迅速な免疫標識と合わせてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、細胞特異的な亜集団からのRNAの単離
2015年4月11日
特定の組織中の細胞のサブセットの遺伝子発現解析は、主要な課題である。この記事では、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで迅速な免疫標識法を組み合わせることにより、特定の細胞集団から高品質のトータルRNAを分離する方法について説明します。
この手順の全体的な目標は、サンプルのRNA完全性を維持しながら、レーザーキャプチャマイクロダイセクションまたはLCMによって単離されたマウス脳細胞集団の迅速な免疫標識を実証することです。これは、最初に解剖された脳組織を急速に凍結することによって達成されます。次に、脳をRNAフリーのガラス顕微鏡スライド上で細い切片に切断し、迅速な免疫染色で治療します。
最後に、目的の細胞集団をLCMを使用して単離します。最終的には、迅速な染色とそれに続くレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより、実験細胞サンプル中の目的遺伝子の発現の変化を同定することができます。蛍光活性化細胞選別のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、私たちの技術では、空間分解能が維持され、周囲の組織からESの特定の細胞を解決できることです。
一般的に、この手順にはサンプル中のRNAの完全性を維持するために迅速に作業する必要があるいくつかの重要なステップが含まれているため、このスミス細胞に不慣れな人は円を描くでしょう。切片作製用のサンプルを準備するには、生後1日目のマウスの脳を氷冷L15培地で犠牲から2分以内に解剖します。次に、脳を切片化に適した向きで埋め込み型に配置し、型に凍結組織を充填し、培地を埋め込みます。
その後、すぐに試料を液体窒素で凍結し、スナップ凍結から30秒以内に摂氏マイナス80度で保管します。次に、メンブレンコーティングされたスライドガラスを表面のRNA除染で処理し、微量のRNAを除去します。それらをDEPC水ですすぎ、スライドが乾いたら自然乾燥させます。
クライオスタットのチャンバー温度をマイナス20°Cに設定し、凍結したサンプルをクライオスタットに移します。各サンプルについて、凍結したブロックを試料クランプに取り付け、試料を10ミクロンの厚さでスライスし、切片をメンブレンコーティングされたスライドに集めます。切片を少なくとも10分間乾燥させた後、疎水性バリアペンを使用して組織を囲みます。
約10秒後、スライドを新たに調製した冷固液にマイナス20°Cで5分以内置きます。次に、スライドを表面のRNA除染溶液で前処理した清潔なトレイに移します。まず、スライドを一度振って余分な固定剤を取り除き、6〜8回のクイックディップでスライドをフリックします。
余分なD-E-P-C-P-B-Sを除去するには、各切片に200マイクロリットルの一次抗体溶液を添加します。室温で10分後、スライドをD-E-P-C-P-B-Sに3回すばやく浸して洗浄し、1回フリックして余分な洗浄液を取り除きます。次に、サンプルを200マイクロリットルの二次抗体溶液に室温で6分後にインキュベートします。
先ほど示したように、スライドをD-E-P-C-P-B-Sで洗浄し、新たに調製したBC溶液で4分間インキュベートした後、新たに調製したDAB196マイクロリットルと4マイクロリットルのRNA阻害剤を洗浄混合します。溶液を切片に加える直前に、DABを1〜2分間発生させ、続いてA-D-E-P-C-P-B-S洗浄を行います。次に、無水エタノールで数秒間インキュベートして切片を脱水し、スライドをフリックして乾かしてLCMに進みます。
次に、RNA抽出キットからの50マイクロリットルの溶解バッファーを収集チューブキャップに入れます。次に、サンプル側をキャップに向けて、スライドを1枚顕微鏡の下に置きます。サンプルに最適な倍率を選択し、目的の細胞を見るために焦点を調整します。
次に、切断領域を定義し、レーザーで切断を開始します。解剖した材料を収集チューブに集め、採取した細胞を摂氏42度で30分間キャップします。この間に、RNA抽出キットのRNA精製カラムを250マイクロリットルのコンディショニングバッファーでプレコンディショニングします。
次に、50マイクロリットルのエタノールをカラム上の溶解細胞にロードし、カラムを16, 000Gおよび室温で2分間遠心分離し、続いて洗浄緩衝液で2回すすぎます。最後に、RNAの品質をテストするために2マイクロリットルを空けて、最小推奨容量の11マイクロリットルのRNAフリー水でRNAを溶出します。この迅速な免疫標識手順により、実験用RNAの完全性を維持しながら、目的の細胞を可視化することができます。
実験によっては、先ほど実証したようにLCMを使用して、単一細胞またはより大きな関心領域を分離できます。分解されたRNAは、ダウンストリーム解析の品質に大きく影響します。したがって、各サンプルはマイクロ流体Xベースのプラットフォームバイオアナライザーでさらに処理され、示したように単離されたRNAの完全性の定量化と検証が可能になります。
たとえば、ここでは、典型的なバイオアナライザーの結果は、劣化しているものと良好な品質の両方を示しています。RNAサンプルが示されています。実際、デジタルゲルおよびエレクトロフェログラムは、この手順に従ってRNAを保護するために各溶液中にラーゼ阻害剤を使用することの重要性を示しており、高品質のRNAは、RNAシーケンシングMICROARRAYまたはQ-R-D-P-C-Rを含むダウンストリームアプリケーションのためにさらに処理することができ、例えば、これらのグラフでは、中脳切片に対するマイクロ解剖サンプル中のTHおよびA AのDC遺伝子発現の平均濃縮は170倍以上であると決定された。
この手順を試みる際には、非常に迅速に、RNAフリーの材料を使用して作業することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、任意の組織から特定の細胞集団を分離する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
この記事では、マウス脳組織の特定の細胞集団から高品質の総RNAを分離する方法を実証します。迅速な免疫標識とレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）を組み合わせることで、研究者はRNAの完全性を維持しながら遺伝子発現の変化を特定できます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 遺伝子発現解析
背景
- 特定の細胞集団からRNAを分離することは困難です。
