ICPMSサンプル導入のためのマイクロ流体チップ

この手順の全体的な目標は、I-C-P-M-Sによって単一細胞または水溶液を含むモノ分散微小液滴の元素組成を生成し、定量的に分析することです。これは、まずPDMSによるレプリカ成形を使用してマイクロ流体チップを作製することによって達成されます。2番目のステップは、シリンジポンプをマイクロ流体チップに接続することです。

ポンプは、水性サンプルと、揮発性が高く許容可能なまたは有機キャリア相PFHを供給します。シリンジポンプをオンにすると、マイクロ流体チップは、PFHで焦点を合わせて、水溶液または細胞懸濁液のモノ分散液滴を流れで生成し、これらの液滴をPFHを追加してチップから液体ジェットとして排出します。最後のステップは、液滴を蒸発させるカートリッジヒーターと、イオン化して液滴含有量をI-C-P-M-Sで検出する前に溶媒を除去するメンブレン・ド・サルバトールからなる輸送アセンブリにチップを挿入することです。

最終的に、記録された信号と標準溶液によるキャリブレーション測定を使用して、サンプル溶液または懸濁液中の細胞の元素組成を決定します。既存の方法に対する当社のマイクロ流体技術の主な利点は、液滴サイズを調整できること、サンプル消費量が少ないこと、細胞懸濁液や濃縮塩溶液を使用する際のノーログのリスクが低いことです。さらに、低コストの使い捨てマイクロ流体チップは、洗浄時間を回避し、クロスコンタミネーションを排除します。

この手順を実演するのは、GTAs教授研究室の博士課程の学生であるvin scさんと、私の研究室の博士課程の学生であるPascal Fabricaさんです。微細加工プロセスを開始するには、大きなプラスチック皿に40グラムのPDMSと4グラムのPDMS硬化剤を測定します。両方の部分をへらで均等に混合し、皿を真空乾燥剤の中に20〜30分間置き、混合物からすべての泡を脱気します。

脱気中。微細構造のシリコンウェーハの上に鋳造金型を置き、設計の周りのガイド構造を使用して、平らなシリコンウェーハ上の所定の位置にはめ込みます。別の鋳造型を上に自由に置きます。

約3〜4グラムのドガPDMS混合物を両方の鋳造型に注ぎます。両方のシリコンウェーハをホットプレートに移します。PDMSを摂氏150度で6分間硬化させた後、冷まします。

金属ヘラで室温でベンチ上に固化したPDMS構造。固体PDMSブロックを金型から慎重に分離します。両方のブロックの接着面を粒子や指紋の汚染から保護します。

透明なスコッチテープの層を貼ることで、PDMSピースをはさみでサイズに合わせて取り扱ったりトリミングしたりできるようになりました。トリミング後、マイクロ構造のPDMSブロックからテープをはがし、生検ホールパンチを使用してマイクロ流体インレットポートを作成します。これで、デバイスの微細構造の半分の製造プロセスが完了し、平らな対応物と接着して組み立てる準備が整いました。

PDMSからPDMSへのボンディングのためのサービスを準備するには、硬化剤がまだ濡れている間に、6, 000 RPMでブランクシリコンウェーハにPDMS硬化剤の層をスピンコーティングすることから始め、マイクロ構造化PDMSブロックのボンディング界面をウェーハと接触させ、PDMSの上に圧力を穏やかに適用して、気泡のないシームレスなシールを形成します。別の手順で、平らなテープから保護テープをはがします。次に、マイクロ構造のPDMSをシリコンウェーハからゆっくりと分離します。

2つのPDMSピースを慎重に位置合わせし、2つのボンディングインターフェースを接触させます。2つのブロックを静かに絞って界面の気泡を取り除き、組み立てたPDMSチップを24時間硬化させます 室温で万能ナイフとアライメントデバイスを使用して、出口ノズルに直交するインジケーターラインに沿ってカットします。顕微鏡でチップを検査し、露出したアウトレットノズルに隣接するトリミング欠陥や粒子汚染がないか

製造品質を評価した後、PDMSマイクロチャネルの内面をサイロ化する準備が整いました。ケミカルフードで、ウルフボトルの一方の端を乾燥窒素源に接続し、ボトルのもう一方の端をPDMSチップの入口に接続します。中央のマニホールドに接続された複数のチューブを使用して、50マイクロリットルのセリーヌをオオカミのボトルにピペットで入れ、上蓋を密封します。

窒素キャリアストリームをオンにし、生理食塩水を含む蒸気でマイクロチャネルを毎秒約1ミリリットルの流量で20分間洗い流します。最後に、インレットチューブをウルフボトルから外します。コーティングされたPDMSチップは、シングルセル質量分析測定のための質量分析実験の準備ができています。

