Name: リステリア単球遺伝子を用いた感染マウスにおける培養および心臓コロニー形成における心臓細胞の細菌浸潤の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶリステリア単球遺伝子による心臓細胞への細菌浸潤評価法。in vitro培養系とマウス感染モデルを用いて、心筋炎の発症機構と治療法開発への貢献を目指す研究手法を解説します。

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この研究は、公衆衛生サービスがAI41816およびAI099339(N.E.F.)を付与し、NiAIDからF31AII094886-01(P.D.M.)によって支援されました。 内容は著者の責任であり、必ずしも資金調達源の公式見解を表すものではありません。

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</ol>

著者らは、競合する財政的利益を報告していない。

L. 単球遺伝子 は、広範囲に及び、よく特徴づけられるヒト病原体であり、多くの異なる疾患症状を引き起こすことができる15。細菌は、中枢神経系に到達し、植民地化し、胎児を発達させるために、血液脳関門や胎盤胎児障壁などの障壁を越えて移動する能力について以前に説明されています。これらの組織を植民地化する生物の 生体内 能力は、多くの場合、標的となる器官を構成する培養中の代表的な細胞に侵入する インビトロ 能力によって補完される。例えば、脈絡叢における上皮細胞の侵入は、CNS16を植民地化する生物の能力と関連している。絨毛性トロホブラストの外植物は、母体胎児の障壁17を表すために使用されてきた。本プロトコルでは、培養中の心臓細胞の細菌浸潤を評価する場合や、肝臓および脾臓のコロニー形成に対する個々の分離株に対する心臓の細菌コロニー形成の比較に有用である方法が記載されている。
このプロトコルには多くの重要なステップが含まれていますが、最も重要なものの中には、カバーリップで増殖...

リステリア単球遺伝子は、高齢者、妊婦、HIV/AIDSを有する人、および化学療法を受けている人を含む、感受性の高い集団において重篤な疾患を引き起こすことができるグラム陽性細胞内病原体である。これらの集団における感染は、汚染された食品を摂取した結果が多く、ほとんどの感染症は大規模な食物媒介性の流行2,3に関連している。ヒトおよび他の哺乳動物において、L.単球遺伝子は小腸の上皮境界を越えて転位することが可能であり、その後肝臓4,5に輸送される。動物モデルは、摂取した細菌が腸絨毛内で複製し、門脈静脈を通って肝臓に移動したり、腸間膜リンパ節を介して血流に広がったりし、肝臓および脾臓への血中血球播種化につながることを示唆している。肝臓および脾臓において、細菌は、プロの食細胞と常駐的なパレンキマル細胞の両方への取り込みを媒介することができ、これらの器官内の感染を迅速に確立する。細菌の負荷が増加するにつれて、多数の細菌が血液中に分散され、中枢神経系および胎盤(存在する場合)を含む感受性の組織をさらに植民地化することができる。これらの部位のコロニー形成は、髄膜炎、脳炎、および胎児中絶を含むヒトにおけるリステリア症の最も一般的な症状を妨げる2。
選択されたL.単球遺伝子の亜集団は、最近、心臓組織8内に侵入し、複製する能力が増強されたことが示されている。心臓の関与の症状は様々であり、心内膜炎および心膜炎から伝導異常を伴うフルミナント心筋炎まで9-13の範囲である。1年間のL.モノサイトゲネス心臓症例の総数は低いが、この感染のファセットが一般的に十分に認識されていないので、推定される可能性がある。病原体による心臓のコロニー形成には、多くの場合、既存の弁膜損傷または人工心臓弁などの宿主素因が必要である。しかし、心臓損傷および/または異常がない場合に感染した動物の心臓を植民地化する能力のために顕著であるL.単球遺伝子の単離者8がある。
本明細書明細書 では 、生体内および 生体内 で、生きた動物感染と同様に組織培養における浸潤アッセイを用いて感染動物内の心臓組織の細菌コロニー形成を評価する方法について説明する。これらの方法は、感染した動物の心臓組織を植民地化する可能性のある株を同定する上で有用であるだけでなく、心臓細胞の浸潤を増強し、心臓病理の変化をもたらす細菌遺伝子産物の同定にも有用であることが証明されている。これらの方法は、複数の株間の心筋症の比較を容易にする。ここで説明する方法については 、L.モノサイトゲネス 10403Sは、非心熱帯性株の十分に研究された代表として使用され、臨床分離株07PF0776は、心熱帯株の代表例として使用される。これら2つの株は、 生体内で の心臓細胞の細菌浸潤と 生体内での感染したマウスの心臓のコロニー形成との比較を提供するために選ばれた。分離株07PF0776は、HIV+患者8において致命的な不整脈を引き起こした心室間膿瘍から回復した臨床的分離株である。 L. 単球遺伝子 単離株は、その毒性の可能性が異なる可能性があり、 リステリア が免疫抑制および妊婦に感染する傾向を考えると、これらの集団内の人々は、異なる臨床分離株を評価しながら注意を払うべきである。

