Name: 高周波超音波を用いて、マウス胚におけるコントラストイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶマイクロバブル注入法によるマウス胚の血管造影イメージング。高周波超音波を用いて灌流パラメータと標的結合を評価し、発生生物学における血管動態研究に貢献します。

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この作業は、カナダ国立がん研究所のテリー・フォックス・プログラムの支援を受けました。

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<li>Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tumor+angiogenesis+using+real-time+motion-compensated+contrast-enhanced+ultrasound+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging.</a> Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).</li>
<li>Larina, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+blood+flow+in+mammalian+embryos+using+doppler+swept-source+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomed.Opt%22%5BJournal%5D)">Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography.</a> J.Biomed.Opt. 13 (6), 060506-06 (2008).</li>
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F.S. フォスターは、VisualSonics Inc.のコンサルタントとしての役割を認めています。

超音波造影剤は、後期妊娠マウス胚および非線形コントラスト画像に注射し、灌流パラメータを測定するために取得し、結合マイクロバブルを標的とした。胚の血管系内のマイクロバブルの成功イメージングは​​、多くの要因、最初のもの胚の生存率に依存していた。すべての機器および装置は、注入の開始に子宮から胚を単離するために必要な時間を最小にするために、事前に調製した。胚性マウスに麻酔への単一または反復暴露の影響が詳細に研究されていないため、母親で麻酔の使用は犠牲16の前に回避された。胚単離の間には、卵黄嚢の損傷を防止し、胚を頻繁にリフレッシュ胚培地中で、常に冷蔵保管したことを確認することが重要であった。注射の前にし、ピン止め中に胚を視るときに、主要な卵黄船はlikelihooを制限することが回避された致死可能性出血のD、。我々は、胚を回復するとき、それは最初に前後に動いて胚に超音波ジェルを塗布し、ピンセットを用いて任意の大きな気泡を除去する前に、PBSで胎盤、次いで胚をカバーするために最善であることがわかった。ペトリ皿の残りの部分は、次いでPBSで満たした。ゲル及びPBSの使用は、画像品質に影響を与える可能性がある胚と変換器との間の...

