Name: ICPMSサンプル導入のためのマイクロ流体チップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 学ぶマイクロ流体チップを用いたICPMSサンプル導入法。PDMS製チップで単分散液滴を生成し、単一細胞や水溶液の元素組成を定量分析する技術を解説します。

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この作業は、欧州研究会議（ERC Starting Grant nμLIPIDS, No. 203428)とETHチューリッヒ）））の支援を受けました）。この原稿の著者は、ICP-MSの支援を提供してくださったBodo Hattendorf氏と細胞計数を担当してくださったF. Kurth氏に感謝いたします。また、著者は、機械的なセットアップの構築を支援してくれた Christoph Bärtschi 氏と Roland Mäder 氏にも感謝します。ETHチューリッヒのクリーンルーム施設FIRSTは、微細加工のサポートで認められています。

1 SU-8マスター作製（図2） 注：ダスト粒子による欠陥を防ぐためにクリーンルームでSU-8マスターモールドの製造を行います。二枚のウエハは、製造、マイクロ流体機構とせずに1と1のウエハのために必要とされる。 <ol><li>マイクロ流体チップのマスター金型を準備します。最初のシリコンウエハに接着層を適用する。 <ol><li> 200℃で10分間、シリコンウェーハを脱水する。 RTまでウエハを冷却し、以下のプロトコルでSU-8 2002をスピンコーター、スピンコートにそれをそれをロードします。 </li><li>分配約3mlのウェハ上のレジスト。 </li><li>全体ウエハ上にレジストを広めるために10秒間500rpmでウエハをスピン。 </li><li>約2μmのレジストの高さを達成するために30秒間2000rpmでウェハをスピン。 </li></ol></li><li>過剰取り除く防ぐために、アセトンに浸した綿棒で、ウェハの縁部からレジスト次のステップでホットプレートにウェハのこだわり。ホットプレート上で95℃で60秒間ウェハを焼く。 </li><li>紫外線（365nmにおけるを80mJ / cm 2）を用いて、ウェハ全体を露光する。ポストベークウェハ95℃〜120秒間。 </li><li>ダウンウエハを冷却し、すぐにコートに再びSU-8 2050年のための以下のプロトコルを用いてウェハをスピン： <ol><li> （このステップの間に約3ml SU-8レジストを分配する）20秒間100rpmでウエハを回転。 </li><li>全体ウエハ上にレジストを広めるために10秒間500rpmでウエハをスピン。 </li><li>約40μmのレジストの厚さが、結果30秒間3,250 rpmでウェーハをスピン。 </li></ol></li><li>再び、過剰の65℃でのアセトンに浸した綿棒およびソフトベーク180秒間ホットプレート上のウエハとウエハのエッジから、および95℃で360秒間、レジストを除去する。 </li><li> STIによるフォトマスクを準備ソーダ石灰ガラスに弄ぶ。マスク設計については、図3を参照してください。準備されたマスクを介して紫外光（365 nmで測定された160 MJ / cm 2の）でレジストを露光するためにマスクアライナーを使用してください。 65℃で60秒間及び95℃で360秒間ホットプレート上で再び露光されたウエハ焼く。 </li><li> RTにウェハを冷却した後、レジストを現像するために5分間現像剤を充填したガラスペトリ皿にそれを浸す。静かに未露光SU-8を除去するためのペトリ皿を攪拌する。イソプロパノールでウェハをすすぎ、窒素銃で乾燥したそれを吹く。 </li><li>顕微鏡下でウェハを調べます。場合はステップ1.7で説明したように、数分間、再びウェハを開発、機能にレジストが残存している未開発。 </li><li> 200℃で2時間、ウェーハを焼成することにより、残留溶剤を除去します。ステッププロファイラでの機能の高さを確認してください。測定された高さが所望の高さとは異なる場合がprotoで始まる再び欄第ステップ1.1.4でスピン速度を適応させる。 </li><li>ウェハのPDMSの付着を防止するために、小さい磁製皿に1 H、1 H、2 H、2 Hの -perfluorodecyltrichlorosilane50μlと一緒にデシケーター内に配置することによって、それをsilanize。 100ミリバールにデシケーター内の圧力を低下させ、12時間ウェハをインキュベート。 <ol><li>ブランクPDMSのための部品、ステップ1.10の方法を使用して別のシリコンウエハをsilanize。時間を節約するためには、単一のデシケーター中で同時に両方のウェーハをsilanize。 </li></ol></li></ol> 2. LADEチップ製造 NOTE：LADEチップを接着24により接合二つPDMS片から作られる。最初の部分は、マイクロ流体機能が含まれています。