- RNAの完全性を維持することは、正確な遺伝子発現解析にとって重要です。
- 既存の方法は空間分解能を損なう可能性があります。
- LCMは周囲の組織から細胞を正確に分離することを可能にします。
研究の目的
- 脳細胞のための迅速な免疫標識技術を実証すること。
- 分離プロセス中にRNAの完全性を維持すること。
- 特定の細胞集団における遺伝子発現の変化を特定すること。
使用した方法
- 切断した脳組織の急速凍結。
- RNAフリーのスライドに脳を薄い切片に切ること。
- 切片の迅速な免疫染色。
- LCMを用いた対象細胞集団の分離。
主な結果
- 特定の脳細胞集団からのRNAの成功的な分離。
- 他の方法と比較して空間分解能を維持。
- 実験サンプルにおける遺伝子発現の変化を特定。
- 迅速な免疫標識技術の利点を実証。
結論
- 組み合わせた技術は遺伝子発現研究のためのRNAの品質を向上させます。
- 空間分解能を維持することは正確な分析にとって重要です。
- この方法は神経科学研究における様々な細胞集団に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolating high-integrity RNA from specific cell subpopulations enables precise target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach supports phenotypic screening and assay development by providing disease-relevant systems with spatial resolution. It enhances predictive confidence in lead identification by linking gene expression changes to defined cellular contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in defined dopaminergic cell populations.
- Operational Value: Provides biologically de-risked target validation through spatial isolation of cells of interest.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking gene expression changes to specific cell types with >170-fold enrichment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream RNA-seq, microarray, or qRT-PCR applications.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through rapid immunolabeling and LCM isolation.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by maintaining RNA integrity and spatial resolution.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery through preclinical validation using disease-relevant brain tissue models.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development via quantified RNA integrity and expression profiling.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on RNA quality and target engagement in isolated subpopulations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation to lead identification by enabling mechanistic de-risking through spatially resolved gene expression analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in dopaminergic cell populations.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides RNA integrity measurements and gene expression readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant mouse brain models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating any cell population across tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of RNA isolation workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on subpopulation-specific data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, immunolabeling, and laser capture microdissection.
- Needs cryostat, LCM system, RNA-free slides, and RNA inhibition reagents.
- Demands cross-team standardization for rapid processing to maintain RNA integrity.
- Requires adaptation considerations for different tissue types and cell markers.
- Limited by RNA degradation risk if procedural timing is not maintained.