造影超音波イメージングは​​、血管環境を視覚化し、特徴付けるために、マイクロバブル造影剤を利用する。これらの物質は、微小循環、血管分布および心血管機能の非侵襲的評価を可能に。また、気泡表面の改質が可能な血管イベントの分子の超音波イメージングを行う血管形成、アテローム性動脈硬化症および炎症1,2の前臨床用途で実証されるように、内皮細胞のバイオマーカーに結合する標的化マイクロバブルをもたらすことができる。造影超音波は、したがって、健康と病気の血管の状態3-5に影響を与える複雑かつ多様な環境を識別するために使用することができる。 年の過去数には、マイクロバブルイメージングの有用性への関心は汎用性の高いマウス胚モデルに拡張しました。哺乳類の発生のモデルとして、胚の血管系へのマイクロバブルの導入は、生理的な強化開発循環系（ 例えば 、血流量、心拍出量）およびトランスジェニック例での研究と心疾患6,7の変異マウスモデルをターゲットとは、遺伝的要因が心血管機能を変化させる方法への洞察をもたらすことができる。実際には、胚の脳血管系の定量的および定性的な二次元分析は、既に8を達成している。さらに、マウス胚は、生体内での血管マーカーに標的マイクロバブルの結合を調べるための優れたモデルとして提示します。 Bartelle ら 9は 、例えば、Biotag-BirAをトランスジェニック胚に結合し、血管構造を検討対象と評価するために胚心臓の心室にアビジンマイクロバブルを導入しています。診療所にこの技術を翻訳において重要なベンチマーク - ヘテロ接合およびホモ接合性マウスモデルの生成は、分子の超音波の定量的性質を規定することを目的と腫瘍モデル研究のための代用として使用することができる。 8-10を介して露出し、単一の胚に心臓内注射を経由して胎児の血液循環に導入される。 子宮内注射では 、しかし、多くの課題に直面しています。これらは、注射の指導、母親と体外胚の動きに対抗する必要性、母親における血行動態の生存率の維持および11の出血による麻酔の合併症の長期的影響に対処体外胚を、含む。従って、調査の目的は、単離されたリビング後期胚12にマイクロバブルを注入するための技術を開発することであった。このオプションは、噴射制御やポジショニング、障害物のない撮像面の再現性、および単純化された画像解析と定量化の面でより多くの自由を提供しています。 本研究では、foの生きているマウスの胚にマイクロバブルを注入するための新規な手順を概説Rマイクロバブル速度論的挙動を研究するとの目的は、内因性の内皮表面マーカーに結合するマイクロバブルをターゲットに勉強。非線形コントラスト特有の超音波イメージングは​​、ピークエンハンスメント（PE）、ウォッシュアウト速度および時間孤立E17.5胚において（TTP）をピークに含む基本的な灌流パラメータの数を測定するために使用される。我々はまた、活性な血管新生13の部位で血管内皮細胞におけるその高い発現をエンドグリンは、臨床的に関連する標的で機能するトランスジェニックマウスモデルの胚グリン損失分子音波の定量的性質を評価するための胚のモデルの妥当性を実証する。エンドグリンを標的（MB E）の付着、ラットアイソタイプIgGを2コントロール（MB C）および非標的（MB U）マイクロバブルは、ヘテロ接合グリン（ 工学 +/-）で評価され、ホモ接合エンドグリン（ 工 + / +）の胚を表す。目標とビンディの分析ngは、分子の超音波は、エンドグリン遺伝子型を区別し、定量化可能な分子の超音波レベルに受容体密度に関連することが可能であることを明らかにする。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td colspan="4">Antibodies (ビオチン化、eBioscience) &#8212;抗体の選択は実験によります</td></tr><tr><td><ul style="padding:0px;margin:0px"><li>rat isotype IgG2 control</li></ul></td><td>eBioscience</td><td>13-4321-85</td><td>この抗体とマイクロバブルの組み合わせは、実験的コントロールとしてしばしば必要とされます&nbsp;</td></tr><tr><td><ul style="padding:0px;margin:0px"><li>biotin anti-mouse CD309</li></ul></td><td>eBioscience</td><td>13-5821-85</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化ラットMJ 7/18 マウスエンドグリン抗体</td><td>ハウスハイブリドーマ</td><td></td><td>外部抗体も適切かもしれません: 私たちは&nbsp; 過去に eBioscience (13-1051-85) を使用しました</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">胚培地</td></tr><tr><td><ul style="padding:0px;マージン:0px"><li>500mlダルベッコ'のモディファイドイーグル」s 高グルコースの培地</li></ul></td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td><ul style="padding:0px;margin:0px"><li>50 ml Fetal Bovine Serum</li></ul></td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>lot #</td></tr> <tr><td>7592456<ul style="padding:0px;margin:0px"><li>Hepes</li></ul></td><td>Gibco</td><td>15630</td><td>5 ml, 1 M</td></tr><tr><td><ul style="padding:0px;margin:0px"><li>ペニシリン-ストレプトマイシン</li></ul></td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 &#956;g 連鎖球菌エ</td></tr><tr><td>タノール、70%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>76240</td><td>4%</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 [1x]&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>1x, w/o 塩化カルシウム & 塩化マグネシウム</td></tr><tr><td>妊娠中マウス, CD-1</td><td>Charles River Laboratories Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9%塩化ナトリウム(生理食塩水)</td><td>Hospira</td><td>0409-7984-11</td><td></td></tr><tr><td>超音波造影剤、ターゲットレディおよびノンターゲット</td><td>マイクロマーカー;VisualSonics株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超音波ゲル(アクアソニック100、無色)</td><td>CSP Medical</td><td>133-1009<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>細胞培養プレート(4):&nbsp; 100&nbsp;x&nbsp;20&nbsp;mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-772-22</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート (12) : 60&nbsp;x&nbsp;15&nbsp;mm</td><td>Sigma</td><td>D8054</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Sorvall Legend RT 遠心分離機&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>円錐管、50 ml BD Falcon</td><td>VWR</td><td>21008-938</td><td></td></tr><tr><td>希釈剤</td><td>ベックマン・コールター</td><td>アイソトン II 希釈液、8448011</td><td></td></tr><tr><td>解剖はさみ (ワーグナー)</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>ワーグナー 14068-12</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 (2)、デュモン SS (0.10 x 0.06 mm)</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>鉗子、破片</td><td>VWR</td><td>25601-134</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーカー、2 L(グリフィンビーカー)</td><td>VWR</td><td>89000-216</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー、1 x 90&nbsp;mm GD-1 フィラメント付き</td><td>成重</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>ガラス針引き手</td><td>成重</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>グローブ</td><td>アンセル</td><td>4002</td><td></td></tr><tr><td>肉眼解剖学プローブ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10088-15</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>VWR</td><td>89090-994</td><td></td></tr><tr><td>アイスバケツ</td><td>コールパーマー</td><td>RK 06274-01</td><td></td></tr><tr><td>イメージングプラットフォーム</td><td>VisualSonics株式会社</td><td>統合レールシステム</td><td></td></tr><tr><td>光源、光ファイバー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-562-36</td><td>理想的には調整可能なアーム</td></tr><tr><td>ルアー(12)、ポリプロピレンとげのある女性&frac14;-28 UNFスレッド</td><td>コールパー</td><td>マー45500-30</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ超音波システム、高周波</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>Vevo2100</td><td></td></tr><tr><td>ニードル、21ゲージ&nbsp;(1インチ)</td><td>VWR</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>粒度分析装置</td><td>ベックマン・コールター</td><td>マルチサイザー 3 コールター カウンター</td><td></td></tr><tr><td>穴あきスプーン (モリア)</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>MC 17 10373-17</td><td></td></tr><tr><td>ピン (6)、黒色アルマイト 微細 0.15 mm</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>ピペッター [2-20 &#956;L、20-200 &#956;L、100-1,000 &#956;l]</td><td>Eppendorf</td><td>Research Plus&nbsp; 調整可能な3120000038;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;3120000054;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>3120000062ピペッターチップ[2-200&nbsp;&#956;l, 50-1,000&nbsp;&#956;l]</td><td>エッペンドルフ</td><td>epT.I.P.S.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;22491334;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td>022491351</tr><tr><td>はさみ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブ、タイゴンラボラトリー1/32 "x 3/32"</td><td>VWR</td><td>63010-007</td><td></td></tr><tr><td>木製アプリケータースティック(綿棒、綿ヘッド)</td><td>VWR</td><td>CA89031-270</td><td></td></tr>手術<tr><td>用顕微鏡5-8倍倍率</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>ステロマスター</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、1 ml Normject</td><td>Fisher</td><td>14-817-25</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ(10)、30 ml</td><td>VWR</td><td>CA64000-041</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ輸液ポンプ&nbsp;</td><td>バイオオオヤマネコ&nbsp;</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>温度計 -20-110&nbsp;&#176;C</td><td>VWR</td><td>89095-598</td><td></td></tr><tr><td>タイマー</td><td>VWR</td><td>33501-418</td><td></td></tr><tr><td>チューブ、Eppendorf</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>チューブラック (3)</td><td>VWR</td><td>82024-462</td><td></td></tr><tr><td>超音波トランスデューサー、20 MHz</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>MS250</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-Tubingen、角度付きFine</td><td>Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr></tbody></table>