まず、有効細胞濃度が1ミリリットルあたり1,000万細胞未満になるように、インプットサンプルを適切な緩衝液で希釈します質量分析の準備として、サンプルシリンジにチューブを取り付けることから始めます。PFHを5ミリリットルシリンジ2個にロードし、インプットサンプルを別の1ミリリットルシリンジにロードします。シリンジとチューブ内に閉じ込められた気泡をすべて取り除き、2つのシリンジをシリンジポンプにロードします。

輸送チューブが適切に位置合わせされ、すべてのガスチューブが接続されていることを確認してください。次に、シリンジチューブをPDMSチップのインレットポートに接続し、シリンジポンプを3〜5分間作動させます。この流量安定化プロセスでは、出口ポートから余分な液体をティッシュで取り除きます。

流体が出てくると、チップはまっすぐなジェットを形成しません。5分後、チップ出口の障害物を清潔なティッシュで拭き取ってみてください。失敗した場合は、既存のチップを破棄し、接続を新しいチップと交換します。

サイクロン噴霧器アダプターからプラグを取り外し、流量安定化PDMSチップをアダプターに慎重に挿入します。推奨設定に従って流量を変更し、2〜5分間流量を再安定させます。同時に、対象の分析対象物の最大シグナル強度が達成されるまで、すべてのガスの流量を調整します。

また、質量分析計のプラズマパワーと集光レンズ電圧を調整して、信号の最適化時に信号強度をさらに高めます。質量分析計の滞留時間を10ミリ秒に設定し、データ取得を開始します。測定後、生データをデータ解析プログラムに転送します。

一般的なデータ分析ルーチンでは、最初にすべての測定値がデータ ビンに分割され、各ビンが滞留時間の 10 ミリ秒あたりのカウント数を表し、次にすべてのビンに対してヒストグラム プロットが生成され、ガウス分布関数が適合されます。個々の近似の平均と広がりは、特定の質量電荷比における平均信号強度と標準偏差の両方を表します。キャリブレーションプロセスを開始するには、まず、サンプルと同じ流量で標準溶液を測定します。

液滴発生用のPDMSチップを使用して、PFH用の5ミリリットルシリンジを2台、標準溶液用の1ミリリットルシリンジを1台設置します。次に、ペトリ皿を顕微鏡試料ホルダーとして使用し、PDMSチップをペトリ皿に置き、前のプロトコルステップを反映した低倍率でチップに焦点を合わせます。PDMSマイクロチャネル内の液滴発生をハイスピードカメラで3〜5分間安定させます。

二次接合部で水性液滴のオンチップの画像の記録を開始し、記録から平均液滴径を取得します。専用の液滴モーフ、検眼、および速度対称スイートを備えた画像解析ソフトウェアを使用します。各液滴を球状物体としてモデル化できると仮定すると、ソフトウェアによって取得された平均液滴直径を使用して、平均液滴量を推定できます。

次に、サンプルの既知の分析物濃度を平均液滴量で割って、1つの液滴に含まれる分析物の質量を求めます。次に、結果の質量を原子の数に変換します。最後に、液滴あたりの測定されたイオンの数を前の結果で割ることにより、全体的な検出効率を計算します。

この検出効率は、未知のサンプル中の原子数を確認するためのキャリブレーション量として利用できるようになりました。マイクロ流体液滴発生器を使用して、単一細胞を平均直径50ミクロン未満のモノ分散水滴内にカプセル化し、I-C-P-M-Sで分析できます。水滴を囲む有機PFHシースは、サンプルがI-C-P-M-S検出器に到達する前に簡単に取り外すことができます。

溶液を測定する場合、高い液滴モノ分散は、特定の滞留時間内で単一のダブルまたはトリプルの液滴カウントから来るシグナルのグループ間の分散が低いため、観察できます。適切なキャリブレーション後、それぞれが単一の液滴に懸濁した単一のウシ赤血球のアンサンブルからの鉄含有量を確認できます。このビデオを見れば、これらのマイクロ流体チップを調製して使用する方法を十分に理解して、非常に少量のサンプルや単一の粒子や細胞の定量的元素分析を行う方法が理解できるはずです。

これらのチップの製造には、チップが適切に機能すれば、チップごとに15分未満で作業時間が必要です。さらに、チップの変更が容易なため、高度なサンプル前処理のためのさらなるマイクロ流体モジュールの統合と、効率とサンプルスループットを向上させるためのサンプルと標準の同時導入が可能になります。