他の部分は平坦でチャネルをシールするために使用される。貼り合わせ、それらは液滴輸送システムを有するチップをインタフェースするのに必要な円形の形状を形成する。ここでは、の製造二つの部分、それらの結合が記載されている。全ての工程は、 図4に示されている。 <ol><li>硬化剤PDMS 4gをプレポリマー40gとを混合することにより、PDMSの44グラムを調製し（これは、最大6チップで生じる）。それは気泡のない（これは約20分かかります）になるまで、デシケーター中にPDMSを脱気。 </li><li>構造化された半分のレプリカ成形。 <ol><li>ウェハの上にキャスティングフォームを配置し、デザインを中心に、案内構造体を使用して所定の位置にはめ込みます（ 図5を参照）。フラットPDMS半体のための場所にスナップをスキップします。 </li><li>鋳造形で脱気PDMSの約3〜4グラムを注ぎ、150℃のホットプレート上で6分間に置きます。鋳造形で硬化したPDMSを冷却し、慎重にスパチュラを用いて鋳造フォームウエハを持ち上げる。 </li><li>マイクロ流体チャネルの汚染を防止するために、コンタクトのWiに以前にあったチップの側面をカバーテープでウェハを番目。慎重に過剰PDMSを除去するために、PDMS部分の縁に沿ってテープを切った。 </li></ol></li><li>フラットPDMSの半分が空白シラン化ウェハで2.2.3に上記のステップ2.2.1を繰り返して作製した。 </li><li>テープのピールと生検パンチャーとの構造化された半分に流体接続穴をパンチ。貯蔵中にテープを有する構造を保護します。 </li><li>剤24を硬化PDMSを用いた接着によって一緒にPDMS部分を接着。 <ol><li>未処理のシリコンウェハを取り、PDMSは、6000 rpmで30秒間硬化剤でコーティングしてスピン。スピンコーターからウェハを取る。 </li><li>構造化された半分からテープを取り出し、ウェハ上に下に向けた構造でそれらを配置します。穏やかに気泡を除去するためにPDMSの上に押し出す。 </li><li>空白のPDMSの半分からテープを外します。ウェハから構造化された半体を取り、手動でフラットPDMSの半体の上に合わせます。静かに絞る気泡を除去し、室温で24時間、組み立てられたチップ硬化させるために一緒に別れる。チャンネルが崩壊する可能性があります。このような力で部品を一緒に押さないでください。 </li></ol></li><li>出口ノズルを開くには、カッターナイフでノズルチャネルに直交するインジケータ線に沿ったチップの先端をカットします。ストレート液体吐出するために必要なストレートカットを、確実にするために整列装置を使用してください。マイクロ流体チャネルとダスト粒子の欠陥のために、顕微鏡下でチップを点検。貯蔵中にチップを保護するために、入口穴の上にテープを入れてください。 </li><li>乾燥窒素源にとLADEチップのすべての注入口にチューブをWoulffボトルを接続します。預金50 Woulff瓶の底の1 H、1 H、2 H、2 Hの -perfluorodecyltrichlorosilaneのμLして閉じます。 </li><li> 1 H、1 Hを担持する窒素流で20分間、すべてのチャネルをフラッシュすることによってマイクロ流体チャネルをSilanize </em&gt;、2 H、約1ml /秒の流速で2 Hの -perfluorodecyltrichlorosilane。チップは、実験のための準備ができて、室温で少なくとも数週間保存することができる。 </li></ol>測定/液滴交通システム3.準備注記：セットアップ安定支持構造を構築する必要があるため、光学テーブルの上に全体の液滴輸送システムを構築する。全液滴輸送システムのスキームを図6に示されている。 <ol><li>垂直にステンレス鋼管を添付50センチメートルでカスタムサイクロンポリ（メチルメタクリレート）（PMMA）アダプタをインストールします。マスフローコントローラとヘリウム源にアダプタを接続します。液滴可視化のための反対のサイトでアダプターに（高速）カメラとランプを取り付けます。 </li><li>鋼管の中央にカートリッジヒータを配置し、ポリ（塩化ビニル）（PVC）チューブおよびルグリチューブを使用膜desolvatorの入口と鋼管の端部を接続するためのコネクタ。 </li><li>直接ICPMS入口に接続されている層流アダプタの別のPVCチューブをdesolvatorの出口を接続する。マスフローコントローラアルゴン源に層流アダプタを接続し、後に安定した動作条件を達成するために、アルゴンを混合するために使用する。 </li><li>アダプターだけでなく、精神レベルの垂直鋼管を合わせます。位置合わせが正確でない場合には、液滴の大きな損失につながる可能性がある。ガスがシステムのウォームアップ時間中に漏れ出し防止するために、アダプタにプラグを差し込みます。 </li><li> 表1の設定を使用して、すべての上記ガス流およびデバイスが起動し、システムが15分間のウォームアップを許可する。