Name: 蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学ぶ膜タンパク質のトポロジー決定法。GFPキメラタンパク質を発現させ、選択的プロテアーゼ処理と蛍光顕微鏡観察により、膜貫通タンパク質の細胞内配向を正確に解析する手法を習得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、画像のキャプチャと分析におけるCMSのCalcium Imaging Core Facilityの支援と指導に感謝したいと思います。この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)のHL102208からNABの支援を受けました。このアプローチは、もともとNIHのHolger Lorenz氏とJennifer Lippincott-Schwartz氏によって開拓されました。

蛍光タンパク質キメラの1の生成と検証<ol><li>標準的な組換えDNA戦略13を用いて目的のタンパク質のアミノまたはカルボキシル末端に緑色蛍光タンパク質（GFP）を追加。 注：我々は広範囲にGFPを用いているが、このようなシアン蛍光タンパク質（CFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）などの他の変異体は、DsRedのとmCherryを用いることができる。フォアフォールディング効率、明るさと光安定性の改善は、絶えず行われている、と研究者らは、最新世代の構築物の彼ら自身を利用すべき。 <ol><li>正しいDNA配列を確認し、GFP部分は、目的のタンパク質とインフレームであることを確認してください。標準的な組換えDNA戦略21を使用してシークエンシングを行います。 注：多くの機関は、調査員が、追加情報のために連絡することが奨励されているコアDNA施設を、持っている。 </li><li>シングルまたはダブルパス膜タンパク質生成融合タンパク質19のアミノ末端およびカルボキシル末端の両方のバージョン。 </li><li>マルチ貫通タンパク質の推定膜外ループ内のGFPのほか、末端を挿入します。タンパク質は、ERトランスロコンを通過した後の信号系列は、しばしば、タンパク質分解によって切断されるように、標的タンパク質のアミノ末端に結合した蛍光融合タンパク質を有する膜貫通キメラを生成する際に特別な注意を払う。 </li><li>インタクトなアミノ末端タグ付き蛍光タンパク質を含む成熟タンパク質を生成するために、現存のシグナル配列の場合には、切断部位の蛍光融合タンパク質先端を挿入。キメラ21を生成するための標準的な組換えDNA戦略を採用する。 </li></ol></li><li>関心の細胞株で十分適切にローカライズされた蛍光シグナルの存在を決定する。 <ol><li> appropriの下でGFPの固有の蛍光を用いて、エピ蛍光顕微鏡で細胞を観察するフィルタ設定された条件を食べました。 510から560 nmのを包含するGFPフィルターセットの場合、正しいフィルターを採用フォアのために使用されていることを確認。 注：目で評価は信号が存在する中で細胞構造を簡単に背景の上に解決されていることを十分に強い信号を提供する際に十分な信号が達成される。さらに、GFPタンパク質の染色パターンは、適切な細胞小器官のマーカーのそれと一致し、ネイティブのタグなしタンパク質のものと好ましくは同一である必要があります。 </li></ol></li><li>安定または一過性トランスフェクションアプローチが評価されているタンパク質に基づいて利用されるかどうかを決定します。 注：安定なトランスは、一般的に一過性のシステムよりも低レベルの発現を与える。一過性発現は、タンパク質の高レベルの発現を生じ、信号強度（タンパク質依存〜5-24時間後にトランスフェクション）を増加させるが、それはまた、タンパク質AGGRとして過剰発現アーチファクトにつながる可能性誤った細胞内局在につながる経路を標的にタンパク質のegationや彩度。 </li></ol>細胞および細胞培養の2トランスフェクション注：種々の細胞が14 HEK293、HeLa細胞、COS-7およびCHO細胞を含む、FPP分析に適している。以下の説明は、Hek293細胞での膜タンパク質の発現に基づいている。 <ol><li> 5％ウシ胎児血清（FBS）、1％ピルビン酸ナトリウム、および37℃で250 / mlのペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、6mlの中の付着単層として、ヒト胚性腎細胞（HEK293）を成長さ5％CO 2 C。層流の組織培養フード内のセルのすべての作業を行う。 T-75フラスコ中〜80％コンフルエントになるまで培養液中で細胞を増殖させる。 </li><li> transienを生成するために、脂質を含む、任意の標準的な高効率、低毒性のトランスフェクション法、ウイルス - またはエレクトロポレーションベースの技術を使用して、トランスフェクト細胞Tまたは安定発現。