Name: 操作とインビトロ成熟アフリカツメガエル卵母細胞、胚発生を研究するために (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学ぶアフリカツメガエル卵母細胞の操作とインビトロ成熟法。アンチセンスオリゴやmRNA注入で母性タンパク質をノックダウンまたは過剰発現させ、胚発生への影響を観察します。遊泳オタマジャクシへの発達を評価指標とし、初期発生研究に有用です。

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私たちは、ガードン研究室のメンバーに感謝しています。K.M.はウォルフソン大学の研究員であり、ハーチェル・スミス博士研究員とグレートブリテン笹川財団の支援を受けています。ガードン研究所は、ウェルカムトラスト(RG69899)とMRCからJ.B.G.への助成金によって支えられています。

<ol><li>Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyamoto%2C+K+%22Biology+and+Pathology+of+the+Oocyte%3A+Role+in+Fertility%2C+Medicine%2C+and+Nuclear+Reprogramming%22">Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming</a>. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).</li>
<li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo%3A+a+novel+antisense+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).</li>
<li>Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+the+Spemann+organizer+transplantation+phenomenon+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos.</a> Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).</li>
<li>Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+requirement+for+HIRA-dependent+H3.3+deposition+revealed+at+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus.</a> Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Heasman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+cadherins+and+underexpression+of+beta-catenin+inhibit+dorsal+mesoderm+induction+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos.</a> Cell. 79 (5), 791-803 (1994).</li>
<li>Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+antisense+oligonucleotides+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes.</a> Methods. 51 (1), 75-81 (2010).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Wave1+is+required+for+reprogramming+transcription+in+oocytes+and+for+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development.</a> Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).</li>
<li>Halley-Stott, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+nuclear+transplantation+to+Germinal+Vesicle+stage+Xenopus+oocytes+-+a+method+for+quantitative+transcriptional+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming.</a> Methods. 51 (1), 56-65 (2010).</li>
<li>Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+characterizes+chromatin+presetting+by+NF1+and+Oct1+and+enhances+glucocorticoid+receptor+binding+to+the+MMTV+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter.</a> Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).</li>
<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).</li>
<li>Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+transgenesis+by+sperm+nuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection.</a> Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).</li>
<li>Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+%27autocatalytic%27+nature+of+the+maturation+promoting+factor+%28MPF%29+in+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis.</a> Cell. 4 (3), 269-274 (1975).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+oocyte+nucleus+in+physiological+maturation+in+Rana+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens.</a> Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).</li>
<li>Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+actin+polymerization+is+required+for+transcriptional+reprogramming+of+Oct4+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes.</a> Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).</li>
<li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+RNA%2FCas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

我々ここで詳細母体要因を枯渇させるか、受精前に外因性因子を過剰発現する新しい方法。このシステムは、2マイクロインジェクションが必要ですが、その代わりにホスト転送方式7,17で使用されるカエルの手術を、スキップします。それは動物のケアの面でカエル手術手順を削除することが最適である。また、私たちは実験の成功に影響を与える一つの生物学的要因を取り除くことができます。つまり、転送実験の​​ためのホストの女性カエルの品質のために考慮することがありません。したがって、このシステムでPMSGプライムカエルから得た卵母細胞の品質が成功した実験のための鍵である主要な生物学的な要因である。卵母細胞の質は、卵巣の採取後またはdefolliculation後に判定することができる。異常がこれらの段階で観察される場合は、新しいカエルから別の卵巣を収集するために最適である。あなたは卵母細胞の品質を確認することができますもう一つのポイントは、卵成熟の後である。プロゲステロンの80％未満の場合電子処理された卵母細胞の成熟の兆候を示しては、さらなる分析のための胚の十分な数を得ることができないかもしれない。代わりに手動defolliculationの酵素defolliculationの使用もdefolliculationに要する労力を軽減するために、このシステムを使用する別の利点である。しかし、それは手動defolliculationが酵素処理よりも良い発展を与えることがまだ可能である。 図3に示されるように、 インビトロ成熟卵母細胞のほぼ10％が水泳幼生段階に到達することができる。これらのデータは、8、新しい注入実験で報告されたものを含む13の独立した実験から収集される。ホスト転送方法は、転送された卵母細胞の30〜60％が神経胚の段階17に到達することができるので、意味のあるデータを得るための各処理に75-150卵母細胞を必要とする。私たちの方法は、通常、切断された胚の約40から60まで%が到達することができるので、各実験群の200〜300卵母細胞で始まる筋肉の応答段階。これらのデータは、両方の方法は、合理的な発育速度をサポートすることを示唆している。私たちは、これまでのところ、このアプローチは変態による開発をサポートしていることを示す、この技術を用いて制御するmRNAを注入したと制御、アンチセンスオリゴ注入した卵母細胞から10生きているカエルを取得しています。 私たちの卵母細胞操作-ICSI法がすぐに受精後、非常に初期の胚発生時に母体の因子の役割をテストする機会を提供します。また、受精前のクロマチン修飾因子の過剰発現により、開発に必要な母性クロマチンの状態を理解するための受精の前に母方のクロマチンを改造することがあります。これらがあっても受精前に表現することができるので、この戦略はまた、そのような転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）18,19およびCRISPR / CAS9 20,21として、現在の遺伝子編集システムでうまく動作する可能性があります。そのため、私たちの新しいアプローチがpotentiを持ってらは、将来的に多くの用途に使用される。