カートリッジヒータは、事前にスイッチを入れ、温度を安定化させるために2時間を必要とする。 </li><li>サイクロンヘリウムアダプタの高さでラックにシリンジポンプを配置します。間の距離を保つシリンジポンプできるだけ短くアダプタ。 </li></ol> 4.測定注：以下のプロトコルが原因で使用することができ溶液および懸濁液の様々な一般的な用語で書かれている。しかしながら、細胞懸濁液は、単一細胞分析は、液滴の大部分が1つだけのセルを運ぶことを保証するために、実行され、&lt;1×10 7細胞/ mlの濃度に希釈されるべきである。注射器の出口が下向き指し、それらが下向きに指すようにチューブを取り付けるように細胞を用いた測定では角度でシリンジポンプを配置します。 <ol><li>注射器にチューブを取り付けます。負荷フルオロヘキサン二つ5ミリリットルの注射器と試料溶液または懸濁液で1 1mlシリンジ。注射器とチューブの中に閉じ込めすべての気泡を除去。 </li><li>シリンジポンプに注射器を取り付け、チップの入口に接続します。からスタート設定を使用してシリンジポンプを起動します。表1（またはそれ以上の流量）。フローを安定させるために3から5分を与える。 <ol><li>組織とチップの先端から余分な液体を除去します。液体は今ストレートジェットでチップから排出する必要があります。ストレート吐出をティッシュで拭くことによって達成することができない場合はチップを交換し、このステップでやり直す。 </li></ol></li><li>アダプタからプラグを外し、慎重にアダプタにチップを挿入します。必要に応じて、FC-40でチップに注油。チップは、実験の少なくとも2時間のために使用することができる。 </li><li> 表1の推奨測定設定範囲内であると流量を変更する。PFHの下部流量がPFH節約するだけでなく、同重体干渉による信号のバックグラウンドを減少させるだけでなく。 </li><li> （選ばれた流速に応じて）安定させるためにシステムを2-5分を与えます。目的の分析物の最も高い信号強度をICPMSを最適化します。 <ol><li>続いて、すべてのGの流れを調節するマスフローコントローラでアーゼ（ 表1の推奨される範囲を参照）、目的の分析物の最大信号強度が達成されるまで。プラズマパワーと同じようにICPMSに（製造者が推奨する範囲に応じて）フォーカスレンズ電圧チューン。 </li></ol></li><li> 10ミリ秒の滞留時間にICPMSを設定します（使用される非常にICPMSを申請したが、時間分解買収を確実にするために他の楽器と調整することができます）。製造業者のプロトコルを使用して、特定のm / zの信号の記録を開始。 </li><li>測定後、評価のためにデータ解析プログラムに生データを転送する。カウントに対するビンの中心値を生じたビン内蔵の機能を持つ10ミリ秒あたりのカウントに与えられたデータ、およびプロット。ガウス関数でプロット頻度分布ヒストグラムの各ピークを取り付け。フィットの平均およびσは、それぞれ、平均信号強度とその標準偏差を表す。 </li></ol> &lt;Pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 5。キャリブレーションコンセプト<ol><li>サンプルと同じ流量で要素または目的のエレメントを含む単一または多元素標準溶液を測定する。 </li><li>顕微鏡上のペトリ皿にLADEチップを置きます。より良い画質のための非円形のチップを使用しています。ステップ2で説明したように、このチップを製造するが、単純な長方形の鋳造フォームの代わりに、部分的に丸い形のいずれかを使用。 </li><li>液滴の生成を開始するには、手順4.2.1に4.1に従ってください。ステップ5.1で使用される流量と流量を設定します。 </li><li>顕微鏡（20倍対物レンズ）に取り付けられた高速カメラで水性液滴の画像を記録する。記録から平均液滴直径を得るために、Basuの25による液滴形態計測と速度測定ソフトウェアと同様に画像解析ソフトウェアを使用してください。 </li><li>液滴が球体であると仮定して、液滴の体積を計算するために平均液滴直径を使用する。 <ol><li>このボリュームとknから液滴中の分析物の独自の濃度は、対応する原子の数を計算する。検出効率を得るために原子の数によって測定された滴あたりのイオン数を分割する。未知試料中の原子の数を計算し、この検出効率を使用する。 注：個々のチップ間の変動は22小さいので、その流量が同じままであれば、すべてのチップまたは溶液のための液滴サイズの測定を繰り返す必要はない。特定の流量に応じて、液滴サイズおよび周波数のリストはVerboket らによって公開されている。22。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