通常、1×10 6細胞あたりのプラスミドDNA2μgの良い再現性のあるタンパク質の発現を提供します。 CO 2が可能な組織培養インキュベーターにおいて37℃で適切な組織培養培地で5-48時間、細胞を維持する。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、適切なフィルターセットを用いて、GFPの固有の蛍光シグナルを使用して、落射蛍光顕微鏡を用いてGFP融合タンパク質の発現のために細胞をモニターする。蛍光シグナルは通常、トランスフェクション後24〜72時間以内に最大値に達する。蛍光信号が最大レベルに達したときに細胞を使用する。目的のタンパク質またはGFP部分のいずれかに対する抗体を用いたイムノブロット分析によってタンパク質発現レベルをモニターする。 </li><li>コー​​ティングされたカバースリップ上の実験解析プレート細胞について。どちら生細胞構成または以下の固定の下に表示し、顕微鏡スライド上にマウントします。プレートの細胞が24-48時間以内に60％-80％のコンフルエンスを達成するために。 <ol><li>全面を覆うようにポリリジン溶液（0.1 mg / ml）で、でコーティングしたカバー。 37℃で細胞培養インキュベーター中で60分間、続いて室温で紫外光下で30分間、インキュベートする。過剰ポリリジンを削除し、PBS中でカバーグラスを3回すすいでください。 </li><li>あるいは、油浸対物レンズとの直接撮像を可能にする光学ガラス底細胞培養プレートからなるチャンバーカバーグラス上に細胞をプレー。実際の顕微鏡のセットアップは研究者に利用可能な機器に依存しますが、迅速なソリューションの変更が可能であるべきである。細胞型および細胞の形状に応じて、細胞は、FPPアッセイの時点で約60〜90％コンフルエントであるべきである。 </li></ol></li></ol> 3.蛍光顕微鏡のセットアップ<ol><li>そのような60X、1.42 NA油浸対物レンズとして最大のシグナル収集および空間分解能、用の高開口数（NA）油浸対物レンズを使用してください。目を使用してください蛍光団を刺激するE以下のレーザー：アルゴンガスを488nm（GFP及びYFP）と561ダイオード（RFP、mCherryを）。 </li><li>各構築物のための画像の最適な露出、ゲイン、キャプチャレートを決定する。 （ステップ7.1.2を参照）を光退色最小限にするためにレーザー強度と露光時間を調整します。 </li><li>複数のフルオロフォア（ 例えば 、膜タンパク質マーカーと協調膜透過のための可溶性マーカー）を用いた研究のために、信号のクロストークを最小限にし、信号対雑音比を最大にするために適切なフィルターセットを選択する。 </li></ol> 4.細胞膜透過化のための最適条件を確立する<ol><li> （ 例えば EGFP、DsRedの）唯一の可溶性の蛍光タンパク質を発現する細胞からの細胞培養培地を除去します。 KHM緩衝液（110 mMの酢酸カリウム、3mMのMgCl 2を 、20mMのHEPES-NaOHでpH7.2）中で細胞を3回（各1分）で洗浄する。室温で細胞およびすべての試薬を用いた実験を行います。 </li><li>場所細胞Onはカバーガラスは、蛍光顕微鏡ステージ上KHMバッファー（ステップ2.4​​参照）、コントロールの非透過化」段階を表す第一の画像を収集する。 </li><li>選択的に、原形質膜を透過性にするために、細胞にKHMバッファにジギトニン（30μM）を加える。 10-60秒間5ml /分の速度で、バッファ（バッファ+ジギトニン）で細胞を灌流。 </li><li>徐々にジギトニンの濃度を高めることにより、最適なジギトニン濃度を決定します。ジギトニンアプリケーションの10~60秒以内可溶性EGFPからの蛍光シグナルの完全な損失がある場合に最適なジギトニン濃度が達成される。多くの細胞については10〜50μMのジギトニンの適用は、細胞膜を透過するのに十分である。 <ol><li>すべてのアプリケーションがジギトニンの可能な限り低い濃度を使用してください。透過化バックグラウンド信号のための透過処理をジギトニン後の画像を収集します。 </li></ol></li><li>関心のGFP-タンパク質キメラが内膜であることを確認してください原形質膜16のジギトニン透過化以下の蛍光シグナルの細胞の保持を確認することによりtegrated。 <ol><li>オルガネラ特異的蛍光タンパク質23を発現する。ミトコンドリアタンパク質は、 例えばこの点16、、pDsRed2-水戸ベクターにうまく機能します。ステップ2.1で説明したように最適な発現条件を決定する。 </li><li>ジギトニン濃度が長期化にわたって細胞内小器官の形態は（60分まで）ジギトニンへの暴露一定のままであることを保証することによって、使用される細胞タイプに適切であることを確認します。 注：そのようなリソソームなどの様々な細胞コンパートメント、に対する抗体を用いて使用する標準免疫蛍光顕微鏡プロトコル（ 例えば 、LAMP1）、ゴルジ（ 例えば 、TGN38）、小胞体（ 例えば 、カルネキシン）、エンドソーム（ 例えば 、Rab5の）、ミトコンドリア（ 例えば 、チトクロームc）の細胞内小器官の形態/整合性は飛躍的にオベ変更された場合rは60分には、ジギトニン濃度が高すぎる可能性があり、及びジギトニンの濃度および/または露光時間の減少を必要とする。 