アフリカツメガエルは、開発1を研究するために広く使用され、強力なモデル生物である。 アフリカツメガエルの卵と豊富な（哺乳類のカウンターパートとの比較では約0.1ミリメートルであることに、約1.2〜1.4ミリメートル）異常 ​​に大きいためである。卵は（4,000-8,000細胞と段階8〜8.5で発生する、MBT）半ば胞胚遷移するまで、胚発生を駆動するのに十分である、母性を合成して記憶コンポーネントが含まれています。 MBTは、その後、さらなる開発を導く胚性遺伝子産物を産生する接合子ゲノム活性化を伴う。 開発のための重要な母性因子を同定することを目的とした多くの研究。多くの研究は、母体タンパク質の場合の劣化が腸胚段階2-4で観察することができる受精胚へのモルホリノオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）の注射に依存する。別の方法として、mRNAは受精し、EMに注入される遺伝子機能を邪魔したり、過剰に発現するタンパク質の運命を追跡するbryos。しかし、1細胞期胚への注入は通常、MBT前に非常に初期胚の段階で母親のタンパク質の発現レベルに影響を与えません。 Heasman氏とワイリーは、この問題5を克服するためにホスト転送方法を確立した。それらの方法では、手動で濾胞除去した卵母細胞は、アンチセンスオリゴを注射された宿主の雌6に移した。初期胚発生中のダウンレギュレートのタンパク質の役割を調べることができるように、タンパク質は、受精の前にダウンレギュレートされる。 7に総説として、この母体枯渇法は、母体タンパク質のいくつかのユニークな発達の役割が同定された。 本稿では、詳細受精前のmRNAの母親の枯渇や過剰発現が手動defolliculationとホスト転送せずに達成されている私たちの最近開発された方法、8。マニュアルdefolliculation、時間とホスト転送の多くは、多くの場合、このように母親の枯渇方法を頻繁に使用を妨げる、熟練した技術や動物の手術のため特定のライセンスを必要としますが必要です。 Defolliculationとホスト転送は、それぞれ、酵素defolliculation 9,10及び細胞質内精子注入（ICSI）11-13によって置換されている。卵へのICSIはもともとトランスジェニックカエル12を製造した。精子と胚の核はまた、インビトロ成熟両生類卵母細胞11,14,15に移植した。ここで、我々 は、in vitroに精子を注入するステップバイステップの方法は、アンチセンスオリゴまたはmRNAで予め注入された卵母細胞を成熟示す。

