Name: 病気のベクトル蚊幼虫におけるキトサン/干渉RNAナノ粒子媒介遺伝子サイレンシング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 学ぶ キトサン/干渉RNAナノ粒子を用いた病気のベクトル蚊幼虫における遺伝子サイレンシング法。ナノ粒子を餌と混合してゲル状にし、幼虫に摂取させることで遺伝子機能を抑制し、疾病媒介蚊の遺伝子研究に応用できる。

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>jove_content<カンザス州農業試験場とK州立節足動物ゲノミクスセンターからKYZへの資金提供は、A. gambiae19におけるキトサン/dsRNA媒介遺伝子サイレンシングの元の開発を支援しました。ここで述べたA. gambiaeの研究は、NIH/NIAIDからKMへのR01-AI095842によって部分的に支持されました。A. aegypti20,21におけるキトサン/siRNA媒介遺伝子サイレンシングの開発は、MDSに対するNIH/NIAID賞R01-AI081795によって支援されました。この研究の内容は著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。

1.蚊種と飼育<ol><li> A.を維持ハマダラカ G3 とA.ネッタイシマカリバプールIB12株（下の代表的研究に使用される）または関心のある他の株の標準実験室の練習にまたは以前に23,24説明したように従った。 </li></ol> 2. dsRNAおよびsiRNAの設計と製造<ol><li>設計プライマーは、関心対象の遺伝子に特異的な長いdsRNAテンプレートを構築した。 E-のRNAiツール25を使用してください。として選択または方法に従ってのdsRNA産生は、以前に19を記載した。 <ol><li>陰性対照のために、緑色蛍光タンパク質（GFP）、β-ガラクトシダーゼ（β-gal）、または蚊では発現されないいくつかの他の遺伝子の配列に対応するdsRNAが19を合成する。所望であれば、以下に要約する代表的な結果を生成するために利用dsRNAは19を陽性対照として使用することができる。ストアdsRNAは、-80℃で無RNAse水に溶解; C必要になるまで。 </li></ol></li><li>あるいは、設計遺伝子特異的siRNA標準ラボ慣行または以前に記載10のようによれ。すべての蚊の遺伝子に対応していないネガティブコントロールsiRNAを設計するためにノックダウンsiRNAの配列をスクランブル。評判の良いベンダーの数を介して使用できますカスタムsiRNAを、購入してください。 <ol><li>所望であれば、以下に要約する代表的な結果を得るために用いたsiRNA 20,21は、陽性対照として使用することができる。必要になるまでストアsiRNAは、-80℃でRNaseフリー水に溶解した。 </li></ol></li></ol> 3. R​​NAナノ粒子干渉/キトサンの準備<ol><li>既製のRT 100mMの硫酸ナトリウムを集める（脱イオンH 2 O中の100mMのNa 2 SO 4）、0.1 M酢酸ナトリウム（脱イオンH 2 O中の0.1 M NAC 2 H 3 O 2 -0.1 M酢酸、pH4.5）中バッファ。 </li><li>キトサンを溶解する（≥75％脱アセチル化された）は、0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液（w / v）の希釈標準溶液、0.02％を作るために、使用前にRTで溶液を維持する。 </li><li> H 2 Oの脱イオン50μl中のdsRNAまたはsiRNAを溶解し、50 mMの硫酸ナトリウム100μlのあたりのdsRNA / siRNAの32μgの100μlの溶液を作製するために100 mMの硫酸ナトリウムバッファーに追加します。 </li><li>のdsRNA / siRNA溶液にキトサン溶液100μlを加え、その後、1分間55℃の水浴中で混合物を加熱する。キトサン溶液の100μlに50 mMの硫酸ナトリウム100μlを加えることで制御を設定し、同じ手順に従います。 </li><li>ナノ粒子の形成を容易にするために、室温で、高速ボルテックスで30秒間、直ちに溶液を混合する。 </li><li>遠心分離し、ペレットを表示するか、その時間後室温で10分間、13,000×gで混合。新しい1.5 mlチューブに上清を移し。蚊の食品を調製するために使用する前に室温で≈10分間、ペレットを空気乾燥。 </li><li> M上清に残ったのdsRNA / siRNAの総量を計算するために、ブランクとしてコントロール（3.5を参照）からの上清を使用して上清中のdsRNA / siRNAの濃度をeasure。のdsRNA / siRNAの出発量の差を使用して、ナノ粒子中に封入さのdsRNA / siRNAの割合を計算するために、上清中に残存する量。この充填効率は、通常90％以上である。 </li><li>以上のナノ粒子が必要な場合は、同じ手順を繰り返します。すぐに乾燥したナノ粒子を使用してください。使用前に粒子の低温貯蔵の影響が評価されていない。 </li></ol> 4.モスキート食品は、RNAナノ粒子干渉/キトサンを含む準備<ol><li> （w / v）の脱イオン水に、アガロースを溶融し、2％アガロース溶液1mlを調製し、使用前に55℃の水浴中で融解したアガロース溶液を保つ。 </li><li>魚の餌フレークを混ぜ（47％粗タンパク質、分。粗脂肪10％、最大粗繊維3％）で、乾燥酵母2：1の比（w / w）である。 （第50号米国標準試験ふるいを通過できる）を乳鉢と乳棒で小さな粒子に混合物を挽く。どちらかすぐに、色が茶色がかったあるべき地上の食べ物を、使用するか、または数週間4℃で密封容器に保管してください。 </li><li> 1.5ミリリットルチューブでは、つまようじで3.7節からの乾燥ナノ粒子で地面食品の6 mgのミックス。 </li><li>食品·ナノ粒子混合物に2％のプレ溶融したアガロースゲル溶液の30μlのを追加します。つまようじまたはピペットチップを使用してすぐに、徹底的にかき混ぜる。 </li><li>すぐに蚊の幼虫を養うために食品やナノ粒子を含むゲルを使用してください。ゲルが完全に室温で固化されると代替的に、4℃でゲルを格納し、使用する次の日に、または後で使用するために-80℃で。 </li></ol>食べ物は、RNAナノ粒子干渉/キトサンを含有する蚊の幼虫を餌5. <ol><li>給餌A.ハマダラカ蚊の幼虫： <ol><li> Siのを削除爪楊枝を使用して1.5ミリリットルチューブからngleゲルペレットときれいなカミソリの刃や歯のピックを使用して6等しいスライスにカット。 </li><li>脱イオン水100mlを含む500mlペトリ皿に20三齢幼虫を転送します。 </li><li> 4日間、一日一回ペトリ皿当たりゲルペレット（細かく小さな断片に切り刻ま）の1スライスを追加することによって蚊の幼虫フィード。大幅にサイズが縮小または翌日までに完全に存在する必要があり、ペレット、上の幼虫の摂食を必ず守ってください。時間が経過すると、蚊が遅れて4齢幼虫に発展する。 </li><li>実験中の目に見える表現型の変化を記録します。 4日間の期間の終了時にセクション6で説明したように転写レベルおよび他の表現型の変化を調べます。 </li></ol></li><li>給餌A.ネッタイシマカの蚊の幼虫： <ol><li>清潔なカミソリの刃や爪楊枝を使って6等しいスライスにゲルペレットをカット。 </li><li>卵孵化Fiの後に50歳の同期24時間を置きます≈40mlの脱イオン水中のシャーレに1の幼虫。 </li><li>その日の残りの1グラウンド魚の餌フレークとドライイースト：その後2の正規の幼虫の食事に戻って幼虫を転送する、4時間/日のペトリ皿当たりの幼虫1スライスを養う。 4幼虫齢を通して毎日の手順を繰り返します。 </li><li>希望発達の時点でセクション6で説明したように転写レベルおよび他の表現型の変化を調べます。 </li></ol></li></ol>遺伝子ノックダウンの6.確認<ol><li> Aの定量RT-PCRによる相対転写産物の定量化ネッタイシマカとA.ハマダラカの幼虫。 <ol><li>少なくとも10の3つの生物学的複製とを実行し、分析のqRT-PCRアッセイは11,19,20が記載されている実験の幼虫対コントロールをプールし、または標準的な実験手順に従って。代表的な結果を以下に含まれています。 </li><li>特定の組織タイプ/本体部分（ すなわち 、脳またはアンテナ）の分析のために、perfo目的の組織を回復する解剖以下6.1.1に記載のように定量RT-PCRのrm（例えば、マイソールら 21を参照されたい）。 </li></ol></li><li> in situハイブリダイゼーションによるノックダウンの確認<ol><li>ジゴキシゲニン標識アンチを合成し、標準的な実験室の練習にまたは26に記載のように応じて制御リボプローブを感知。 </li><li> 11,20以前に説明し、以下の代表的な結果のセクションで説明したようにノックダウンの確認のためハウゲンら 27プロトコルごとin situハイブリダイゼーションを実行します。 </li></ol></li><li>免疫組織化学によるノックダウンの確認<ol><li>標的遺伝子のタンパク質産物に対する抗体が利用可能である場合、以前representatiに例示されるように表現型分析20のためのノックダウンの最大レベルを有する個体の同定を容易に28を 、説明したように、免疫組織化学を行う下記の結果セクションVEの。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本明細書に記載のキトサン/干渉RNAナノ粒子法は、効果的にAの発育中の遺伝子を標的とするために使用されているハマダラカ （ 図2、図3）およびA.ネッタイシマカ （ 図4、図5、図6、表1、表2）。キトサンナノ粒子は、本明細書に記載の代表的な結果によって証明されるように蚊に成功裡に使用されている両方とも、長いdsRNAまたはsiRNAのいずれかを用いて調製することができる。 dsRNAの合成は、siRNAを購入するよりも安価であるが、より労働集約的である。キトサン/ siRNAは使用される場合、表現型が明らかに表現型がオフサイト標的化によるものではないことをより良く保証を可能にする、複数のsiRNAを用いて確認することができる。また、siRNAは一斉の商業生産は、より良好な視野に種特異的な蚊の駆除のためのRNAサイレンシングを妨害/キトサンの拡張を容易にすることができる。これはもちろんobsta克服が必要ですそのようなコスト、納期などクル。 私たちはこのプロトコ...