高周波超音波を用いて、マウス胚におけるコントラストイメージング

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

超音波造影イメージングは、組織の血管性と灌流に関する重要な定量的情報を伝えることができ、標的を絞ったアプリケーションでは、分子レベルでの血管バイオマーカーの検出と測定を容易にします。マウス胚内では、この非侵襲的手法を使用して、初期のマウス循環器系および心血管疾患の遺伝子モデルにおける血管発生の根底にある基本的なメカニズムを明らかにすることができます。マウス胚は、血管新生標的(血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)またはαvβ3を含む)へのマイクロバブルの接着を研究し、分子超音波の定量的性質を評価するための優れたモデルとしても提示されます。そこで、超音波造影剤を生きた単離された胚の血管系に導入する方法を開発しました。これにより、射出制御と位置決めの自由度、障害物や動きのないイメージング面の再現性、画像解析と定量化の簡素化が可能になります。妊娠後期(胚日(E)16.6およびE17.5)にマウス胚を子宮から単離し、卵黄嚢から穏やかに外部化し、マイクロバブル造影剤を胎盤椎間板の絨毛膜表面からアクセス可能な静脈に注入した。次に、非線形造影超音波イメージングを使用して、いくつかの基本的な灌流パラメータ(ピーク増強、ウォッシュイン速度、ピークまでの時間)を収集し、エンドグリンマウスモデルにおける標的マイクロバブル結合を定量化しました。私たちは、生きている胚内のマイクロバブルの成功した循環と、胚の血管系とマイクロバブルの振る舞いを特徴付ける上でのこのアプローチの有用性を示します。