<table><tbody><tr><td>妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピン(PMSG)&nbsp;</td><td>MSD アニマルヘルス</td><td>Vm 01708/4309</td><td>PMSG-Intervet 5000iu 粉末および注入用溶液用溶剤</td></tr><tr><td>エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩 (MS222)</td> <td>シグマ</td><td>A5040</td><td>麻酔用</td></tr><tr><td>リベラーゼ TM 研究グレード</td><td>ロシュ</td><td>05 401 127 001</td><td>卵子の脱落用。-20&nbsp; で保存&#176;C.</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-205/206</td><td>マイクロインジェクション</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー用&nbsp;</td><td>アルファ研究所</td><td>7インチドラモンド #3-000-203-G/XL</td><td>マイクロインジェクション用</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー&nbsp;</td>マイクロ<td>インジェクション用</td> <td>SUTTER Instrument</td><td>Model D-97</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>in vitro成熟および ICSI</td></tr><tr><td>14 ml 超透明遠心チューブ用&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター United Kingdom Ltd</td><td>344060</td><td>精子精製用</td></tr><tr><td>OptiPrep 密度勾配培地 (ヨodixanol)</td> <td>Sigma</td><td>D1556</td><td>精子精製用</td></tr><tr><td>ジグトニン</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>細胞透過化試薬</td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>Hybaid&nbsp;</td><td>HB-SHK-1</td><td>卵子脱軟</td></tr>解<tr><td>剖顕微鏡(ステレオズーム顕微鏡)</td><td>ZEISS</td><td>Semi SV6</td><td>卵子採取・マイクロインジェクション用</td></tr><tr><td>50 &mu;mポアフィルター</td><td>CellTrics</td><td>04-0042-2317</td><td>精子精製用</td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>オプティマ L-100XP</td><td>精子精製用</td></tr><tr><td>50ml遠心チューブ</td><td>セルスター・グライナー バイオワン</td><td>227261または210261</td><td>卵子採取・脱卵反応</td></tr><tr><td>15ml遠心チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352097</td><td>精子精製用</td></tr><tr><td>90mmペトリお皿&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>101VR20/C</td><td></td></tr><tr><td>イージーグリップ細胞培養ディッシュ、60&nbsp;x&nbsp;15 mm</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Easy-Grip Cell Culture Dish, 35&nbsp;x&nbsp;15 mm</td><td>ファルコン</td><td>351008</td><td></td></tr></tbody></table>

操作と<em&gt;インビトロ</emの&gt;成熟<em&gt;アフリカツメガエル</em細胞質内精子注入し&gt;卵母細胞、胚発生を研究するために

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

両生類の卵は、胚発生の研究に広く使用されてきました。初期の胚発生は、卵形成中に蓄積された母性に蓄積された因子によって駆動されます。このような母性因子が初期胚発生に果たす役割を研究するためには、胚発生の初期からその機能を操作することが望まれます。従来の遺伝子干渉の方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチド(オリゴ)またはmRNAを受精卵に注入することで達成され、それぞれ特定のタンパク質の発現が減少または過剰に発現することが可能になります。しかし、これらの方法では、通常、タンパク質の発現が影響を受けるまでに数時間以上かかるため、遺伝子機能の干渉は初期胚期には効果がありません。ここでは、受精前に母体タンパク質の発現量を変化させることができる実験系を紹介します。卵巣から採取したXenopus laevis卵子は、酵素とインキュベートすることで脱卵します。アンチセンスオリゴまたはmRNAは、胚小胞(GV)の段階で脱乳卵母細胞に注入されます。これらの卵子は、中期II(MII)段階でin vitroで卵子まで成熟し、続いて細胞質内精子注入(ICSI)が行われます。このようにして、ICSI胚の最大10%が遊泳オタマジャクシ期に到達できるため、特定の遺伝子ノックダウンまたは過剰発現の機能テストが可能になります。このアプローチは、初期胚発生における母性に保存された因子の役割を研究するための有用な方法となり得ます。

