などの他の生物学的プロセスの研究にも適用できます。ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）または高多能性幹細胞（PSC）の分化により、視覚的に確認可能な神経ロゼットが形成されます。神経ロゼットは、頂端-基底極性を持つ神経上皮細胞の円形クラスターとして特徴付けられ、14日目に酵素的に選択されます。接着した胚様体（eb）から培地を吸引し、6ウェルプレートの1ウェルあたり1 mLの神経ロゼット選択試薬を加え、37 °Cで1時間インキュベートします。1時間後、P 1000ピペットマンを用いて各ウェルから酵素を穏やかに除去し、1ウェルあたり1 mLのD-M-E-M-F 12を加えます。ロゼットを洗浄するため、1 mLのD-M-E-M-F 12を回収し、すぐにウェルに戻して噴出させることで、プレートからロゼットを剥離させます。ロゼットをファルコンチューブに回収します。さらに1 mLのD-M-E-M-F 12をピペットで採取し、同じウェルに素早く分注して、残りのロゼットを剥離させます。トリプシン処理は行わず、ロゼットの凝集塊を壊さないように注意してください。回収したニューラルロゼットを同じファルコンチューブに入れます。すべての神経ロゼットを回収してもロゼットが容易に剥離しない場合は、さらに酵素を追加してこの手順を繰り返します。Falconチューブを300 Gで3分間遠心分離します。洗浄液を吸引し、再懸濁します。ロゼットを2 mLの神経前駆細胞培地に懸濁させます。細胞をポリ-L-オルニチンおよびラミネートでコーティングした6ウェルプレートに移し、37 °Cで1週間培養します。当研究室では、神経前駆細胞（NPC）をMatrigelプレート上で培養し、2日ごとに培地を交換して非常に高い密度で維持しています。NPCを分散させるには、まず培地を吸引し、次に6ウェルプレートの各ウェルに、温めたaccutaneを1 mLずつ加え、37 °Cで10〜15分間インキュベートします。剥離した細胞を、可能な限り機械的ストレスをかけないように、D-M-E-M-F 12を含む15 mLチューブに静かに移します。酵素処理中に細胞をトリチュレーションしないでください。1000 Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。遠心分離後、上清を吸引し、NPCを再懸濁します。6ウェルプレートの元のウェルあたり約1 mLのNPC培地を用い、再懸濁と細胞計数後、コンフルエントな6ウェルプレートのウェルあたり500万から1,000万個の細胞が見込まれます。NPCを維持するために、6ウェルプレートのウェルあたり約100万から200万個の細胞でNPCプレートを継代します。ニューロスフィア形成の効率は実験や細胞株によって異なりますが、通常、非接着性の6ウェルプレートのウェルあたり20万から100万個の細胞を播種した場合に最適となります。凝集が発生する場合は、播種する細胞数を減らしてください。理想的には、細胞分割後1〜2日以内に実施します。トランスフェクション効率を高めるため、NP NPCsにレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを導入する必要があります。スピン感染法を用いてください。各ウェルから培地を吸引し、目的の感染多重度（MOI）に希釈してタイター調整した、適切な過剰発現用またはコントロール用のレンチウイルスまたはレトロウイルスに交換します。NPC培地を使用し、6ウェルプレートの1ウェルあたり1.5 millilitersを用います。プレート遠心機を用いて、1000 G、室温で1時間遠心分離します。遠心後、細胞死を軽減するため、プレートをインキュベーターに戻します。遠心感染から8時間以内に培地を交換してください。まず、NPC由来のNEUROSPHERESをNPC培地で1回洗浄し、細胞残渣を除去します。プレートを45度の角度に傾けてニューロスフィアを沈殿させた後、ニューロスフィアを吸引しないように注意しながら、できるだけ多くの培地を取り除きます。その後、新鮮な培地に交換します。次に、P 200 ピペットを用い、顕微鏡下で NPC 由来の NEUROSPHERES を手作業でピックアップし、Matrigel コーティング済みの 96 ウェルプレートの各ウェルに 1 つずつ移します。結果のばらつきを抑えるため、同程度のサイズの neurospheres を選択することが重要です。各 96 ウェルプレートの neurospheres に、冷えた NPC 培地で希釈した Matrigel 0.5 milligrams をさらに添加します。ピペットチップを用いて、個々のニューロスフィアをウェルの中心に手動で配置します。その後、ニューロスフィアの遊走を48時間行わせます。所望の免疫組織化学マーカーで細胞を固定および染色した後、4xの顕微鏡対物レンズを用いてニューロスフィア全体を撮影します。放射状遊走の測定には、ImageJソフトウェアを使用してください。フリーハンド選択ツールを使用して、最も遠くまで遊走した細胞の縁を手動でトレースします。「Analyze」タブにある「set measurements」ウィンドウで、「area」にチェックが入っていることを確認してください。その後、「measure」機能を使用して、得られた形状の面積を算出します。面積の測定値と円の面積の公式を用いて、同様に外径を決定し、元のニューロスフェアの縁をトレースします。面積を測定し、内径を算出します。外径と内径の差として、総放射状移動量を算出します。これらの画像は、高分化能PSCから胚様体、神経ロゼット、NPC、そして神経細胞へと至る高分化能PSCの神経分化の段階を示しています。検証の結果、NPCの大部分の細胞で、NPCマーカーであるnestinおよび神経幹細胞転写因子SOX2の発現が確認されました。また、すべてのNPC集団においてβ3-tubulinの染色が見られます。さらに、NPCは神経幹細胞転写因子PAX6および前脳前駆細胞マーカーを発現しています。TBR2は発現しているが、LMX1AやFOXA2などの中脳マーカーを発現していない高品質なPSC由来NPCは、緑色で示されるβ3-tubulin陽性ニューロンへ70〜80%、赤色で示されるglial fibrillary acidic protein陽性アストロサイトへ20〜30%分化できる。高品質なNPCのほとんどの細胞ではnestinとSOX2が発現しているが、低品質なNPCではSOX2陰性およびnestin陰性の細胞が斑状に存在するのみである。高品質なNPCから分化した4週齢のニューロンは、MAP2ABおよびβ3-tubulinを発現している。高タイターのレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを用いて導入に成功すると、細胞の80%以上が蛍光レポーターで標識されます。ベクターに組み込まれたニューロスフィア形成能により、サイズが比較的均一なニューロスフィア集団が得られ、これらは培養状態で約1週間生存し続けることができます。定期的にな餌やりを行うことで、マトリゲル中での48時間の移行前後のこれらの明視野像に示されるように、健康なニューロスフェアではニューロスフェアの移行が堅牢に起こります。この手法は、統合失調症分野の研究者が、ヒトiPS細胞由来のNPCにおけるニューロン移行を探索する道を開きました。レトロウイルスを用いた操作は潜在的に危険である可能性があるため、ウイルスが存在する可能性のあるすべての組織培養作業は、BSL-2+条件下で行う必要があることに留意してください。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