子宮外でのマウス胚への超音波造影剤の注入は、注入および関連する超音波撮像にわたって生存能力の子宮およびメンテナンスから後期妊娠期胚生活の正常な分離に依存する。胚体外に位置決めされた後、図1に示すように、胚の血管系への造影剤の慎重な注入が可能である。 E17.5マウス胚の典型的なBモード超音波画像は、 図2Aに示されている。マイクロバブルのウォッシュイン及び対応するエンハンスメント下大静脈内、心臓、脳、全動物において、それにより、この手法の実現可能性を実証し、非線形コントラスト撮像法を用いて捕捉することができる。個々の時間点は、 図2Bに示されており、経時的なコントラストの変化を示している。 全体ウォッシュインとウォッシュアウトOを記録することにより、マイクロバブルボーラスfは、様々な灌流パラメータを測定することができる。オフライン分析では、コントラスト領域トレースツールは、胚、左右の脳半球に関心1.5mmの2つの領域（ROI）を作成するため...

ここでは、生きている、孤立した後期妊娠期のマウス胚に超音波マイクロバブル造影剤を注入するためのプロトコルを提示する。この方法は、灌流パラメータ及びコントラスト強調高周波超音波イメージングを用いて、胚内の血管の分子マーカーの研究を可能にする。

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

本手順の全体的な目的は、造影超音波イメージングのために、単離したマウスの生存胚にマイクロバブルを注入することです。これは、まず妊娠マウスから生存した E 16.5 または E 17.5 の胚を採取することによって行われます。標的化マイクロバブルを調製した後、胎盤血管ネットワークを介して生存胚にマイクロバブルを注入します。最終ステップは、超音波イメージングを用いてマイクロバブルを画像化することです。最終的に、造影超音波イメージングを用いて血管灌流パラメータを測定し、胚における標的化マイクロバブルの結合を評価することができます。一般的に、この手法に不慣れな方は、実験を成功させるために必要な針とピンセットの圧力加減を十分に習得するまで、プロトコルの胚操作および注入の工程に苦労することがあります。本手順を実演するのは、当研究室の共同研究学生であるBrian Nixonです。標的 ready バイアルを再構成するには、まず20 µgの抗体溶液を、最終容量1 mLの生理食塩水で希釈します。バイアルは氷上で保持してください。次に、シリンジに1 mLの生理食塩水を満たします。すべての気泡を除去します。21ゲージの針を装着し、溶液をマイクロバブルバイアルにゆっくりと注入します。プランジャーをゆっくりと引き、1 mLの空気を抜いてから、針を抜きます。バイアルを静かに攪拌し、氷上で5分間静置します。5分後、新しいシリンジに抗体希釈液を満たし、適切なバイアルに加えます。攪拌後、混合液が2 mLになるまで静かに加えます。氷上で10分間静置します。未標的のバイアルを再構成するには、シリンジに1 mLの生理食塩水を充填します。その際、気泡をすべて取り除いてください。21ゲージの針を取り付け、溶液を新しいマイクロバブルバイアルにゆっくりと注入します。プランジャーをゆっくりと引き、空気1 mL分を抜き取った後、針を抜きます。軽く振盪し、5分間静置します。生理食塩水をさらに1 mL加え、全量を2 mLにした後、穏やかに攪拌し、氷上で10分間静置します。目的のマイクロバブルバイアルを穏やかに攪拌した後、1 mLシリンジに21Gの針を装着し、溶液を約50 µL分分注します。その後、マイクロバブルを空の2 mLマイクロ遠心チューブに注入します。次に、マイクロバブルストック溶液のサンプル 10 µL を 10 mL の希釈液にピペッティングします。穏やかに混合した後、コールターカウンターを用いて、マイクロバブル集団の濃度および粒径分布を評価します。バイアルサンプルあたり、50 µL の測定を最低 3 回行います。30 µmの開口部を使用します。この工程は、胚へのマイクロバブルの注入と並行して行われます。術者が胚に注入している間に、アシスタントが次の注入準備を行うことで、術者が注入されるバブルの種類を判