ハマダラカとAedine属の血液供給の媒介蚊は、人類の最悪の災いのいくつかの責任病気の原因となる物質を伝達する。推定34億の人々が毎年世界中でオーバーワン50万人の死亡の原因であるマラリアを、縮小するための危険にさらされている。 マラリア原虫属による感染からマラリアの結果。主要なアフリカのベクトルハマダラカ （含むハマダラカ属の感染した蚊の刺さを通じて人々に送信され、寄生虫、 <a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">http://www.who.int/topics/malaria/en/</a> 、2014）1。 ネッタイシマカは、デング熱、世界で最も広範かつ重要なアルボウイルス疾患である非特異的な熱性疾患の原因となるデング熱ウイルス、の主要な蚊ベクトルである。デング熱ウイルスは毎年incidenで、現在熱帯&gt; 25億人への脅威である毎年〜24000人が死亡（結果として約5000万例のCE <a href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a> 、2014）2。人の健康に蚊が媒介する病気の壊滅的な世界的な影響にもかかわらず、これらの疾患の予防及び治療の効果的な手段が不足している。モスキートコントロールは、現在、病気の予防の最善の方法です。 ベクトル昆虫の遺伝子操作によって節足動物媒介疾患を制御するための可能性は40年以上3認識されてきた。 A.のトランスジェニック系統抑制性女性特有飛べ表現型を有するように操作ネッタイシマカは、最近、トランスジェニックベクターコントロール戦略現実4-6を使用するための可能性を作った。これらの進歩は、ベクター対照と媒介蚊で遺伝子機能を操作するさらなる手段のための新規の遺伝子標的を同定するために研究者が挑戦してきた。遺伝子発現dの変質を雌飛べ蚊4でそうであったようにuring開発は、新規ベクトル制御戦略の解明を促進することができる。しかし、主として技術的な課題に、非常に少数の遺伝子の機能は、Aの開発中に特徴付けられているハマダラカ、ネッタイシマカ、または他の蚊の種。 C.年の発見以来エレガンス 7、動物、植物および微生物において保存されているRNA干渉（RNAi）は、広範囲の昆虫8,9を含む多種多様な生物において機能的な遺伝学的研究のために使用されてきた。 RNAi経路は、配列特異的干渉RNAとして機能する短い20-25ヌクレオチド長のsiRNAに切断する長いdsRNAダイサーによって開始される。転写産物のターンオーバー、切断、および翻訳9の破壊を促進することにより、配列が相補的であるsiRNAは沈黙遺伝子。 particulaをターゲットに長いdsRNA分子（通常は300〜600塩基対）、またはカスタムのsiRNArの配列は、目的の任意の遺伝子をサイレンシングするために研究室で使用することができる。干渉RNAが送達されたときに管理することにより、研究者は、遺伝子がサイレンシングを開始する時間を制御することができる。それは遺伝変異を有する株の生産やメンテナンス、すべての昆虫種ではまだ使用できません高価で労働集約的なプロセスを妨げることができるように、発達致死や無菌性などの課題を克服するために使用することができようにこの利点に便利です。 RNAiによる遺伝子サイレンシングの程度は、動物への遺伝子、組織、組織、および動物に遺伝子変化し得るが、RNAiは広く蚊や他の昆虫8,9における遺伝子の機能解析のために使用される。 