自動画像処理手法を用いてマウス社交性の実験的評価

これらの行動実験と自動解析を組み合わせた全体的な目標は、マウスの社会性を時間効率よく定量化することです。この方法は、自閉症スペクトラム障害の検証済みマウスモデルにおける社会性を高めるための薬物の迅速なスクリーニングに役立ちます。自動分析を導入する主な利点は、プロセスが加速され、スクリーニングがより効率的になることです。

マウスの社会的行動を評価するための自動化された方法の必要性が生じたのは、候補化合物の単回投与のリアルタイムの視覚的スクリーニングに50時間以上かかるためです。ビデオの後半では、大学院生の Frency Varghese が自動分析を実演します。3コンパートメントの黒壁ケージのセットアップから始めます。

最初のセッションでは、ケージの両端コンパートメントに空の逆ワイヤーカップを置きます。次に、ケージを上から見るためにビデオカメラを準備します。3 つのコンパートメントはすべて、少なくとも 720 x 480 ピクセルの解像度で表示する必要があります。

次に、間接白熱灯でケージを照らし、床から測定したときにケージの内部が3.5ルクスを超えないようにします。また、カメラが検出できるレベルでケージを照らすための赤外線も提供します。参照用に空のケージの 1 フレーム画像を撮ります。

最初のセッションでは、テストマウスをケージに入れます。その後、ビデオの自動分析をキューに入れるには、ケージに手を一度だけ振ります。マウスにテストケージを10分間探索させます。

その後、ホームケージに戻します。2回目のセッションでは、刺激マウスを2つの逆さまカップのいずれかの下に置きます。カウンターバランス方式でカップを選択します。

ソフトウェアで、刺激マウスがどのカップの下に置かれたかを示します。命名規則では、同封のマウスが入っているカップはソーシャルカップで、もう一方のカップは非ソーシャルカップです。コンパートメントには同様の名前が付けられています。

2 番目のセッションの開始時に、最初のセッションのように手を振ってキューに入れます。2 番目のセッションの最後に、逆向きのカップを取り外して 2 番目のマウスを解放します。もう一度手を振って3回目のセッションの開始を示し、2匹のマウスをテストケージ内で10分間相互作用させます。

10分後、両方のマウスを自宅のケージに戻します。このセクションでは、ユーザーインターフェースを使用してムービーを処理する方法について説明します。ただし、ユーザー入力なしでの迅速なバッチモード分析も可能です。

まず、[読み込み] ボタンを使用してムービーを読み込みます。次に、ケージ構成を選択します。解析プログラムは、ケージの境界、コンパートメント、カップを特定します。

4つのプリセット構成のいずれかを選択するか、座標を手動で調整します。次に、ムービーの各フレームに対して、次の処理手順を実行します。まず、フレームをグレースケールに変換します。

次に、準備中に作成されたグレースケール参照フレームを減算し、マウス位置を除くすべての場所でピクセル値をゼロにします。3 番目に、しきい値の明るさより上のすべてのピクセルを白に設定し、他のすべてのピクセルを黒にすることで、フレームを二値化します。照明条件に合わせて調整してください。

次に、Erode/Dilate機能を使用して画像からテールを削除します。まず、二値化された画像を3回侵食します。次に、フレームを6回拡張します。

次に、フレームをさらに3回侵食します。異なるピクセル解像度を使用する場合は、調整が必要になることがあります。手の波は、白いピクセルのボリュームの大きな跳躍として簡単に識別できます。

これにより、セッションの開始とセッションの順序を自動的に検出できます。各セッション内で、L/Compコマンドを使用して、白いピクセルの最大成分を検出します。これにより、マウスに属さないピクセルが削除されます。

次に、[端点検索] 関数を使用して、白色ピクセルの最大コンポーネント内で最も遠い 2 つのピクセルを特定します。これらは鼻と尾です。ソフトウェアは、白いピクセルオブジェクトの重心またはCOGを決定し、フレーム間の移動方向を計算します。

2 つのマウスを使用するセッションでは、2 つのオブジェクトを追跡する必要があります。同じコマンド セットを使用して、最も大きい 2 つの白いピクセル オブジェクトを選択して向きを変えます。ソフトウェアは、フレームごとにCOGを自動的にチェックします。

オブジェクトのサイズが 20% 以上変化した場合、または重心がマウスの可能な距離よりも遠くに移動した場合、これらの基準が満たされるまで、二値化のしきい値が自動的に増加します。ソフトウェアは、フレームごとに重心を自動的にチェックします。オブジェクトのサイズが20%以上変化した場合、または重心がマウスの可能な範囲を超えて移動した場合、これらの基準が満たされるまで二値化のしきい値が自動的に調整されます。

インタラクションは、オブジェクトが2センチメートル以内にあるときに自動的に検出されます。これらのセグメントは、ユーザー入力のために再生されます。各セグメントについて、テストマウスの視点を「社会的回避」、「社会的アプローチ」、または「どちらでもない」のいずれかにラベルを付けます。

自動解析を確認するには、[読み込み] ボタンを使用してムービーを読み込みます。次に、[セッション 1 の開始] をクリックして、そのセッションの最初のフレームを表示します。再生/停止コマンドを使用して、再生を制御します。

処理された動画には、各マウスの頭と尾に異なる色の円が描かれています。また、社交性の測定は画面に表示され、再生中に更新されます。自動解析で発生したエラーを修正します。

最も一般的なエラーは、インターフェイスのツールで修正できるヘッドテールフリップです。これは、動画の約20%で発生します。より複雑なエラーのまれなケースでは、通常は、特定の一連のビデオフレーム全体でマウスの鼻の位置を手動で示すことで解決できます。

確認したら、エクスポート機能を使用して、社交性データをスプレッドシート形式でエクスポートします。複数のムービーからデータを 1 つのスプレッドシートとしてエクスポートするには、ムービーを 1 つのフォルダーにバンドルする必要があり、データのコンパイル関数が操作を行います。セッション1では、生後4週間のBALB/cテストマウスを10分間で59回コンパートメント間を移動する様子を追跡しました。

各コンパートメントで過ごした時間は、社会的刺激がない場合のコンパートメント選好のベースラインと見なされます。セッション2では、ソーシャルカップと非ソーシャルカップに、生後4週間のICRマウスを隠して贈呈しました。ソーシャルコンパートメントで時間を過ごすことには明らかな偏見がありました。

具体的には、マウスは非ソーシャルカップよりもソーシャルカップで多くの時間を過ごしました。3回目のセッションでは、カップを持ち上げ、マウスとの対話を許可しました。合計35のソーシャルアプローチが10分間で行われました。

開発後、この技術は、自閉症スペクトラム障害の検証済みマウスモデルにおける社会性障害の中核症状領域を改善するための有望な薬剤のより迅速なスクリーニングを促進します。自動処理は、さまざまなケージのデザインや種に適合させることができます。関心のある任意の振る舞いは、それを確実に検出するアルゴリズムを開発できる限り、評価することができます。