<table><tbody><tr><td>Difco</td><td>BHI Broth Base</td><td>237200</td><td>2 kg of Brain Heart Infusion Powder (without agar)</td></tr><tr><td>Difco</td><td>Agar</td><td>214510</td><td>2 kg of Granulated Agar</td></tr><tr><td>Difco</td><td>BHI Agar</td><td>241810</td><td>2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5%</td></tr><tr><td>Agar in vitrogen</td><td>LB Broth Base</td><td>12975-084</td><td>2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)</td></tr><tr><td>フィッシャー</td><td>グラスカバースリップ</td><td>12-545-80</td><td>12 mm ガラスカバースリップ</td></tr><tr><td>ファルコン</td><td>24 ウェル組織培養プレート</td><td>35-3047</td><td>24 ウェル、プラズマ処理組織培養プレート</td></tr><tr><td>ファルコン</td><td>14mL ポリスチレンチューブ</td><td>352051</td><td>14 ml ポリスチレンチューブ</td></tr><tr><td>ファルコン</td><td>96 ウェル U 底プレート</td><td>35-3077</td><td>非組織培養処理 96 ウェルプレート</td></tr><tr><td>コーニング</td><td>0.05% トリプシン、0.53 mM EDTA (1X)</td><td>25-052-CI</td><td>組織培養用トリプシンEDTAの原液</td></tr><tr><td>コーニング</td><td>DMEM(高グルコース、高ピルビン酸)</td><td>15-013-CU</td><td>DMEM培地 FBS、グルタミン、抗生物質を含まない</td></tr><tr><td>コーニング</td><td>ペン/連鎖球菌/グルート液</td><td>30-009-CI</td><td>ペニシリン、ストレプトマイシン、L-グルタミンの組織培養用原料混合物</td></tr><tr><td>コーニング</td><td>ゲンタマイシン</td><td>30-005-CR</td><td>50 mg/ml 組織培養用ゲンタマイシンの原液</td></tr><tr><td>Cellgro (Corning)</td><td>L-Glutamine</td><td>25005197</td><td>抗生物質を含まないL-グルタミン原液</td></tr><tr><td>デンビル</td><td>75cm^2 フラスコ</td><td>T1225</td><td>75 cm2 組織培養処理フラスコ</td></tr><tr><td>デンビル</td><td>1.5mL 微量遠心チューブ</td><td>2013004</td><td>1.5ml 微量遠心チューブ</td></tr><tr><td>ATCC</td><td>H9c2 心臓筋芽細胞</td><td>CRL-1446</td><td>ラット心臓筋芽細胞Hyclone</td></tr><tr><td></td><td>ウシ胎児血清</td><td>SH30070.63</td>ウ<td>シ胎児血清</td></tr></tbody></table>

リステリア単球遺伝子を用いた感染マウスにおける培養および心臓コロニー形成における心臓細胞の細菌浸潤の評価

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

リステリア単球遺伝子は、免疫不全患者、高齢者、および妊婦に重篤な侵襲感染を引き起こす可能性のあるグラム陽性の栄養性細胞内病原体である。 ヒトにおけるリステリア症の最も一般的な症状には、髄膜炎、脳炎、および胎児中絶が含まれる。 侵襲的なL.単球遺伝子感染の有意だが、はるかに文書化された後遺症は、心臓を含む。 心臓病による死亡率は治療にもかかわらず最大35%までであり得るが、心臓組織のL.単球遺伝子コロニー形成およびその結果として生じる病理に関してはほとんど知られていない。 さらに、最近では、L.モノサイト遺伝子の亜集団が心臓組織内に侵入し、成長する能力が強化されたことが明らかになりました。 このプロトコルは、L.単球遺伝子分離株の心肺を評価するために使用することができるインビトロおよびインビボ法で詳細に記述する。 組織培養におけるH9c2ラット心筋芽細胞の感染、ならびに感染したマウスの心臓の細菌コロニー形成の決定のための方法が提示される。 これらの方法は、感染した動物の心臓組織を植民地化する可能性のある株を同定するのに有用であるだけでなく、心臓細胞の浸潤を増強し、心臓病理学の変化を促進するのに役立つ細菌遺伝子産物の同定を促進する可能性がある。 これらの方法はまた、複数のL.単球遺伝子株間の心筋症の直接比較を提供する。