三つの干渉RNA送達戦略は、蚊に使用されてきた：微量注入、浸漬/局所適用、経口摂取を。詳細な歴史と昆虫におけるこれらの3つの技術の利用の比較のために、ゆうら 8を参照してください。 Weは成功してAの発生遺伝子をターゲットとするsiRNAを送達する手段としてマイクロインジェクション10を使用していたネッタイシマカの胚、幼虫、蛹11-14。しかし、この労働集約的な配信戦略は、マイクロインジェクションのセットアップと熟練した手の両方を必要とします。また、マイクロインジェクションは、行動の表現型が評価される場合は特に、生物、交絡因子にストレスが多い。最後に、マイクロインジェクション送達は、ベクトル制御のためのフィールドを拡張することができない。それは便利であり、ほとんどの機器や労力を必要とする別の方法として、RNA溶液を干渉する生物を浸すことはまた、遺伝子サイレンシングを誘導する人気の手段となっている。浸漬は、主に昆虫細胞株に適用された8を研究が、最近の研究では、ノックダウンA.で達成されたネッタイシマカの幼虫は、動物が摂取するように思われたdsRNA 15の溶液に浸漬した。ただし、複数のエクスペリの分析を含む研究のためのL基または表現型は、浸漬はかなり高価である。ロペス·マルティネスら 16は、RNAi、干渉RNAを含む水の一滴と食塩水と水分補給で脱水を伴うRNAの配信を妨害するための新規のアプローチを駆動水分補給を説明した。このアプローチは、動物全体の浸漬に関連するコストを削減するが、マイクロインジェクションよりも高価であり、高い浸透圧に耐えることができる化学種への適用に限定されてもよいしない。また、浸漬、脱水/再水和の浸漬方法は、フィールド内のベクトル制御に適合させることができるか想像することは困難である。これらの理由から、後胚の研究のために、摂取した食物との干渉RNAの送達は実行可能な代替戦略です。 摂取ベースの戦略は、すべての昆虫種では動作しませんが、おそらく最も顕著キイロショウジョウバエ 、食品と混合したRNA干渉の経口送達は、遺伝子のSiを推進してきましたA.含む昆虫8,17、さまざまなlencing ネッタイシマカ大人18。私たちは、Aにキトサンナノ粒子媒介RNAiを説明したハマダラカ幼虫 19に成功A.における遺伝子発現の低減のためのこのアプローチを適用しているネッタイシマカの幼虫20,21。ここで、高分子キトサンによるRNA干渉の包括を伴うこのRNAiの手順、方法論は、詳細です。キトサン/干渉RNAナノ粒子は、キトサン中のアミノ基の正電荷とRNA 19干渉の主鎖にリン酸基により担持された負電荷間の静電力を介して干渉RNAとポリカチオンの自己集合により形成される。記載された手順は、長いdsRNA分子（以下のdsRNAとも呼ばれる）または二本鎖siRNA（以下のsiRNAと呼ばれる）の両方と互換性がある。以下の合成、キトサン/ RNAナノ粒子が幼虫食品と混合に配信される干渉経口摂取を通じて幼虫。この方法は、比較的安価であり、少ない設備および労力19を必要とし、行動20,21の解析を含む複数の表現型のハイスループット分析を容易にする。他の疾患ベクターおよび昆虫農業害虫を含む他の昆虫の遺伝子サイレンシング研究のために適合させることができるこの方法は、潜在的に他の種々の動物種における遺伝子サイレンシングのために使用することができる。また、キトサン、安価な、非毒性および生分解性ポリマー22は 、潜在的に種特異的な蚊の駆除のための分野において利用することができる。