注：ジギトニンは吸入および皮膚接触による有毒である。適切な個人用保護具（P​​PE）を着用してください。 </li></ol></li></ol>蛍光タンパク質の5プロテアーゼトリートメント<ol><li> KHMバッファに細胞を洗浄した後、プロテアーゼ（プロテイナーゼK、KHMバッファ中に50μg/ mlの）を追加し、直接細胞に。連続的に製造が風呂重力供給灌流システムを用いて5ml /分の流量で細胞を灌流する。 <ol><li> 50ミリリットル注射器に保管してソリューションとポリエチレン管を浴（5ミリリットル/分の流量）で、単一の出口でマニホールドに独立したリザーバを接続。定数（0.5 ml）を、浴容量を維持し、手動で灌流リザーバとを切り替えて溶液交換を達成するために、位置吸引ピペット。 </li></ol></li><li>フッ素かどうかを判断するために画像を収集escent信号が持続するか、低下します。 30〜60秒を超える初期信号強度の&gt; 90％の損失がGFPタンパク質キメラのタンパク質分解と一致している（代表的な結果を参照）。 </li><li>無信号劣化がプロテイナーゼKで観察されていない場合、そのような損失が予想される場合、KHM緩衝液中のトリプシン（4-8 mM）を有するプロテイナーゼK溶液を置き換える。必要に応じて、プロテイナーゼK、トリプシンの混合物を利用する。プロテアーゼ活性をクエンチする必要はない。 </li></ol>外部ドメインとプラズマ膜タンパク質6.別のアプローチ<ol><li>細胞膜のタンパク質について、透過処理をジギトニン前に外部の蛍光タンパク質キメラのためのアッセイを行う。 KHM緩衝液中のカバースリップ上の細胞（5 ml /分×3分間）洗浄し、そしてプレプロテアーゼ治療のための画像を取得し、ステップ7のようにプレプロテアーゼ蛍光シグナルを定量化する。 </li><li>トンで、（KHMバッファ中に50μg/ mlまたはトリプシン4-8 mMのプロテイナーゼK）をプロテアーゼ細胞を公開KHM培地を含むプロテアーゼ（流速5ml /分）で細胞を灌流することによりジギトニン彼が不在。信号が消えるどのように迅速または信号が持続する時間を決定するために、蛍光タンパク質の画像を収集。 </li><li>ジギトニン透過化の前に、10％血清（FBS）を含有する細胞培養培地中で細胞を3回（各1分）で洗浄することにより、すべてのプロテアーゼ活性をクエンチする。 </li><li> 2分間KHM緩衝液（5ml /分の流量）で灌流して細胞を洗浄する。前の透過化画像を取得。ステップ4で説明したように細胞膜を透過。 </li><li>手順5で説明したようにプロテアーゼを添加した後の画像を収集します。 </li></ol> 7.画像解析<ol><li>蛍光シグナルの損失がリアルタイムでモニターすることができる「生細胞」記録が可能な倒立顕微鏡を使用する。継続的なモニタリングのために、同一のパラメータ（露光時間、ゲイン、レーザ強度など ） を採用する。 <ol><li> EXPERを決定対照条件下で、目的のGFPタンパク質からの蛍光シグナルを観察することによりimentalパラメータ（ すなわち 、KBHは緩衝液単独）。 10〜20分間かけて信号強度の感知できる損失がないことを保証するためにコンピュータ駆動顕微鏡ゲイン、レーザ強度​​及び露光時間の設定を調整する。 注：信号強度は、絶対値ではなく、顕微鏡システムと各PIに対する利用可能な設定に基づいている。相対的な蛍光強度の変化を監視する。 </li></ol></li><li>また、プロテアーゼが続くジギトニンでの設定の時点で細胞を処理し、事前のイメージングのためのカバーガラスに取り付けるに細胞を固定。ジギトニンまたはプロテアーゼの0、30、60、120と300秒後添加で開始し、経験的に初期調査のためのステップ4と5の手順を以下の時点を決定します。 <ol><li>細胞（室温で20分）で完全に目を沈めるために十分な量の固定液（PBS中の3.7％パラホルムアルデヒド）を用いて固定する電子セル。 </li><li> PBSは、20 mMグリシン（3×5分）を含有する細胞をすすぐことによって、残留ホルムアルデヒドを急冷。 </li><li>カバーガラスから余分な液体を除去し、ガラス顕微鏡で50μlの取り付けメディアにカバースリップを反転させることによってマウントカバースリップは、撮影のためにスライドします。スライドを画像化する前に一晩乾燥することができます。 </li></ol></li><li>コンピューター制御蛍光顕微鏡でビデオ画像キャプチャ機能を使用して（適切なフィルタの下で使用されるフ​​ルオロフォアと互換設定）の蛍光顕微鏡画像を収集する。 </li><li>インキュベーション条件の関数としての蛍光シグナル強度を定量化する。個々のセルを囲む関心領域内の平均ピクセル強度（ROI）を取得します。 </li></ol>

