蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

この手順の全体的な目標は、内在性膜タンパク質のトポロジーを決定することです。これは、緑色蛍光タンパク質またはGFPと膜のアミノまたはカルボキシルテールとの間の滲出液、タンパク質の発現によって達成されます。制御目的の細胞に目的のタンパク質、RFPなどの可溶性蛍光タンパク質を発現させることができる。

次に、原形質膜を選択的透過する。デタージェントdigを使用すると、可溶性蛍光タンパク質は細胞から出ますが、膜結合した蛍光タンパク質は細胞内に保持されます。最後のステップは、プロテアーゼを透過細胞に適用し、蛍光シグナルの保持または損失を測定することです。

最終的には、蛍光顕微鏡イメージングを使用して観察された蛍光強度の変化を使用して、内在性膜タンパク質のトポロジーと配向を示します。この手法がエピトープマッピングなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、手に入れるのが難しい特殊な機器やさまざまな試薬を多く必要としないことです。この方法は、内在性膜タンパク質のどのドメインがサイトゾル内に位置しているのか、どのドメインが小胞体金Gやエンドソームなどの細胞小器官の内腔内に位置しているのかなど、膜タンパク質生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、蛍光タンパク質KYの生成と検証から開始します。次に、脂質、ウイルス、またはエレクトロポレーションベースの技術を含む標準的な高効率、低毒性のトランスフェクション方法を使用して、蛍光タンパク質KYをヒト胚性腎臓細胞またはHEK 2 93細胞にトランスフェクションし、一過性または安定的な発現を生成し、細胞をポリリジンコーティングされたカバースリップにプレーティングします。二酸化炭素対応組織培養インキュベーター内の摂氏37度の適切な組織培養培地で細胞を5〜48時間維持します。

エピ蛍光顕微鏡を用いてGFP融合タンパク質の発現について細胞をモニターすると、GFP蛍光シグナルの内因性蛍光シグナルは通常24〜72時間以内に最大に達します。トランスフェクション後。蛍光シグナルが最大レベルに達したときに細胞を使用する タンパク質発現は、目的のタンパク質またはGFP部分に対する抗体を使用した免疫ブロット分析によっても監視できます。

まず、細胞を治療するための重力供給灌流システムを設定します。独立したリザーバーとバスに単一の出口を持つマニホールドに接続されているポリエチレンチューブを備えた溶液用の50ミリリットルの注射器を準備します。吸引ピペットを一定の槽容量に維持し、原形質膜透過用の灌流リザーバーを手動で切り替えて溶液交換を実現します。

まず、細胞から細胞培養培地を取り出します。細胞をそれぞれ1分間3回洗浄します。KHMバッファーでは、カバースリップを蛍光顕微鏡ステージに置き、原形質膜を選択的に透過するための制御非透過性画像を表す最初の画像を収集します。

KHMバッファーのディジットトインをセルに追加し、バッファーとディジットトインを1分あたり5ミリリットルの速度で10〜60秒間セルに灌流します。原形質膜が十分に透過性であることの確認は、可溶性GFPまたはRFP分子の発現によって容易に行われ、これは細胞の膜から容易に拡散します。次に、透過処理により、ジゴンおよび原形質膜の透過に続く蛍光シグナルの細胞保持を確認することにより、目的のGFPタンパク質キメラが膜に組み込まれていることを確認します。

次に、テキストプロトコルで参照されているように、ミトコンドリアタンパク質などの有機特異的蛍光タンパク質を発現します。従来通り最適な発現条件を決定します。細胞内臓器管の形態が長時間の曝露で一定に保たれるようにすることで、DIGと濃度が使用される細胞タイプに適していることを確認します。

トインを掘る。KHMバッファーで細胞を洗浄した後、プロテアーゼを細胞に直接添加します。毎分5ミリリットルの流速で細胞を精査し、重力供給灌流システムを使用して調製物を連続的に浸します。

次に、蛍光シグナルが持続するか劣化するかを判断します。コンピュータ制御の蛍光顕微鏡のビデオ画像キャプチャ機能を使用して、適切なフィルターセットの下で蛍光顕微鏡画像を収集します。蛍光シグナル強度をインキュベーション条件の関数として定量化します。

個々のセルを囲む関心領域内の平均ピクセル強度を取得します。30秒から60秒にわたって初期シグナル強度の90%を超える損失は、GFPタンパク質kyのタンパク質分解と一致しています。可溶性蛍光シグナルの完全な消失は、ディジットトインの適用から10〜60秒以内に起こるはずです。

目的のタンパク質が細胞内小器官と関連していることの確認は、ジゴンおよび透過後の蛍光シグナルの保持に注目することによって達成されます。膜固定キナーゼLTK 2のカルボキシルテールをGFPに融合させ、一過性蛍光ltkを発現させた。プロテイナーゼKの添加後、2つのGFPシグナルが急速に失われ、ltk 2のカルボキシル末端の位置がサイトゾル内にあることが示されました。

CaviおよびGFPは、細胞質ドメインにGFP部分が結合した原形質膜タンパク質です。LTK 2と同様に、caviおよびGFPからのシグナルは指に敏感ではありませんが、その後のプロテアーゼの付加には敏感です。DSレッドミトは、ジゴン透過後のシトクロムCオキシダーゼからのミトコンドリア標的配列に融合した赤色蛍光タンパク質をコードし、プロテイナーゼKを添加します。DSレッドミトに関連する蛍光は安定しています。これは、Fluor 4がミトコンドリア内にあり、サイトゾルにさらされていないことと一致しています。

黄色の蛍光タンパク質に結合したGPIアンカー型プリオンタンパク質のように、膜タンパク質に付着した蛍光部分が細胞の外側を向いている場合。プロテイナーゼ治療は、予想通りのdig impの透過を事前に必要とせずに、蛍光シグナルを迅速に消光する必要があります。プロテイナーゼ処理後、このコンストラクトを発現する細胞の細胞外蛍光シグナルは急速に消失しました。

一度習得すると、このテクニックは適切に行えば1〜2時間で実行できます。このビデオを見れば、目的の膜タンパク質のトポロジーを決定する方法について、より深く理解できるはずです。