<table><tbody><tr><td>0.02 ml ピペットマン</td><td>レイニン</td><td>PR20</td><td>(干渉 RNA の再懸濁</td></tr>用) <tr><td>0.2 ml ピペットマン</td><td>レイニン</td><td>PR200</td><td>(干渉 RNA の再懸濁および干渉 RNA/ナノ粒子の調製用</td></tr><tr><td>) 0.5 ml 目盛り付きチューブ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>05-408-120</td><td>再懸濁干渉RNA分注</td></tr>用<tr><td>1 mlピペットマン</td>レイ<td>ニン</td><td>PR1000</td><td>干渉RNAの再懸濁および干渉RNA /ナノ粒子の調製用</td></tr><tr><td>1.5 ml目盛り付きチューブ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>05-408-046</td><td>干渉RNA /ナノ粒子の調製用</td></tr><tr><td>1M酢酸ナトリウム、pH 4.5</td><td>TEKnova</td><td>S0299</td><td>酢酸ナトリウム緩衝液</td></tr><tr><td>酢酸、AIRSTARを調製します。ACS、USP、FCC グレード</td><td>BDH</td><td>VWR BDH3092-500MLP</td><td>酢酸ナトリウム緩衝液</td></tr><tr><td>を調製 アガロース ジェネティック テクノロジー グレード</td><td>MP バイオメディカルス LLC.</td><td>800668</td> エビの殻から干渉する<td>RNA /ナノ粒子</td></tr>をペレット化する 遠心分離機エ<tr><td></td><td>ッペンドルフAG</td><td>5415D</td> 干渉<td>RNA /ナノ粒子</td></tr>キ<tr><td>トサンを</td>コーティングする<td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646-25G</td><td>干渉RNAと結合して干渉RNA /ナノ粒子の調製のために干渉RNAと結合</td></tr>する<tr><td>ドライイースト</td><td>ユニバーサルフードコーポレーション</td><td>NA</td><td>干渉RNAと蚊の幼虫の餌を準備するためにナノ粒子</td></tr><tr><td>E-RNAi ツール</td><td>ドイツがん研究センター</td><td></td><td>NA dsRNA の設計用; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</td></tr> <tr><td>金魚フード</td><td>ウォードリー</td><td>金魚フレーク FOOD</td><td>干渉 RNA/ナノ粒子を含む蚊の幼虫用フードを調製</td></tr><tr><td>温水浴</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221048</td> 干渉 <td>RNA/ナノ粒子を 55oC で加熱</td></tr><tr><td>氷</td><td>は適用されません</td><td></td><td>干渉するRNAの解凍および干渉するRNA /ナノ粒子</td></tr><tr>の調製には適用されません<td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>アイスバケツ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-591-44</td><td>手順中に使用される氷の貯蔵</td></tr><tr><td>肝臓の粉末</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td></td><td>蚊の幼虫に餌を与える900396 干渉RNA/ナノ粒子処理</td></tr><tr><td>電子レンジ</td><td>2%アガロース溶液</td><td></td>ペ<td></td></tr><tr><td>トリディッシュ(100 x 15 mm)</td>の調製に適用されないさまざまなベンダー フィ<td>ッシャーサイエンティ</td>フィック<td>875713</td><td>幼虫用干渉RNA/ナノ粒子供給チャンバー</td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>メトラー・トレド</td><td>S220</td><td>バッファーの準備用</td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>12-640</td><td>は、給餌用の干渉RNA/ナノ粒子ペレットを分割します</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>サーモサイエンティフィック/ダルマコン</td><td>カスタム</td><td>siRNA/ナノ粒子の調製用</td></tr><tr><td>硫酸ナトリウム、無水(Na2SO4)</td><td>BDH/VWR</td><td>VWR BDH0302-500G</td>で配布<td>され、干渉するRNAが 50 mM 硫酸ナトリウム溶液を調製します再懸濁</td></tr>温度<tr><td>計</td><td>VWR</td><td>61066-046</td><td>ウォーターバス温度を測定するため</td></tr><tr><td>つまようじ</td><td>VWR</td><td>470146-908</td><td>干渉するRNA/ナノ粒子の食品調製および切断ゲルペレットの攪拌用</td></tr><tr><td>超低冷凍庫</td><td>-80oCでの干渉RNAアリコートおよび干渉RNA/ナノ粒子の保管には</td><td>適用されない</td><td>さまざまなベンダー</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>02-216-108</td><td>キトサン/干渉RNAの調製用</td></tr><tr><td>重量紙</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>NC9798735</td> 摂<td>食用の干渉RNA/ナノ粒子ペレットを分割します</td></tr></tbody></table>