選択した単球遺伝子の単離株は、細胞培養およびマウス感染モデルにおける心臓細胞の侵入を増強する。図1は、細菌コロニーが寒天培地上の懸濁液のスポットめっき後にどのように現れるかの例を示す。この方法により、多数の寒天メディアプレートを使用することなく、サンプル内のCFUsを正確に評価できます。図2は、株07PF0776の株と心臓細胞に侵入する株10403Sの能力を比較する組織培養ベースのアッセイの一例を示す。10403Sに感染した細胞と比較して、ゲンタマイシン治療後の感染したH9c2心臓細胞から2倍以上の07PF0776細菌CFUを回収することができる。このアッセイを用いた心性向きの株に対しては、2~4倍の違いが日常的に観察される。図3は、感染後3日での肝臓、脾臓、および感染したマウスの心臓からの細菌の回復の例を示す。心性異性器株07PF0776または株10403Sを有するマウスの感染は、感染したマウスの肝臓および脾臓から同じ数の細菌を生じるが、07PF0776に感染したマウスは、心臓から検出可能な数の細菌を生じさせ、この器...

リステリア単球遺伝子は、妊婦の胎児感染を引き起こし、感受性のある集団では髄膜炎を引き起こす。 細菌の亜集団は心臓組織を植民地化し、患者および実験動物に心筋炎を引き起こす可能性がある。 ここでは、感染した動物におけるL.単球遺伝子の心臓細胞浸潤および心臓コロニー形成を評価する方法を説明するプロトコルを提示する。