我々はハイスループットな方法で、複数の細胞プロセスと構造を可視化し定量化するために高含有量の画像で自動化された細胞の培養を組み合わせる方法を説明します。このような方法は、ゲノムのさらなる機能アノテーションの助けだけでなく、病気の遺伝子ネットワークや潜在的な創薬ターゲットを識別することができます。...

神経変性疾患におけるハイコンテントスクリーニング

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NPC Neurosphere Assay:ニューロスフィアからの神経前駆細胞の遊走応答を評価するためのIn Vitroアッセイ

このビデオは、ニューロン、星状細胞、ミクログリアなどのラット海馬から細胞を分離するプロトコルを示しています。...

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増殖、移行、および神経突起伸長はしばしば脳神経疾患で摂動など発達のプロセスします。このように、迅速かつ再現性をもって人間の iPSC 由来の Npc でこれらの神経発達のプロセスを評価するためのプロトコルを提案する.これらのプロトコルには、NPC...

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本研究では、ヒトの神経オルガノイド内のヒト神経オルガノイド内のヒト神経膠芽腫の発達を研究するための関連的かつ正確なモデルとして、2つの特定のヒト神経オルガノイドを導出するプロトコルを紹介し、説明する。三次元オルガノイドを生成する分化。...

脳癌と神経変性疾患を研究するためのヒト神経オルガノイド

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神経前駆細胞由来ニューロンを用いた神経突起増殖アッセイと神経毒性評価

ヒト皮膚由来線維芽細胞を誘発ニューロン前駆細胞(iNIC)に再プログラムするプロトコルと、その後の誘導アストロサイト(iA)への分化について説明する。この方法は、iNPCとiAを大量に高速かつ再現可能に生成します。...

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我々は、新皮質発生の2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)ベースのモデルの生成および特性評価のための詳細なプロトコル、ならびに初代繊毛(PC)生合成および機能の定性的および定量的分析を可能にする補完的方法論を提示する。...

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

本プロトコルは、物理に基づく神経シミュレーションを用いて神経療法の電気生理学的バイオマーカーを解釈し、神経回路への影響を明らかにし、神経治療開発に基づいたメカニズム的アプローチを提供します。...

ヒト新皮質ニューロソルバーを用いて脳波電波に対する神経治療効果の神経メカニズムを明らかにするためのプロトコル

学ぶ、hiPSCから神経前駆細胞（NPC）を分化させる方法。デュアルSMAD阻害剤を用いた神経ロゼット形成と、レンチウイルス導入による遺伝子操作、神経球懸浮培養の技術を解説。神経疾患の細胞・分子メカニズム研究に活用可能です。

神経疾患の研究のための生成および使用方法hiPSC派生のNPCへのガイド

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