<ol><li>Sevier, C. S., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+transfer+of+disulphide+bonds+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation and transfer of disulphide bonds in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).</li>
<li>Brodsky, J. L., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+and+quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum%3A+Recent+lessons+from+yeast+and+mammalian+cell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems.</a> Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).</li>
<li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+displaying+the+hydropathic+character+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.</a> J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).</li>
<li>Ott, C. M., Lingappa, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+protein+biosynthesis%3A+why+topology+is+hard+to+predict%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict.</a> J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).</li>
<li>Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+topological+analysis+of+integral+cytoplasmic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins.</a> The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).</li>
<li>Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+transmembrane+alpha-helices+in+prokaryotic+membrane+proteins%3A+the+dense+alignment+surface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method.</a> Protein Eng. 10, 673-676 (1997).</li>
<li>Geest, M., Lolkema, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+topology+and+insertion+of+membrane+proteins%3A+search+for+topogenic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).</li>
<li>Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+protein+topology+mapping+by+the+substituted+cysteine+accessibility+method+%28SCAM%28TM%29%29%3A+application+to+lipid-specific+membrane+protein+topogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis.</a> Methods. 36, 148-171 (2005).</li>
<li>Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+membrane+topology+by+glycosylation+site+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion.</a> J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Zamyatnin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li>
<li>Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+protease+protection+of+GFP+chimeras+to+reveal+protein+topology+and+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization.</a> Nat Methods. 3, 205-210 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning.+a+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning. a Laboratory Manual</a>. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+you+know+the+sex+of+your+cells%3F+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Do you know the sex of your cells? American journal of physiology.</a> Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).</li>
<li>Wang, H., Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+transmembrane+Ser%2FThr+kinase+complexes+with+protein+phosphatase-1+and+inhibitor-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2.</a> J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).</li>
<li>Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+protease+protection+reveals+the+topology+of+the+integral+membrane+protein+Lemur+Tyrosine+Kinase+2+%28LMTK2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2).</a> Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).</li>
<li>Tagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+trafficking+of+caveolar+domains+in+the+cell%3A+caveolae+as+stable%2C+cargo-triggered%2C+vesicular+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters.</a> J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+specifying+subunit+VIII+of+human+cytochrome+c+oxidase+is+localized+to+chromosome+11+and+is+expressed+in+both+muscle+and+non-muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues.</a> J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).</li>
<li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Curr Biol. 5, 635-642 (1995).</li>
<li>Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+phenotyping+of+secretory+and+nuclear+prion+proteins+associated+with+inherited+prion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases.</a> J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).</li>
<li>Ben-Gedalya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin-A-induced+prion+protein+aggresomes+are+dynamic+quality-control+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments.</a> J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).</li>
<li>Rogers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+of+the+Syrian+hamster+prion+protein+utilizing+chimeric+and+mutant+genes+in+a+vaccinia+virus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system.</a> J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).</li>
<li>Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+mislocalization+of+a+tail-anchored+GFP+redefines+the+identity+of+peroxisomal+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER.</a> Traffic. 4, 491-501 (2003).</li>
<li>Brandee, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mislocalization+and+degradation+of+human+P23H-Rhodopsin-GFP+in+knockin+mouse+model+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