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

本手順の全体的な目的は、心臓への定着および心筋細胞への浸潤のin vivoおよびin vitroモデルを用いて、心臓細胞への微生物感染を評価するための効率的な方法を提供することです。まず、細菌培養を行い、細菌細胞を回収・洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁させることでこれを達成します。次に、ガラスカバースリップ上で育成した心筋細胞単層に細菌懸濁液を感染させるか、または細菌懸濁液を尾静脈注射によってマウスに接種します。次に、心筋細胞をゲンタマイシン存在下でインキュベートして細胞外細菌を死滅させ、続いて細胞溶解を行って細菌を回収します。細菌または感染動物は、感染後2〜3日間、健康状態をモニタリングした後、標的臓器を単離するために屠殺します。最後に、細胞および臓器懸濁液を希釈し、スポットプレート法を用いて播種し、細胞または標的臓器に付随する生存細菌数を測定します。最終的に、アガール培地上で細菌コロニー数を計測し、組織培養で育成した細胞における心細胞への侵入効率、または動物における心臓感染の効率および範囲を決定します。この手法は、異なる臨床分離株や環境分離株の Listeria monocytogenes が侵襲性心疾患を引き起こす潜在性を調べるために利用できます。また、心臓組織を標的とする他の微生物病原体にも適用可能ですし、プロトコルを修正して他の目的の臓器や組織を調べることも可能です。侵入アッセイを実施する前日に、H9c2細胞の24ウェルプレートを準備し、テキストプロトコルに従って滅菌BHIブイヨンに目的の Listeria 株を接種しておきます。テストする細菌株をPBSで再懸濁した後、24ウェルプレートの各ウェルにPBS細菌溶液を少なくとも20 µLずつ分注します。プレートを緩やかに揺らしてサンプルを各ウェルに均一に広げ、37 °C、湿度95％、5％ CO2の条件下で45分間インキュベートします。インキュベーション後、バイオセーフティーキャビネットに戻り、吸引 equipped なピペットを使用して各ウェルの培地を吸引除去します。次に、加温したPBSを各ウェルに1 mLずつ加え、カバースリップを洗浄します。最後に、吸引機付きピペットを用いてウェルからPBSを吸引除去します。続いて、Gentamycinを含むDMEMを各ウェルに1 mLずつ加えます。Gentamycinは、細胞外に残存する細菌のみを殺菌します。プレートをインキュベーターに戻し、さらに1時間インキュベートします。その後、クリーンベンチ内でピンセットを使用し、各ウェルからカバーガラスを取り出し、あらかじめ用意しておいた1 mLの滅菌ddH₂Oを含む14 mLチューブに入れます。コンタミネーションを防ぐため、カバーガラスを移す合間に、ピンセットをエタノールに浸し、火炎滅菌してください。各チューブを軽くボルテックスした後、それぞれから分注し、96ウェルプレートの各ウェルに転送します。次に、各サンプルを1/10から1/1000まで段階希釈します。続いて、予熱した乾燥LBプレートに、各希釈液をスポットします。スポットが乾燥した後、プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、翌朝まで一晩培養します。各スポットのコロニー数を計測し、その希釈系列を用いて、マウスに接種するL. monocytogenesの各菌株について、カバーガラス1枚あたりの細菌数を算出します。注入中に動物を固定するため、1匹の動物をハーネスに装着します。アルコールパッドを使用して注入部位を清浄し、尾静脈を拡張させます。次に、1 mLシリンジと27.5ゲージの針を用い、目的の培養液200 µLをマウスの尾静脈にゆっくりと注入します。注入後に止血が必要な場合はペーパータオルを使用し、その後、動物を新しいケージに移します。テキストプロトコルに従い、最大72時間後にバイオセーフティキャビネット内で動物を安楽死させた後、動物を解剖台に固定し、70% ethanolを浸透させます。腹部と胸部に、膣口から剣状突起まで伸び、さらに左右の腋窩へと至るY字型の切開を加えます。皮膚を剥ぎ取ります。脚から針を抜き、それらを固定に使用します。解剖部位を開き、腹膜を慎重に切開して、腸、胃、肝臓、および脾臓を露出させます。肝臓上部の肝静脈と冠状靭帯を切断し、肝臓の下側にある小腸の第一節および背部の筋肉に接続しているその他の靭帯を除去します。肝臓を、50 mLチューブに入れた5 mLの滅菌DD H2Oに配置します。次に、脾臓の血管と靭帯を切断して脾臓を取り出し、5 mLのDDH₂Oを含む別のチューブに入れます。続いて横隔膜を確認し、胸部を可視化するために肋骨に沿って慎重に切開します。剣状突起と胸骨を頸部まで切断して胸腔を開き、心臓と肺を露出させます。ピンセットを用いて心臓の心尖部をそっと掴み、持ち上げて大動脈と肺血管にテンションをかけます。次に、血管を切断して心臓を取り出し、別の水入りチューブに入れます。テキストプロトコルに従ってホモジナイザーを準備し、肝臓1個を少なくとも2分間、または臓器の可視部分がなくなるまでホモジナイズします。ピンセットを使用して、プローブから大きな破片を取り除いてください。すべての臓器サンプルのホモジナイズが完了したら、肝臓および脾臓のサンプルについては1/10から1/10,000まで、心臓については1/10から1/1000までの段階希釈液を調製し、あらかじめ加温したLB寒天プレートに希釈液を播種します。臓器が十分に感染していたかを確認するため、未希釈のサンプルを別のプレートに播種することも可能です。プレートが乾燥した後、37 °Cのインキュベーターに入れます。希釈サンプルの96ウェルプレートはパラフィルムで密閉し、-80 °Cのフリーザーで翌日まで保存してください。コロニー数をカウントし、希釈倍率を用いて臓器あたりの総細菌数を算出します。ここでは、心細胞への侵入能力について、菌株 1 0 4 0 3 s と菌株 zero seven PF 0 7 7 6 を比較した組織培養ベースのアッセイ例を示します。zero seven PF 0 7 7 6 は2倍以上の数値を示しました。1 0 4 0 3 s を感染させた細胞と比較して、gentamicin 処理後の感染 H nine C two 心細胞から回収された細菌 CFU を示しています。この図は、感染後3日目の感染マウスの肝臓、脾臓、心臓から回収された細菌数を示しています。アトロピック株07PF0776または株10403sによる感染では、感染マウスの肝臓および脾臓から回収される細菌数は同程度となります。しかし、07PF0776に感染したマウスでは、心臓から検出可能な数の細菌が得られる可能性が高く、この臓器における細菌負荷もより大きくなる傾向があります。本手順に続き、蛍光顕微鏡観察や臓器の組織学的解析などの他の手法を用いることで、細菌の細胞間伝播や組織単層への影響の有効性、あるいは感染部位への免疫細胞動員などのさらなる疑問を解明することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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腸管出血性発光標識細菌によるエシェリヒア属大腸菌(EHEC) の植民地化のためのマウスモデルの詳細なプロトコルが表示されます。非侵襲的生体内でイメージ投射生きている動物のシステムによってこれらの発光細菌の検出は、EHEC...

非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出

感染中にリステリア菌は脳を植民地化する血液-脳関門を通過することができます。このプロトコルではマウスの感染臓器の細菌の植民地化を評価する方法を示します。脳実質の細菌数の定量法の全臓器灌流を実行する手順を提供しています。...

リステリア菌脳の感染症

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

学ぶリステリア単球遺伝子による心臓細胞への細菌浸潤評価法。in vitro培養系とマウス感染モデルを用いて、心筋炎の発症機構と治療法開発への貢献を目指す研究手法を解説します。

リステリア単球遺伝子を用いた感染マウスにおける培養および心臓コロニー形成における心臓細胞の細菌浸潤の評価

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