病気のベクトル蚊幼虫におけるキトサン/干渉rnaナノ粒子媒介遺伝子サイレンシング

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

媒介蚊は、他の生物よりも多くの人的被害を与える-と百万人以上の人毎年殺す。蚊のゲノムプロジェクトは、プライマリアフリカのマラリアベクトルハマダラカとデング熱や黄熱病ベクトルネッタイシマカにおける機能遺伝子研究を含め、蚊の生物学の新しいファセットの研究を促進した。電波妨害RNA（RNAiを）媒介遺伝子サイレンシングは、これらの疾患の媒介蚊の種の両方において、目的の遺伝子を標的とするために使用されてきた。ここでは、食物と一緒にし、幼虫により摂取されたキトサン/干渉RNAナノ粒子の調製のための手順を記載している。長い二本鎖RNA（dsRNA）または低分子干渉RNA（siRNA）分子と互換性があり、この技術的に簡単で、高スループット、比較的安価な方法は、Aの異なるいくつかの遺伝子のノックダウンの成功のために使用されているハマダラカとA.ネッタイシマカ幼虫。定量RT-PCRを介して、またはin situハイブリダイゼーションで確認された幼虫授乳、ノックダウン、続いて、少なくとも後半蛹を通 ​​じて持続することができます。この方法は、農業害虫、並びに他の非モデル生物を含む蚊および他の昆虫種の多種多様に適用可能である。研究室でのその有用性に加えて、将来、キトサン、安価な、非毒性および生分解性ポリマー中に、潜在的な分野で利用することができる。

<html> A.ハマダラカ： キトサン/ dsRNAはナノ粒子によるキトサンのアミノ基とdsRNAのリン酸基との間の静電相互作用によって形成されている。溶液からのdsRNAの枯渇によって測定されるように、ナノ粒子中へのdsRNAの取り込みの効率は、通常90％以上である。原子間力顕微鏡画像は、100〜200nmの（ 図1）の範囲の直径がそのキトサンのdsRNA粒径平均が140nmを示す。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52523/52523fig1.jpg" /> キトサンおよび干渉RNAによる図1のナノ粒子の形成。キトサン/ dsRNAのナノ粒子（A）またはdsRNA（B）を添加していないキトサン溶液の原子間力...

