迅速な免疫標識と合わせてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、細胞特異的な亜集団からのRNAの単離

この手順の全体的な目標は、サンプルのRNA完全性を維持しながら、レーザーキャプチャマイクロダイセクションまたはLCMによって単離されたマウス脳細胞集団の迅速な免疫標識を実証することです。これは、最初に解剖された脳組織を急速に凍結することによって達成されます。次に、脳をRNAフリーのガラス顕微鏡スライド上で細い切片に切断し、迅速な免疫染色で治療します。

最後に、目的の細胞集団をLCMを使用して単離します。最終的には、迅速な染色とそれに続くレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより、実験細胞サンプル中の目的遺伝子の発現の変化を同定することができます。蛍光活性化細胞選別のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、私たちの技術では、空間分解能が維持され、周囲の組織からESの特定の細胞を解決できることです。

一般的に、この手順にはサンプル中のRNAの完全性を維持するために迅速に作業する必要があるいくつかの重要なステップが含まれているため、このスミス細胞に不慣れな人は円を描くでしょう。切片作製用のサンプルを準備するには、生後1日目のマウスの脳を氷冷L15培地で犠牲から2分以内に解剖します。次に、脳を切片化に適した向きで埋め込み型に配置し、型に凍結組織を充填し、培地を埋め込みます。

その後、すぐに試料を液体窒素で凍結し、スナップ凍結から30秒以内に摂氏マイナス80度で保管します。次に、メンブレンコーティングされたスライドガラスを表面のRNA除染で処理し、微量のRNAを除去します。それらをDEPC水ですすぎ、スライドが乾いたら自然乾燥させます。

クライオスタットのチャンバー温度をマイナス20°Cに設定し、凍結したサンプルをクライオスタットに移します。各サンプルについて、凍結したブロックを試料クランプに取り付け、試料を10ミクロンの厚さでスライスし、切片をメンブレンコーティングされたスライドに集めます。切片を少なくとも10分間乾燥させた後、疎水性バリアペンを使用して組織を囲みます。

約10秒後、スライドを新たに調製した冷固液にマイナス20°Cで5分以内置きます。次に、スライドを表面のRNA除染溶液で前処理した清潔なトレイに移します。まず、スライドを一度振って余分な固定剤を取り除き、6〜8回のクイックディップでスライドをフリックします。

余分なD-E-P-C-P-B-Sを除去するには、各切片に200マイクロリットルの一次抗体溶液を添加します。室温で10分後、スライドをD-E-P-C-P-B-Sに3回すばやく浸して洗浄し、1回フリックして余分な洗浄液を取り除きます。次に、サンプルを200マイクロリットルの二次抗体溶液に室温で6分後にインキュベートします。

先ほど示したように、スライドをD-E-P-C-P-B-Sで洗浄し、新たに調製したBC溶液で4分間インキュベートした後、新たに調製したDAB196マイクロリットルと4マイクロリットルのRNA阻害剤を洗浄混合します。溶液を切片に加える直前に、DABを1〜2分間発生させ、続いてA-D-E-P-C-P-B-S洗浄を行います。次に、無水エタノールで数秒間インキュベートして切片を脱水し、スライドをフリックして乾かしてLCMに進みます。

次に、RNA抽出キットからの50マイクロリットルの溶解バッファーを収集チューブキャップに入れます。次に、サンプル側をキャップに向けて、スライドを1枚顕微鏡の下に置きます。サンプルに最適な倍率を選択し、目的の細胞を見るために焦点を調整します。

次に、切断領域を定義し、レーザーで切断を開始します。解剖した材料を収集チューブに集め、採取した細胞を摂氏42度で30分間キャップします。この間に、RNA抽出キットのRNA精製カラムを250マイクロリットルのコンディショニングバッファーでプレコンディショニングします。

次に、50マイクロリットルのエタノールをカラム上の溶解細胞にロードし、カラムを16, 000Gおよび室温で2分間遠心分離し、続いて洗浄緩衝液で2回すすぎます。最後に、RNAの品質をテストするために2マイクロリットルを空けて、最小推奨容量の11マイクロリットルのRNAフリー水でRNAを溶出します。この迅速な免疫標識手順により、実験用RNAの完全性を維持しながら、目的の細胞を可視化することができます。

実験によっては、先ほど実証したようにLCMを使用して、単一細胞またはより大きな関心領域を分離できます。分解されたRNAは、ダウンストリーム解析の品質に大きく影響します。したがって、各サンプルはマイクロ流体Xベースのプラットフォームバイオアナライザーでさらに処理され、示したように単離されたRNAの完全性の定量化と検証が可能になります。

たとえば、ここでは、典型的なバイオアナライザーの結果は、劣化しているものと良好な品質の両方を示しています。RNAサンプルが示されています。実際、デジタルゲルおよびエレクトロフェログラムは、この手順に従ってRNAを保護するために各溶液中にラーゼ阻害剤を使用することの重要性を示しており、高品質のRNAは、RNAシーケンシングMICROARRAYまたはQ-R-D-P-C-Rを含むダウンストリームアプリケーションのためにさらに処理することができ、例えば、これらのグラフでは、中脳切片に対するマイクロ解剖サンプル中のTHおよびA AのDC遺伝子発現の平均濃縮は170倍以上であると決定された。

この手順を試みる際には、非常に迅速に、RNAフリーの材料を使用して作業することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、任意の組織から特定の細胞集団を分離する方法を十分に理解できるはずです。