チップの製造は、非常に信頼性が高いですが、特別な注意が必要な製造中のいくつかの重要なポイントがあります。まず、組み立て時の清浄度は、ほこり、チップの汚染を防ぐために非常に重要である。ダストはチャンネルをブロックし、安定した液滴の生成を防止することができる。第二に、先端がノズル流路と直交する切断されることが特に重要である。カットの角度が強く、吐出角度に影響を与えます。液体が角度で排出された場合には、吐出された液滴の損失を引き起こす可能性があります。 セットアップを構築する際、それが安定していることを確認してください。金属チューブ及びアダプタの垂直方向の配置が重要である。また、測定中に特別な注意を必要とするいくつかのポイントがあります。アダプターへのチップの挿入は、注意深く行わなければならない。それは、挿入中にジェットが中断して停止していることを発生することがあります。細胞の位置とオリエと測定のためシリンジポンプとチューブのntationが重要である。それらの適切な配置は、シリンジ、チューブ内の細胞の沈降を低減することができる。 ...

誘導結合プラズマ質量分析（ICPMS）による液体試料の元素分析は、一般に、導入装置1のようにスプレーチャンバーとの組み合わせでネブライザーを用いて行われる。この試料導入システム内にサンプルが多分散エアロゾルを生成するために、噴霧器によって噴霧される。下流噴霧室は、大きな液滴を除去するために使用される。この方法は、高いサンプル消費量（&gt; 0.3ミリリットル分-1）2及び不完全なサンプル輸送と関連している。したがって、唯一のマイクロリットルの試料体積は、生物学、法医学、毒物学および臨床研究3のように、使用可能なアプリケーションには非実用的となる。サンプル消費量を減らすために、より小さなノズル寸法を有する噴霧器3を開発した。しかし、縮小ノズルサイズは、未消化の生体液または濃縮塩溶液のサンプルが3を分析しなければならないとき、目詰まりのリスクを増大させる。 ら 4によって提案された。著者らは、ピエゾ電気駆動マイクロポンプにより製造された単分散離散微小液滴の形でICPMSに液体を注入した。この非常にシステムが広いアプリケーションを見つけられませんでしたにもかかわらず、それがICPMSで離散液滴導入の概念のさらなる発展を開始した。今日、30、50、70および100μmの大きさと100〜2,000ヘルツの周波数で液滴を生成することができるピエゾ電気的に駆動される分注システムは、購入することができる。液滴は、ほぼ100％の効率5でICPMSに輸送することができる。これらの微小液滴ディスペンサーを定量的に、単一のナノ粒子5,6を測定するだけでなく、個々の生物細胞7を特徴付けるため適用されている。サーマルインクジェット技術8に基づいて、同様のシステムは、生物学的試料9の分析のために試験した。 AvaIであるが可能な標識、単一の液滴を導入するシステムは、少量の試料に使用することができ、非常に効率的であり、ナノ粒子および細胞の分析のために期待され、それらはいくつかの制限を有する。 （カスタム設定10を使用しない限り）は、固定ノズルサイズ、液滴サイズがわずかに変化させることができる。液（pH、塩含有量）の物理的特性の変化は、液滴の特性（サイズ、射出速度）を変更することができる。また、これらのデバイスは、目詰まりを起こしやすい、かなり高価であり、清掃が困難である。 液滴を生成するための別の方法は、液滴マイクロ流体11の分野でよく知られている。近年、液滴マイクロ流体は、（バイオ）化学反応12-15のための、単一細胞の研究16,17のための関心を集めている。さらに、この技術は、エレクトロスプレーイオン化質量分析法18,19でサンプルを導入するためのマトリックス支援レーザー脱離/ ionizatioにサンプルを調製するために適用したn個の質量分析20,21。 最近、我々はICPMS 22における試料導入のためのマイクロ流体ベースのシステムを導入しました。私たちの導入システムの重要な構成要素は、液体補助滴吐出（LADE）チップである。このチップは、完全にポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）からなる。焦点第チャネル接合流に試料水溶液（ 図1）の単分散液滴を生成するために使用される。この目的のために、揮発性の高い（58〜60°C 23の沸点）と非混和性キャリア位相パーフルオロヘキサン（PFH）は（ 図1）が使用される。これらのPFHプロパティは、安定した液滴の生成とキャリア位相の高速な除去を可能にする。この生成方法は以下のサンプル液の影響の特性の変化は、他の液滴発生器と比較して。液滴サイズは水性相およびPFHの流量を変更することによって広い範囲にわたって調整可能である。下流secondarでyの接合は、よりPFHは少なくとも1m秒の流速を増加させるために添加されている-1。この速度で液体が液滴破壊（ 図1の挿入図）することなく安定した直進ジェットチップ（ 図1）から排出することができる。このダブルジャンクショ​​ンの設計は、液滴発生の独立した吐出安定性を制御することができる。液滴は、カスタマイズされた輸送システムをICPMSに輸送される。このシステムは、落下管およびPFHを除去するための膜desolvatorを含む。