ここでは、幼虫により摂取されたキトサン/干渉RNAナノ粒子の使用を通じて疾病媒介蚊で遺伝子機能を阻害するための手順を記述している。

病気のベクトル蚊幼虫におけるキトサン/干渉RNAナノ粒子媒介遺伝子サイレンシング

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

この手順の全体的な目的は、蚊の幼虫における遺伝子サイレンシング研究のために、tussin干渉RNAナノ粒子を設計し、使用することです。まず、キチンと干渉RNAを組み合わせ、加熱、ボルテックス処理、および遠心分離を行うことで、tussin干渉RNAナノ粒子を調製します。次の目的は、ナノ粒子を幼虫の餌およびアガロースと混合し、餌とナノ粒子を含むゲルペレットを作製することです。ナノ粒子フードを蚊の幼虫に与え、ペレットを摂食する幼虫を観察します。最終的に、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応または2つのハイブリダイゼーションアッセイによって遺伝子サイレンシングを確認します。これにより、機能喪失表現型を調べることができます。この手法は、媒介蚊の研究分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。例えば、嗅覚系、脳、中腸、およびその他の媒介における重要組織の発達過程における遺伝子の機能を研究するために、この手法を用いてきました。この技術の主な利点は、ハイスループットであること、比較的安価であること、そして、より高度な技術を要しフィールドでの実施が不可能なマイクロインジェクションによる干渉RNAの導入よりも、個体へのストレスが少ないことです。ポストドクトラルフェローのAva Maurと共に、技術者のPing Leeが本手順を実演します。まず、tussinを0.1 molar 酢酸ナトリウム緩衝液に溶解し、0.02%の作動溶液を調製します。この溶液は、使用前に室温で保持してください。次に、二本鎖RNAまたは小干渉RNA（以下、まとめて干渉RNAと称する）を50 µLの脱イオン水に溶解させます。50 millimolar 硫酸ナトリウム 100 µLにつき 32 µg の核酸を含む 100 µL の溶液を調製します。次に、干渉RNA溶液に tussin 溶液 100 µL を加えます。混合液を 55 °C のウォーターバスで 1 分間加熱します。100 µLの50 mM硫酸ナトリウムを100 µLのTustin溶液に添加してコントロールを作成し、加熱後に同様の手順に従います。ナノ粒子の形成を促進するため、直ちに室温で高速ボルテックスミキサーを用いて30秒間混合します。混合液を室温で13,000 Gで10分間遠心分離すると、ペレットが確認できます。上清を新しい1.5 mLチューブに移し、使用前にペレットを室温で約10分間風乾させます。UV分光光度計を用いて蚊の餌を調製するには、コントロールのS上清をブランクとして用いてSNAT中の干渉RNA濃度を測定し、SNATに残存している干渉RNAの総量を算出します。干渉RNAの開始量と上清に残存する量との差から、ナノ粒子に捕捉された干渉RNAの割合を算出してください。この封入効率は通常90%を超えます。さらに多くのナノ粒子が必要な場合は、同じ手順を繰り返してください。使用前の粒子の低温保存による影響は評価されていないため、乾燥させたナノ粒子は直ちに使用してください。まず蚊の餌を調製するために、脱イオン水で2%のagro溶液を調製し、arosを溶解させます。溶解させたagro溶液は、使用まで55 °Cの水槽で保持してください。次に、魚のフレークフードとドライイーストを1:2の比率で混ぜ合わせます。乳鉢と乳棒を用いて、この混合物を微細な粒子になるまで粉砕します。粉砕されたフードは茶褐色になります。1.5 mLチューブ内で、爪楊枝を用いて6 mgの粉砕した餌と乾燥ナノ粒子を混ぜ合わせます。次に、この餌とナノ粒子の混合物に30 µLの2%低融点アガロースゲル溶液を加えます。爪楊枝またはピペットチップを用いて、直ちに十分に撹拌してください。餌とナノ粒子を含むゲルが完成し、Anopheles gambiaeの蚊の幼虫に与える準備が整いました。爪楊枝を使用して1.5 mLチューブからゲルペレットを1つ取り出し、清潔なカミソリの刃または爪楊枝で4等分に切断します。その後、3齢幼虫を100 mLの脱イオン水が入ったペトリ皿に移します。ゲルペレットを1スライス加え、蚊の幼虫に餌を与えます。最終的に、ペトリ皿あたりに小さく刻んで投入します。4日間にわたり1日1回、幼虫がペレットを食べていることを必ず観察してください。ペレットは、翌日までにサイズが大幅に減少しているか、完全に消失しているはずです。蚊は幼虫の4齢後期まで成長させます。実験中に観察された表現型の変化を記録してください。80匹のGTI蚊幼虫への給餌を終えた4日間の期間終了後、本文のプロトコルで述べられている通り、転写レベルおよびその他の表現型の変化を検討してください。同様に、清潔なカミソリの刃または爪楊枝を使用して、ゲルペレットを4等分に切断します。次に、卵の孵化から24時間後に同期させた50 hのスター幼生をペトリ皿に入れます。約40 millilitersの脱イオン水に入れます。幼虫に、ペトリ皿1枚につきスライス1枚を1日4時間与えてください。ここでも、スライスは細かく刻んでおいてください。その後、残りの一日の間、幼虫を2:1の割合で配合した魚用フレークフードとドライイーストの通常の幼虫食に戻します。この手順を、幼虫の4つの齢期間を通じて毎日繰り返します。目的の発生段階において、テキストプロトコルで説明した通りに、転写レベルおよびその他の表現型の変化を調べます。ここに示されているのは、対照群として飼育された4齢のAn. gambiae幼虫であり、予想通り正常な外見をしています。しかし、キチン合成酵素1を標的とするキチン干渉RNAを投与した幼虫では、デキストランブルーが胃管に漏出していることから分かるように、パラアトロフィックマトリックスが破壊されています。また、対照群として飼育された4齢のAe. aegypti幼虫の触角において、必須の嗅覚共受容体であるorcoの正常な発現が観察されます。対照的に、single-minded遺伝子を標的としたtussin干渉RNAを投与した個体では、対照群と比較してOrcoの発現が見られません。Single-mindedをノックダウンした個体は、匂い追跡行動に欠陥を示します。このビデオを視聴することで、ベクトル蚊の発育過程において遺伝子をサイレンシングするためのKeon干渉RNAナノ粒子の使用方法について、十分に理解できるはずです。成虫の蚊やその他の新興モデル生物の研究にも拡張できる可能性を持つこの手法は、病原体媒介動物である蚊のゲノムプロジェクトで特定された遺伝子の機能を研究者が探索するための道を開きました。