膜タンパク質の正しい配向及びトポロジーは、その適切な機能のために不可欠である。膜タンパク質トポロジーを理解することの重要性にもかかわらず、そのようなデータが完全に欠けている多くのタンパク質が存在する。 FPPは、簡単かつ効率的な膜タンパク質のトポロジを決定する方法であり、最も研究室で行うことができるものを提供する。 FPPのアプローチは、タンパク質のトポロジーを決定するための以前の方法よりも有意な利点を提供する。例えば、再び関心31のタンパク質の様々なドメインを指向複数の抗体のパネルを有する必要はない。多くの場合、抗体のようなパネルは使用できません。これは、新たにクローン化されたタンパク質では特に顕著です。アッセイは単一細胞レベルで行うことができるように、下流の生化学は、タンパク質分解またはSDS-PAGEのように分析するために、タンパク質の大規模な生化学量が必要とされない。確かに、比較的少数のトランスフェクトされた細胞を明確に割り当てるために必要とされている目的のタンパク質にトポロジー。研究者はそのような上皮細胞や神経細胞などの細胞をトランスフェクトするのは難しいでトポロジーを評価している場合に重要です。タンパク...

形質膜、ならびに多数の細胞内膜二水性区画を分離する障壁として機能する。原形質膜の場合には、分離は、外部との間で、セルの内部にある。細胞内小器官のためには、細胞質および細胞小器官の内腔の間である。例えば、小胞体（ER）膜は、環境1を減少させる、サイトゾルからERのルーメン内酸化環境を分離する。膜タンパク質は、ER関連リボソーム上で合成され、ER膜2内の最終的なトポロジを達成している。タンパク質のための適切な膜配向とトポロジの買収は、彼らの正常な機能のために重要である。正しいトポロジーは、膜タンパク質の関連ドメインは、その結合パートナーと相互作用することができ、それは重要な翻訳後修飾が起こることができ、そして原形質膜タンパク質の場合、細胞と相互作用し、tは対応することができその環境をoを完全膜タンパク質の機能を理解するために、そのタンパク質は、それが含まれている膜、 すなわち 、その膜トポロジーに対して配向されているかを知ることが明らかに必須である。基本的な科学的知識の獲得に加えて、膜タンパク質のトポロジーを理解し、そのタンパク質表面の態様は異なる環境にさらされている膜タンパク質の薬理学的標的3の大部分を構成するので、臨床的意味をマークした。最近まで、時間とお金にかなりの投資を必要としていたか、手に入れるのが困難な試薬を必要とした膜タンパク質のトポロジーを決定することに近づく。 両方の実験とin silicoでのアプローチは、原形質膜内に存在するタンパク質の膜トポロジーを決定するために使用されてきた。 INDIVIの評価を疎水性に基づく膜貫通ドメインの最初の予測ので、デュアルアミノ酸3、多数の予測アルゴリズムは、インターネット上で現在利用可能であり、単に、タンパク質のアミノ酸配列の知識を必要とする。しかし、仮定は、多くの場合、そのようなモデリングプログラム、トポロジー4,5の不正確な割り当てにつながる可能性の仮定の中心である。これらのコンピュータベースの予測が暫定的に膜貫通領域を割り当てることができますしながら、また、彼らは常に、アミノまたはタンパク質のカルボキシ末端は細胞小器官内腔または細胞外装、細胞質内にあるかどうかを判断しないでください。計算能力を増加させ、さらにはと機械学習アルゴリズム6、そのようなデータの使用は、まだモデルであり、実験的に取得したデータを使用して検証する必要があります。膜トポロジーの直接の実験的決定は、その免疫反応性の評価は、細胞透過処理の前と後に行われているタンパク質、全体に分散既知のエピトープを有するモノクローナル抗体のパネルを使用して行われている。このアプローチは、目的のタンパク質のために利用できない場合があり、抗体のセットを必要とする。 別の戦略は、再び膜透過化の前と後の免疫反応性の決定に続いて、タンパク質の様々な場所にかかるのmycまたは赤血球凝集素（HA）などのエピトープタグを操作することである。免疫原性タグ、酵素タグ（アルカリホスファターゼを含む、βガラクトシダーゼ、またはβラクタマーゼ）に加えて、そのようなシステインスキャニングのような化学修飾は、すべての膜タンパク質トポロジー7,8を決定するために使用されてきた。原形質膜タンパク質のトポロジーマッピングのために使用するさらなる方法は、エピトープタグにわずかに異なるアプローチに依存している。この方法において、タグ配列は、N結合型グリコシル化コンセンサス配列NXS / Tである。そのような配列は、生合成経路のルーメン内に存在する場合、グリコシル化は、対管腔におけるタグの存在、発生するので細胞質ゾル区画に容易SDS-PAGEゲル上の質量シフトとして観察される。このようなアプローチは、multispanningイオンチャネルCFTR 9に適用されている。これらのすべてのアプローチが利用されてきたが、それらはすべてマニホールド構築物を作製し、配列決定するために分子生物学においてかなりの投資を必要とすることは明らかである。 細胞内小器官内に配置された膜貫通タンパク質に関するトポロジ情報を調べるには、より挑戦的であることが判明した。蛍光ベースの技術の適用は、しかしながら、多くの単純な膜トポロジーの決定をした。二分子蛍光相補性（BIFC）の技術がそのタンパク質10の蛍光特性を復元する、蛍光タンパク質の二つの非蛍光フラグメントとの相互作用に依存しています。最初に、生体内 10 でのタンパク質-タンパク質相互作用を決定するために説明したが、このアプローチは、利用されている植物細胞11内の膜タンパク質のトポロジーを決定する。しかし、このアプローチは、目的のタンパク質だけでなく、細胞質ゾルまたは細胞小器官の管腔を標的とする種々の融合タンパク質との融合タンパク質だけでなく生成を必要とする時間集約的でもあり、関心が常駐の細胞内タンパク質をメンブレンそれらの知識を必要とする。 膜タンパク質のトポロジーを決定する代わりに単純なアプローチは、12に記載されている。アッセイ、蛍光プロテアーゼ保護（FPP）は、GFPと目的の遺伝子との間の融合タンパク質の生成を必要とします。アプローチは、GFP部分への非特異的プロテアーゼの相対的なアクセス可能性に基づいている。 GFPは、細胞内小器官の内腔に存在することにより、タンパク質分解から保護されているか、細胞質ゾル中に存在することにより、タンパク質分解にさらされているかどうかに応じ。目的のタンパク質にGFP部分は細胞質に面している場合このように、それはにさらされるプロテアーゼ活性および蛍光シグナルが失わ。目的のタンパク質にGFP部分は（そのようなゴルジ内腔など）プロテアーゼから「保護された「環境に直面している場合には逆に、その後蛍光シグナルが持続します。 プロテアーゼが細胞に侵入することができますが、コレステロール結合薬物ジギトニンが使用されている細胞内膜コンパートメントを入力しないでください。コレステロールは、脊椎動物における支配的なステロールであり、具体的には細胞内区画に対する原形質膜に富んでいる。グリコシド毒素は、ジギトニンは、植物ジギタリスプレアから抽出される。ジギトニンは、選択膜permeabiliztion 14,16（ 図1）に導くコレステロールリッチな膜に対する親和性を有する。小さな細胞質ゾル成分の排出を可能にすることに加えて、ジギトニン透過化はまた、プロテイナーゼKまたはトリプシンなどの外因性分子の侵入を可能にする。 FPPプロトコルは、FACを利用しています原形質膜は、細胞コレステロール17の80％まで含んでtは、そのような非常に低いコレステロール含有量を有し、ER、ゴルジ体、エンドソーム、ミトコンドリアなどの他の細胞小器官、一方、無傷のままである14。原形質膜へのコレステロールの選択的な取り込みは、Sのような多様な真核生物種においてジギトニン依存性血漿膜透過の使用を可能にする、多くの真核細胞において観察されている人間14,18に出芽酵母 。 FPPアッセイは、（a）は、タンパク質が膜結合/または関連する細胞質ゾルおよび膜タンパク質の（b）の領域で自由に拡散可能であるかどうか、サイトゾルまたは細胞小器官の内腔に面する決定する、簡単、迅速、かなり強固な手段を提供する。膜タンパク質は、複数の方向を持っている必要があり、信号が支配的なフォームから生じることになるとマイナー形式は検出されません。関心上のタンパク質にGFP部分の付加は、その機能に影響を与え得るという懸念があり得るしながら/または細胞内局在、これは実際よりも実際はより理論的です。実際、多くの研究は、GFPタグがタンパク質19,20の特性を変更しないことを示している。