水性液滴の乾燥した残渣は、その後ICPMSと質量検出器は、イオンのプラズマ中でイオン化される。チップの前部は、樽型の液滴搬送システムとの緊密な接続を確保することである。ノズルとの接触が回避されるためPFH液滴として水性試料の吐出が、有益である。これはかなりの細胞懸濁液または共で作業するとき問題になる可能性がノズルの目詰まりのリスクを、低下ncentrated塩溶液。 PDMSソフトリソグラフィーによって作製LADEチップは、、、（材料費チップあたり約2ドル）安い使い捨ておよび変更が容易です。手作業の少量のみを必要とする加工と組み合わせて、各実験は、新しいチップを用いて行うことができる。したがって、面倒な清掃が必要とされず、相互汚染が最小化される。 ここでは、ソフトリソグラフィによるLADEチップの製造とICPMSへの応用が記載されている。水溶液細胞懸濁液を用いた測定の例が提示されている。

<table><tbody><tr><td>Silicon wafer 100 mm</td><td>Si-Mat (Kaufering, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2002</td><td>Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Microchem Corp.(アメリカ・マサチューセッツ州)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merk VWR (ダルムシュタット、ドイツ)</td><td>100014</td><td></td></tr><tr><td>MR-developer 600</td><td>Microresist Technology GmbH (ベルリン、ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merk VWR (ダルムシュタット、ドイツ)</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-パーフルオロデシルトリクロロシラン</td><td>ABCR-Chemicals社(ドイツ・カールスルーエ社)</td><td>AB111155</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184シリコーンエラストマーキット(PDMS)</td><td>Dow Corning社(米国・ミシガン州)</td><td>39100000</td><td></td></tr><tr><td>パーフルオロヘキサン 99%</td><td>Sigma-Aldrich(米国ミズーリ州)</td><td></td><td></td>281042</tr><tr><td>FC-40</td><td>ABCR-Chemicals(ドイツ、カールスルーエ)</td><td>AB103511</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水&nbsp;</td><td>Life Technologies(英国、ペイズリー)&nbsp;</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水中の赤血球</td><td>Rockland Immunochemicals Inc.(ペンシルベニア州、米国)&nbsp;</td><td>R400-0100</td><td></td></tr><tr><td>単一元素標準溶液 Na, Fe</td><td>Inorganic Ventures (Virginia, U.S.A.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多要素標準ソリューション&nbsp;</td><td>メルク・ミリポア(米国・マサチューセッツ州)</td><td></td><td>IV</td></tr><tr><td>硝酸</td><td>サブボイルド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超高純度水</td>メル<td>クミリポア(マサチューセッツ州、米国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート HP 160 III BM</td><td>Sawatec (Sax, Switzerland)</td><td></td>ウェ<td>ハ調製に使用</td></tr><tr><td>スピンモジュール SM 180 BM</td><td>Sawatec (Sax, Switzerland)</td><td></td>ウェ<td>ハ調製に使用</td></tr><tr><td>高解像度フィルムフォトマスク</td><td>Microlitho(エセックス、英国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステッププロファイラーDektak XTアドバンスド</td><td>ブルカー&nbsp;(アメリカ・マサチューセッツ州)</td><td></td><td></td></tr><tr>レプリカ成形に使用した<td>ホットプレートMR3002</td>ハイ<td>ドルフ(ドイツ・シュヴァーバッハ)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1.5mmバイオプシーパンチャー</td><td>ミルテックス(アメリカ・ペンシルベニア州)</td><td>33-31AA/33-31A</td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター&nbsp;WS-400 BZ-6NPP/LITE</td><td>ローレル (アメリカ・ペンシルベニア州)</td><td></td><td>接着剤接着に使用</td></tr><tr><td>シリンジポンプ neMESYS</td><td>Cetoni(コルブッセン、ドイツ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mlシリンジ&nbsp;</td><td>Codan(レンサーン、ドイツ)&nbsp;</td><td>62.1002</td><td></td></tr><tr><td>5 mlシリンジ&nbsp;</td><td>B.ブラウン(メルズンゲン、ドイツ)&nbsp;</td><td>4606051V</td><td></td></tr><tr><td>PTFEチューブ&nbsp;</td><td>PKM SA(スイス、Lyss)&nbsp;</td><td>PTFE-AWG-TFT20です。N</td><td></td></tr><tr><td>四重極ベースの ICPMS ELAN6000</td><td>PerkinElmer (マサチューセッツ州、米国)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>膜脱溶媒介剤 CETAC6000AT+</td><td>CETAC Technologies社(米国・ネブラスカ州)&nbsp;</td><td></td><td>脱ソルバタユニットのみ使用</td></tr><tr><td>ハイスピードカメラ Miro M110</td><td>Vision Research(アメリカ・ニュージャージー州)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>データ解析プログラム Origin pro</td><td>OriginLab Corp.(アメリカ・マサチューセッツ州)</td><td>version 8.6</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス (東京)</td><td>IX71</td><td></td></tr></tbody></table>

icpmsサンプル導入のためのマイクロ流体チップ

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

このプロトコルは、誘導結合プラズマ質量分析（ICPMS）用の試料導入システムのような使い捨ての低コストのマイクロ流体チップの製造および使用方法を説明します。チップは、パーフルオロヘキサン（PFH）で単分散水性試料液滴を生成します。水性液滴の大きさと頻度は40〜60ミクロンの範囲で、それぞれ90〜7,000ヘルツから変化させることができる。液滴は、PFHの第二の流れとチップから排出され、排出時に無傷のままされている。特注の脱溶媒和システムはPFHを削除し、ICPMSに液滴を輸送する。ここで、狭い強度分布に非常に安定した信号は、液滴の単分散性を示し、測定することができる。我々は、導入システムは、定量的に、単一のウシ赤血球の鉄を決定するために使用できることを示している。将来的には、導入装置の機能を容易に追加のマイクロ流体モジュールを統合することによって拡張することができる。

提示システムは、細胞又はナノ粒子を含む溶液または懸濁液の小体積を測定するために用いることができる。単一細胞の標準溶液および特性の測定の例は、ここに示されている。以上の例はVerboket ら 22に見出すことができる。 典型的には溶液の単一の液滴の信号が非常に短いイベントがある。これは、通常、数百マイクロ秒26のために持続する。ここで使用ICPMS（時間10ミリ秒滞留）でこれらのような短い信号が一時的に解決することはできません。 図7aおよび図7bはナトリウム標準溶液の信号と周波数分布ヒストグラムを示している。液滴は、時間的ジッタ&gt; 10ミリ秒でプラズマに到着。検出が同期していないです。 1（201±24）、2（381±34）または3（560±45）の信号は、液滴は、1滞留時間内に検出されている。シグナル強度の低い変動が高いdroを示唆plet単分散。最初のテーリングピークはおそらく液滴断片の結果である。この断片化の原因はまだ調査中である。 </p...