chitosaninterfering-rna-nanoparticle-mediated-gene-silencing-disease

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

逆遺伝学的アプローチは、蚊のベクトルの病原体にどの遺伝子が基礎となる抵抗を決定するための非常に有用であることが証明されている。このビデオプロトコルは、マラリア原虫を抱いているハマダラカ蚊、にdsRNAを注入するDimopoulosラボで使用される方法を示しています。インジェクションのセットアップを操作し、胸部にdsRNAを注入する手法が示されている。...

成虫（A. gambiae）におけるRNAiのアッセイのためのプロトコル

このプロトコルでは、とRNAiによる遺伝子サイレンシングを組み合わせる...

RNAiによる遺伝子ノックダウンと<emインビボで&gt;</em大人の女性の&gt;利尿アッセイ<em&gt;ネッタイシマカ</em&gt;蚊

RNA干渉（RNAi）は、遺伝子の機能を明らかにするための非常に貴重なツールです。しかし、成人前の段階でRNAiを使用して遺伝子を標的とする能力は、主要なヒトマラリアベクターであるAnopheles...

RNAiのトリガ配信へ<em&gt;ハマダラカ</em&gt;蛹

良品組換えネッタイシマカdensovirus (AaeDV)生体内での配信システムを開発する、人工イントロン小 RNA 発現戦略を使用して報告します。建設、パッケージング、および幼虫の感染に関しては同様に rAaeDV...

蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用

この原稿は、リポソームにカプセル化された二本鎖 RNA...

RNA 干渉法の活用: ゴキブリのリポソーム キャリアで二本鎖 RNA の経口デリバリー

この記事では、RNA 干渉 (RNAi) 昆虫を摂食する師管液中の植物の維管束組織を通して二本鎖 RNA (dsRNA)...

篩部と半翅目昆虫の植物 sap 供給の RNA 干渉を誘発する二本鎖 RNA の経口配信方法

このプロトコルでは、標準化し、蚊とハエの体液に直接核酸の特定の量を提供する数年間使用したマイクロインジェクションの方法論について説明します。このプロトコルは、最小限の注入の死亡率の結果し、多産の相関の線量測定が可能します。...

再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

細菌によって産生されるdsRNAの経口投与は、 カエノラブディティス・エレガンス...

成虫 のアノフェレスガンビアエ 蚊への効果的な経口RNA干渉(RNAi)投与

ここで紹介するのは、カイコ Bombyx mori...

Chitosan/dsRNAナノ粒子送達によるカイコ Bombyx mori の幼虫RNA干渉

ノックダウン遺伝子発現の内のウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（VIGS）メソッドの説明...

ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）でタバコbenthamianaとトマト

学ぶ キトサン/干渉RNAナノ粒子を用いた病気のベクトル蚊幼虫における遺伝子サイレンシング法。ナノ粒子を餌と混合してゲル状にし、幼虫に摂取させることで遺伝子機能を抑制し、疾病媒介蚊の遺伝子研究に応用できる。

病気のベクトル蚊幼虫におけるキトサン/干渉RNAナノ粒子媒介遺伝子サイレンシング

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