<table><tbody><tr><td>ジジトニン</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>Σ</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Σ</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Cav1-GFP</td><td>Addgene</td><td>44433</td><td></td></tr><tr><td>pAcGFP-1 ゴルジ</td><td>クロンテック</td><td>632464</td><td></td></tr><tr><td>ポリリジン</td><td>Σ</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>封入剤</td><td>Dako</td><td>cS704</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（fpp）

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

内在性膜タンパク質の正しいトポロジーと配向は、その適切な機能のために不可欠ですが、そのような情報は多くの膜タンパク質では確立されていません。蛍光プロテアーゼ保護(FPP)と呼ばれる簡単な技術が紹介されており、これにより、生細胞内の膜タンパク質のトポロジーを決定できます。この技術は、膜タンパク質の様々なドメインに対する複数の抗体の利用可能性を必要とせず、大量のタンパク質を必要とせず、生細胞に対して実施できるという点で、タンパク質トポロジーを決定するための他の方法に比べて多くの利点を有する。FPP法は、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付き膜タンパク質の分解に対するプロテアーゼの空間的に閉じ込められた作用を利用して、その膜トポロジーと配向を決定します。このシンプルなアプローチは、さまざまな細胞タイプに適用でき、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、エンドソーム/リサイクルシステムのコンポーネントなど、さまざまな細胞内小器官の膜タンパク質の配向を決定するために使用できます。N末端またはC末端にGFP融合でタグリングされた膜タンパク質は、目的の細胞で発現し、界面活性剤ジギトニンを用いた選択的透過化を受けます。ジジトニンは、細胞内小器官をそのまま残しながら、細胞膜を透過化する能力を持っています。サイトゾルに曝露されたGFP部分は、プロテアーゼの適用により選択的に分解することができますが、オルガネラの内腔に存在するGFP部分はプロテアーゼから保護され、無傷のままです。FPPアッセイは簡単で、迅速に結果を得ることができます。

細胞膜透過処理 効率的な形質膜透過化は、可溶性の蛍光タンパク質（ 例えば 、GFP、DsRedを）する（ステップ4）を用いて決定される。これらのタンパク質は、細胞内で発現された場合、細胞質ゾル中で自由に拡散しており、原形質膜が（ 図2）を用いてジギトニン透過処理されたときに失われる。蛍光シグナルの完全な消失は、ジギトニンアプリケーションの10〜60秒以内に発生する必要があります。目的のタンパク質は、細胞内小器官に関連していることの確認は、ジギトニン透過化以下の蛍光信号の保持を記録することによって達成される。 プロテアーゼトリートメント 細胞中の蛍光タンパク質の関心対象のタンパク質と蛍光タンパク質（GFP、YFP など ）（工程1）及び発現との間の蛍光キメラ生成の成功に続いて（ステップ2）、治療<html>プロテアーゼによる透過性化細胞の蛍光団（とそれに隣接するタン...