体外成熟卵子に使用してICSI胚の胚発生は、（ 図3A）を検討した。 MII段階へのGV卵母細胞の成熟率が可変であり、大部分は、卵母細胞の品質に依存します。良い実験では、GV卵母細胞のほぼ100％が最終的にMII段階で卵になって、卵成熟のプロゲステロンとショー兆候に対応する。全て成熟卵母細胞は、ICSIに供したと注入された卵の約25％が切断された（ 図3A、N =制御のための13は、無オリゴ注入した卵母細胞のためのオリゴ注入した卵母細胞であり、n = 7スクランブル）。約60％または対照オリゴ注入した卵母細胞または非注射卵母細胞から産生される切断された胚の80％が、それぞれ、胞胚/原腸胚段階に達した。胞胚/原腸胚の82パーセントがnでは良い品質のものであったのに対し、胞胚/原腸胚の中では、オリゴ注入されたサンプル中の胚の約半分は、（異常な切断およびアポトーシスのほとんどない兆候）良い品質のものであったに注入された試料（ 図3A）。非注射サンプル中の60％と、切断された胚の29％が（ 図3A）でしたが最後に、オリゴ注入されたサンプル中の41％と、切断された胚の11％が、それぞれ、筋肉の応答、スイミングオタマジャクシの段階に達した。これらICSI胚は、正常および異常な胚（ 図3B）の混合物である。そのうちのいくつかは変態を受け、カエル8成熟した開発する。これらの結果は、IVMとICSI続いGVを卵母細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの注入は、効率的な初期胚発生を可能にすることを示唆している。アンチセンスオリゴの注入自体が胚発生を減少するが、我々はまだようにそのような発達速度をチェックするなど、多くの実験目的のために十分な胚、RT-PCR、ウェスタンブロットとを取得することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> イチジク<html> URE 1： アフリカツメガエルの典型的な例は、 体外成熟実験のために良い品質か悪い品質のツメガエル卵母細胞。 （A）悪い品質卵母細胞の例。例えば、斑状の色素沈着を示す卵母細胞は、その後の実験に使用されていない。各アフリカツメガエル卵母細胞は、直径が約1.2〜1.4ミリメートルであるツメガエル 。（B）部分的に濾胞除去卵母細胞。卵母細胞の右半分は、血管の存在によって識別され得る包細胞で覆われている。矢印は毛包細胞を含まず、注射針が注入されるに領域を示している。（C）等しいサイズであり、動物の脳半球および植物半球の間に明確なコントラストを均一着色された動物の半球を示す良質の卵母細胞の例。 2496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; 図2： アフリカツメガエルが成熟する前と後のツメガエル卵母細胞卵成熟後、透明な白い斑点が動物半球の最上部に表示され、包細胞を剥離されている。。各アフリカツメガエル卵母細胞の直径が約1mmであるツメガエル 。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> 図3： 体外成熟卵子でから生産ICSI胚の開発、。各ステージにICSI胚の（A）の開発が要約されている。卵母細胞は、対照を注射したIVMおよびICSI続くアンチセンスオリゴヌクレオチド（対照オリゴ注入）または注射なし（非注射）、スクランブル。各段階での胚の対応する数は、バーの上に示されている。 ±SEMを示していることを意味。 N = 4-13の独立した実験/異なるFemales。（B）ICSI胚の生存例。これら尾芽段階の胚は、約200卵母細胞を出発材料として使用された一つの実験で製造した。

私たちは、Xenopus laevisの未熟卵子の操作方法、卵子の卵子へのin vitro成熟、および細胞質内精子注入の方法について説明します。このプロトコルは、一部の母体タンパク質の分解と受精時の目的の遺伝子の過剰発現を可能にするため、初期胚発生における特定の因子の役割を研究するために価値があります。