我々は、誘導結合プラズマ質量分析（ICPMS）離散液滴試料導入システムを提示する。これは、90から7000 Hzまでの周波数で40〜60ミクロンのサイズ範囲で非常に単分散液滴を生成し、安価で使い捨てマイクロ流体チップに基づいています。

ICPMSサンプル導入のためのマイクロ流体チップ

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

この手順の目的は、単一細胞または水溶液を含む単分散マイクロドロップレットを生成し、ICP-MSを用いてその元素組成を定量的に分析することである。まず、PDMSを用いたレプリカ成形によりマイクロフルイディクチップを作製し、次にシリンジポンプをそのマイクロフルイディクチップに接続することでこれを達成する。ポンプにより、水系試料と、揮発性が高く許容される有機キャリア相であるPFHが供給されます。シリンジポンプを起動すると、マイクロ流体チップ内でPFHによるフローフォーカスが行われ、水系試料溶液または細胞懸濁液の単分散液滴が生成され、これらの液滴は追加のPFHと共に液体ジェットとしてチップから排出されます。最終ステップとして、液滴を蒸発させるカートリッジヒーターと、I-C-P-M-Sによる液滴内容物のイオン化および検出の前に溶媒を除去するメンブレン脱溶媒装置からなる輸送アセンブリにチップを挿入します。最終的に、記録された信号と標準溶液による校正測定を用いて、試料溶液または懸濁液中の細胞の元素組成を決定します。既存の手法に対する本マイクロ流体技術の主な利点は、液滴サイズを調整可能であること、試料消費量が少ないこと、そして細胞懸濁液や高濃度塩溶液を扱う際の目詰まりのリスクが低いことです。さらに、低コストの使い捨てマイクロ流体チップを使用することで、洗浄時間を省き、クロスコンタミネーションを排除できます。本手順のデモンストレーションを行うのは、Professor GTAの研究室の博士課程学生であるall vin scと、私の研究室の博士課程学生であるPascal Fabricaです。マイクロファブリケーション（微細加工）工程を開始するために、大きなプラスチック製ディッシュに40 gのPDMSと4 gのPDMS硬化剤を量り取ります。スパチュラで両者を均一に混ぜ合わせ、ディッシュを真空デシケーターに入れ、20〜30分間脱気して混合物からすべての気泡を除去します。脱気を行いながら、微細構造シリコンウェハーの上にキャスティングモールドを配置し、設計周囲のガイド構造を利用して、平坦なシリコンウェハー上に固定します。さらに、別のキャスティングモールドをその上に自由に配置します。脱気したPDMS混合物を、両方のキャスティング用モールドに約3〜4 gずつ注ぎます。両方のシリコンウェハーをホットプレートに移します。PDMSを150 °Cで6分間硬化させ、その後冷却します。室温でベンチ上に置いた凝固したPDMS構造体を、金属製スパチュラを用いて取り出します。凝固したPDMSブロックを型から慎重に分離してください。両ブロックの接合面に、粒子や指紋による汚染が付着しないように保護します。透明なスコッチテープを一層貼ることで、PDMS片を扱いやすくし、ハサミでサイズに合わせて切り出すことができます。切り出した後、マイクロ構造を持つPDMSブロックからテープを取り除き、バイオプシーパンチを用いてマイクロ流路の入口ポートを作成します。これでデバイスのマイクロ構造側の作製プロセスが完了し、もう一方の平面的なパーツと接合および組み立てを行う準備が整います。