ここでは、生細胞内の内在性膜タンパク質の配向とトポロジーを決定するためのプロトコルを提示します。このシンプルなプロトコールは、目的タンパク質とGFPとの間のキメラの選択的プロテアーゼ感受性に依存しています。

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

この手順の全般的な目的は、膜貫通タンパク質のトポロジーを決定することです。これは、目的のタンパク質を細胞内で発現させ、緑色蛍光タンパク質（GFP）を膜タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合させることで達成されます。対照として、RFPなどの可溶性蛍光タンパク質を発現させることができます。次に、細胞膜に選択的な透過処理を行います。界面活性剤のdigを用いて、可溶性蛍光タンパク質を細胞外へ流出させ、一方で膜結合性蛍光タンパク質を細胞内に保持させます。最終ステップとして、透過処理した細胞にプロテアーゼを添加し、蛍光シグナルの保持または消失を判定します。最終的に、蛍光顕微鏡イメージングを用いて観察される蛍光強度の変化から、内在性膜タンパク質のトポロジーと配向性を明らかにします。エピトープマッピングなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、多くの特殊な設備や、入手が困難な様々な試薬を必要としない点にあります。この方法は、内在性膜タンパク質のどのドメインが細胞質に位置し、どのドメインが小胞体やエンドソームなどの細胞小器官の腔内に位置しているかという、膜タンパク質生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。テキストプロトコルに記載されている通り、蛍光タンパク質KYの生成および検証から本手順を開始してください。次に、脂質、ウイルス、またはエレクトロポレーションに基づく技術を含む、標準的な高効率・低毒性のトランスフェクション法を用いて、蛍光タンパク質KYをヒト胚性腎細胞（HEK 2 93細胞）にトランスフェクトし、一過性または安定的な発現を誘導させます。その後、細胞をポリリシンコートしたカバーガラス上に播種します。細胞を、二酸化炭素制御が可能な組織培養インキュベーター内にて、37 °Cの適切な組織培養培地で5時間から48時間維持してください。エピ蛍光顕微鏡を用いて、GFP融合タンパク質の発現を細胞でモニタリングします。通常、GFPの固有の蛍光信号は、トランスフェクション後24〜72時間以内に最大に達します。蛍光信号が最大レベルに達した際に細胞を使用してください。また、標的タンパク質またはGFP部位に対する抗体を用いた免疫ブロット解析によっても、タンパク質の発現をモニタリングすることが可能です。まず、細胞処理のための重力駆動型灌流システムのセットアップを行います。ポリエチレンチューブを用いて、独立したリザーバーとバスにある単一の出口を備えたマニホールドに接続した50 mLシリンジを、各溶液用に準備します。バスの体積を一定に維持するために吸引ピペットを配置し、灌流リザーバーを手動で切り替えることで溶液交換を行い、細胞膜の透過処理を実施します。まず、細胞から細胞培養液を除去します。細胞を1分間ずつ3回洗浄します。KHMバッファー中でカバーガラスを蛍光顕微鏡のステージ上に置き、最初の画像を取得します。これは、細胞膜を選択的に透過させる前のコントロールとして、非透過性の画像を代表するものです。KHM緩衝液にdigitoninを添加して細胞に加え、緩衝液とdigitoninの混合液を用いて5 mL/minの速度で10～60秒間、細胞を還流させます。可溶性GFPまたはRFP分子の発現を確認することで、形質膜が適切に透過したかを容易に判断できます。これらの分子は膜透過後、速やかに細胞外へ拡散します。次に、目的のGFPタンパク質キメラが膜に組み込まれていることを、digitoninによる形質膜の透過後も蛍光シグナルが細胞内に保持されているかを確認することで判定します。次に、テキストプロトコルで言及されているミトコンドリアタンパク質などのオルガネラ特異的な蛍光タンパク質を発現させます。前述と同様に、最適な発現条件を決定してください。長時間の観察においても細胞内オルガネラの形態が一定に保たれていることを確認し、使用した細胞株に対してタグおよび濃度が適切であることを検証してください。細胞をKHMバッファーで洗浄した後、プロテアーゼを細胞に直接添加します。重力駆動型の灌流システムを用いて、5 mL/minの流速で灌流し、試料を常に浸漬させます。次に、蛍光信号が持続するか、あるいは減衰するかを判定します。コンピュータ制御の蛍光顕微鏡のビデオ画像キャプチャ機能を用いて、適切なフィルターセットで蛍光顕微鏡写真を撮影してください。インキュベーション条件に応じた蛍光信号強度の定量化を行います。個々の細胞を囲む関心領域（ROI）内の平均ピクセル強度を算出します。30〜60秒間で初期信号強度の90%以上の減少が見られる場合は、GFPタンパク質kyのタンパク質分解分解に一致します。ジジットインの添加後、10〜60秒以内に可溶性蛍光信号が完全に消失する必要があります。目的タンパク質が細胞内オルガネラに関連していることの確認は、ジギトン処理および透過化後の蛍光シグナルの保持を確認することで行われます。膜結合性キナーゼLTK2のカルボキシル末端をGFPに融合させ、一過性に発現させました。Proteinase Kの添加後、LTK2-GFPのシグナルが速やかに消失したことから、LTK2のカルボキシル末端は細胞質内に位置していることが示されました。Cavi-GFPは、細胞質ドメインにGFP部位が結合した細胞膜タンパク質である。LTK2と同様に、Cavi-GFPからのシグナルはジギトニンに対して不感性であるが、その後のプロテアーゼKの添加およびジギトニン透過処理には感受性を示す。DS-red-mitoは、ジギトニン透過処理後、シトクロムcオキシダーゼ由来のミトコンドリア標的配列に融合した赤色蛍光タンパク質をコードしている。DS-red-mitoに関連する蛍光は安定したままである。これは、蛍光物質がミトコンドリア内に存在し、細胞質にさらされていないことと一致している。GPIアンカー型プリオンタンパク質に黄色蛍光タンパク質を結合させた例のように、膜タンパク質に付加された蛍光部位が細胞外を向いている場合、予想通り、事前のジギトニンによる膜透過処理を必要とせずに、プロテイナーゼ処理によって蛍光シグナルが速やかに消去されるはずです。この構築物を発現している細胞では、プロテイナーゼ処理後、細胞外の蛍光シグナルが速やかに消失しました。この手法を習得すれば、適切に実施した場合に1〜2時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、目的の膜タンパク質のトポロジーを決定する方法について、より深い理解を得ることができます。