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

本実験の目的は、卵母細胞に蓄積されている母性タンパク質をノックダウンさせること、あるいはカエルの卵の受精時点で目的のタンパク質を過剰発現させることです。これは、酵素的に脱膜処理した未熟卵母細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはmRNAを注入し、特定のタンパク質を分解または過剰発現させることで達成されます。第2ステップとして、卵母細胞をプロゲステロン含有培地に移し、卵母細胞から卵への成熟を誘導します。次に、ノックダウンまたは過剰発現が胚発生に及ぼす影響を観察するため、体外成熟卵に精子を注入します。最終的に、オリゴ注入した卵細胞が泳行可能なオタマジャクシまで発生することは、遺伝子のノックダウンまたは過剰発現における機能試験となります。ホストへの移殖などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、標準的なプロトコルを用いることで、カエルの手術工程を省略できる点にあります。MBSとpsを含む9cmのペトリ皿に、健全な細胞を含むSAC上の組織を回収します。次に、卵巣を1〜2cm幅の正方形に切り分けます。切り分けた卵巣と細胞を約5mL、新しい50mLチューブに回収します。次に、組織をMBS + PSで数回洗浄し、15 millilitersの新鮮なMBS + psに卵を回収します。ここで、懸濁液に7 unitsの除膜酵素を加え、少なくとも部分的に除膜されるまで、緩やかに撹拌しながら懸濁液をインキュベートします。インキュベーション後、少なくとも1時間かかります。反応を停止させるため、MBSにPsを添加した溶液をチューブに満たします。溶液は細胞に直接かからないよう、チューブの壁面に沿わせて注入してください。組織を沈殿させ、上清と試薬を廃棄します。小型で未熟な細胞は浮遊するため、これらも除去します。洗浄後、この洗浄ステップを計10回繰り返します。細胞をMBS plus psを入れた9 cmディッシュに移します。ディッシュを解剖顕微鏡に移動させ、これ以降は細胞を可能な限り16〜18 °Cに維持します。Dumont分類を用いて高品質なステージ6の細胞を選択し、ガラスピペットを用いてMBS plus psを含む新しいディッシュに回収します。高品質な細胞は、動物極に均一な色素沈着があり、動物極と植物極の間が明確に分かれている必要があります。また、すべてほぼ同じサイズである必要があり、直径は1.2から1.4ミリメートルであるべきです。1回の注入につき約200から300個の細胞を回収し、1回の実験につき合計で約1000個の細胞を用意します。Oサイトの品質が成功の鍵となります。調製中に卵巣に異常が見られた場合は、別の群から卵巣を採取し、最初からやり直すことを推奨します。アンチセンスオリゴの注入に備え、マイクロインジェクターの金属プランジャーを最低位置に設定し、オイルを満たしたガラスキャピラリーを金属プランジャーに装着します。解剖顕微鏡下で、小型の外科用鋏を用いて針の先端を切断します。チップの先端をできるだけ細くします。次にレーザーを用います。顕微鏡ステージ上にパラフィルムを敷き、その上に1 µg/µLの核酸溶液を3 µL分注します。これで、針の先端を満たします。気泡が混入している場合は、開口部を広げてください。次に、注入針の先端から約0.5 mmの位置に、視認可能な印を付けます。次に、細胞の注入に移ります。まず1つ目の細胞を注入するため、卵胞細胞がなく、針が貫通できる領域を探します。胚胞の下にある中心点を目指し、赤道境界に沿って針先を挿入します。同時に、反対側をピンセットで固定して細胞を安定させます。次にフットスイッチ制御を用いて溶液を注入し、4.6〜9.2 ngのアンチセンスオリゴヌクレオチド、または250 pg〜13.8 ngのメッセンジャーRNAを注入します。すべての細胞への注入が完了した後、それらを培養培地に移し、プロテアソーム内で変化が起こるよう数日間培養します。その後、最小限の培地と共にサイトを、5〜8 mLの成熟培地を含む6 cmのアグロスコーティングディッシュに移します。次いで、精子を注入する前に、この培地中でサイトを16時間培養します。本プロトコルでは、凍結保存された精子ストックを準備しておく必要があります。成熟のため16時間のインキュベーション後、テキストプロトコルを確認してください。細胞を、MBSおよびPSでコーティングされた6cmのエッググロス皿に非常に慎重に転移させ、洗浄します。細胞の取り扱いを誤ると、ixyの前に自発的に活性化する可能性があります。次に、成熟した卵母細胞をカウントし、卵母細胞の胚胞が崩壊していることを示す白いスポットがないか確認します。良好な細胞が80%未満である場合、それらは総じてixy処置を乗り切るのに十分な健康状態ではありません。続行するには。新しいディッシュに注入用培地を満たし、30分後にすべての細胞を慎重にディッシュへ移します。oligosで説明したのと同じインジェクターの準備を行い、成熟した細胞に精子溶液を注入します。理想的には、注入溶液 4.6 nanoliters あたり1個または2個の精子が含まれている必要があります。この注入溶液をテストするには、0.3 µg/mLのDPI溶液の液滴を作成し、そこに4.6 nLを注入します。次に、蛍光顕微鏡を用いて各液滴中の精子数をカウントします。精子濃度を確認後、細胞に精子溶液4.6 nLを注入します。溶液の注入に要する時間を一定に保ち、注入間の休止時間を最小限にして、卵母細胞に安定して注入してください。100回の注入ごとに、精子溶液を交換します。成熟したすべての卵母細胞への注入が完了した後、ディッシュを4〜5時間インキュベートし、その後、観察を行います。卵割が進んだ胚では、卵割溝が正常に受精した胚ほど明確でない場合があります。すべての卵割胚を培養液に移し、一晩培養します。翌日、生存している胚を0.1 XMMR（ixy胚の胚発生用）に移します。体外成熟卵子を用いた検討では、生殖胞卵子のほぼ100%がプロゲステロンに反応し、成熟の兆候を示しました。約25%が卵割しました。卵割した胚の60〜80%が胞胚・原腸胚期に達し、そのうちの約3分の1が泳動幼生（オタマジャクシ）期に達しました。ixy胚には正常胚と異常胚の両方が混在しており、これは生殖胞にアンチセンスsogoを注入し、その後にIVMおよび受精を行ったことで、胚の初期発生が可能になったことを示しています。このビデオを視聴することで、因子分解前の母性タンパク質の操作方法について十分に理解できるはずです。

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