contrast-imaging-in-mouse-embryos-using-high-frequency-ultrasound

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

マウスの子宮内生存の手術では...

超音波ガイド下のマウスの前脳へのマイクロインジェクション子宮内で E9.5で

心臓の発達に影響を与える遺伝的変化を検討する際に、胎児および周産期死亡は、一般的な機能です。高周波超音波イメージングは​​、2次元の解像度を向上しており、早期に心臓の開発に優れた情報を提供することができますし、死亡前に心臓の構造と機能に及ぼす影響を検出するための理想的な方法です。...

ネズミの胎児心エコー検査

このビデオは、分離された妊娠後期のマウス胚にマイクロバブル造影剤を注入する手順を示しています。マイクロバブル造影剤ベースの超音波イメージングは、胚の血管環境を視覚化し、特徴付けるのに役立ちます。...

単離マウス胚へのマイクロバブルの注入:生きたマウス胚の血管系にマイクロバブル造影剤を送達する技術

このビデオでは、妊娠マウスモデルの胚着床部位を画像化するための高周波超音波検査を実演します。このイメージング技術は、生存可能な妊娠を成功裏に検出し、マウスの妊娠初期における胚着床部位を特徴付けます。...

妊娠初期の特性評価に基づく高周波超音波検査:妊娠中のマウスモデルにおける胚の着床と妊娠進行を研究する技術

超高周波超音波小動物における心臓の異常を調べるための強力なライブイメージングツールです。その非侵襲性は、胚の生理的な状態を維持することができます。ここで、我々は子宮内で E18.5で胚の心拍数を測定するためのM-モード超音波を使用することを示している。...

非侵襲Mモード心エコー検査によるマウスでの心拍数の子宮内測定で

マウスは、妊娠性生物を勉強する広く使用されます。ただし、妊娠の終了は、縦断的な調査を排除する、多数の動物の使用を必要とするこのような研究に必要です。したがって、早期発見のための高周波超音波の非侵襲的手法と妊娠マウスに着床後イベントの監視について述べる。...

マウスの早い妊娠の特性の三次元の高周波超音波の新規な使用

高周波超音波胎児マウスの解像度の画像が上がったし、心臓発生と構造欠陥の正確な非侵襲的評価を提供することができます。本プロトコルを実行するリアルタイムの胎児マウス...

心血管イメージング (30/45 MHZ) の高周波超音波を用いた胎児マウス

ここで高周波超音波マウスの胎児の生体内解析のための手法について述べる。このメソッドには、胎児のフォロー...

体内の胎児と胎盤の開発の分析のための高周波超音波

高解像度超音波は、妊娠、妊娠年齢、妊娠喪失の状態を決定することによって、時限妊娠マウスを必要とする実験を合理化するのに役立ちます。ここで提示されるは、マウスの妊娠だけでなく、妊娠を模倣する可能性のある潜在的な落とし穴(画像アーティファクト)を評価する方法を説明するためのプロトコルです。...

私のマウスは妊娠していますか?高周波超音波評価

このプロトコルでは、造影剤増強超音波イメージングとマイクロバブル媒介薬物送達を研究するためのin...

造影剤増強超音波イメージングおよびマイクロバブル媒介薬物送達研究のためのin vivoモデルとしてのニワトリEx Ovo胚および絨毛尿膜血管の調製

マウス胚における初期心臓前駆細胞のライブイメージング

学ぶマイクロバブル注入法によるマウス胚の血管造影イメージング。高周波超音波を用いて灌流パラメータと標的結合を評価し、発生生物学における血管動態研究に貢献します。

高周波超音波を用いて、マウス胚におけるコントラストイメージング

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