determining-membrane-protein-topology-using-fluorescence-protease

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は単一細胞の蛍光を用いて立体構造変化の部位特異的解析と並んで膜タンパク質のイオン輸送の動態を測定する方法を説明します。この手法は、イオンチャネル、トランスポーター、イオンポンプに適応可能であり、タンパク質サブユニット間の距離の制約を決定するために利用することができます。...

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで</em

このビデオでは、界面活性剤可溶化後の大腸菌における緑色蛍光タンパク質(GFP)融合膜タンパク質の安定性をスクリーニングするための蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー技術を示しています。サイズ排除プロファイルで対称的なピークを示し、遊離GFPがほとんどまたはまったくないタンパク質は、分解と凝集が最小限に抑えられた精製タンパク質を示しており、その後、構造機能解析のために選択できます。...

蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー:界面活性剤の可溶化に伴う蛍光膜タンパク質の完全性を同定する技術

生化学的ア ​​プローチは、膜タンパク質のin vivoでのタンパク質-タンパク質相互作用（PPI）を識別するために記載されている。この方法は、タンパク質架橋、アフィニティー精製および質量分析を組み合わせて、ほぼすべての細胞型または生物に適用可能である。このアプローチでは、一過性のPPIのさえ識別が可能となる。...

膜脊柱：膜タンパク質のタンパク質 - タンパク質相互作用を識別するために、生化学的ツールインビボ

この論文は、脂質近位環境におけるin vitroでの内在性膜タンパク質とさまざまなパートナー因子との相互作用と集合を評価する方法を説明しています。...

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成しますインビトロ

ここでは、末梢関連タンパク質の蛍光タグ付きのプラズマ膜協会のレベルの定量的分析を実行するためのプロトコルを提案する.メソッドは、膜の計算の分解、細胞膜蛍光マーカーの付いた信号の細胞質成分に基づいています。...

細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

このプロトコルは、細胞環境において受容体に結合するアデニンヌクレオチドをリアルタイムで測定する方法を提示する。結合は、トリニトロフェニルヌクレオチド誘導体と非標準的な蛍光アミノ酸で標識されたタンパク質との間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)として測定されます。...

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

蛍光漏れアッセイは、ペプチド/膜相互作用の調査を可能にする簡単な方法であり、いくつかの生物学的プロセスへの関与、特に細胞内転位プロセス中に細胞透過性ペプチドが二重層のリン脂質を乱す能力を理解する。...

細胞透過性ペプチドによる膜不安定化を調べる蛍光漏れアッセイ

本プロトコルは、膜タンパク質に対して蛍光サイズ排除クロマトグラフィー(FSEC)を実行して、下流の機能的および構造的分析のためにそれらの品質を評価する手順を説明しています。界面活性剤可溶化および界面活性剤フリー条件下でいくつかのGタンパク質共役受容体(GPCR)について収集された代表的なFSEC結果が提示されています。...

蛍光サイズ排除クロマトグラフィーによる膜タンパク質品質の迅速評価(英語)

本記事では、固体支持脂質二重層における単一タンパク質追跡用のサンプル作成方法を詳しく説明します。また、単一分子感度と高速フレームレートを持つシンプルな蛍光顕微鏡の説明もします。最後に、単一タンパク質の軌跡抽出手順を概説します。...

蛍光顕微鏡を用いた脂質二重層中の単一タンパク質の追跡

学ぶ膜タンパク質のトポロジー決定法。GFPキメラタンパク質を発現させ、選択的プロテアーゼ処理と蛍光顕微鏡観察により、膜貫通タンパク質の細胞内配向を正確に解析する手法を習得できます。

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

さらに動画を探す