PDMSとPDMSのボンディングに向けた準備として、まず、ブランクシリコンウェハー上にPDMS硬化剤をスピンコートし、6,000 RPMで30秒間処理します。硬化剤がまだ濡れている状態で、マイクロ構造化PDMSブロックのボンディング界面をウェハーに接触させ、PDMSの上から軽く圧力をかけて、気泡のないシームレスなシールを形成します。別の工程で、平坦な相手方の保護テープを取り除きます。その後、マイクロ構造化PDMSをシリコンウェハーからゆっくりと剥離させます。2つのPDMS片を慎重に合わせ、2つの接合界面を接触させます。2つのブロックを軽く押しつけ、界面の気泡を除去し、組み立てたPDMSチップを室温で24時間硬化させます。カッターナイフとアライメントデバイスを使用して、出口ノズルに対して垂直に指標線に沿って切断します。顕微鏡下でチップを観察し、露出した出口ノズル付近にトリミングの欠陥や粒子の汚染がないかを確認します。作製品質を確認した後、PDMSマイクロチャネルの内面をシロキサン化する準備をします。化学薬品用フード内で、ウォルフボトルの片端を乾燥窒素源に接続し、もう一方の端をPDMSチップの入口に接続します。次に、中央マニホールドに接続された複数のチューブを用いて、50 µLのセリネをウォルフボトルにピペットで加え、上蓋を密閉します。窒素キャリアストリームをオンにし、約1 mL/sの流量で、生理食塩水を含む蒸気を用いてマイクロチャネルを20分間フラッシュします。最後に、ウォルフボトルから導入チューブを外します。これで、コーティング済みPDMSチップが単一細胞質量分析測定のための質量分析実験に使用可能な状態になります。まず、有効細胞濃度が1 mlあたり1,000万個未満になるように、適切なバッファーで入力サンプルを希釈します。質量分析の準備として、まずサンプルシリンジにチューブを接続します。2本の5 mlシリンジにPFHを充填し、別の1 mlシリンジに入力サンプルを充填します。シリンジとチューブ内に溜まった気泡をすべて取り除き、2本のシリンジをシリンジポンプに取り付けます。輸送チューブが適切に配置され、すべてのガスチューブが接続されていることを確認します。次に、シリンジチューブをPDMSチップの入口ポートに接続し、シリンジポンプを3〜5分間作動させます。この流量安定化プロセスの間、ティッシュを使用して出口ポートから余分な液体を取り除いてください。チップから流出する液体が直線的なジェット状にならない場合は、5分後、清潔なティッシュでチップ出口にある可能性のある詰まりを取り除いてください。それでも改善しない場合は、現在のチップを廃棄し、新しいチップに交換してください。サイクロニックスプレーアダプターからプラグを取り外し、流量を安定させたPDMSチップをアダプターに慎重に挿入します。推奨設定に従って流量を変更し、2〜5分間かけて再び流量を安定させます。同時に、目的分析物のシグナル強度が最大になるまで、すべてのガスの流量を調整します。また、信号の最適化に合わせて、質量分析計のプラズマ出力とフォーカシングレンズ電圧を調整し、シグナル強度をさらに向上させます。質量分析計のドウェルタイムを10 millisecondsに設定し、データ収集を開始します。測定後、生データをデータ解析プログラムに転送します。一般的なデータ解析ルーチンでは、まずすべての測定値をデータビンに分け、各ビンに10ミリ秒の滞在時間あたりのカウント数を割り当てます。次に、すべてのビンに対してヒストグラムを作成し、ガウス分布関数でフィッティングを行います。個々のフィッティングの平均値と広がりは、特定の質量電荷比における平均信号強度および標準偏差を表します。キャリブレーションプロセスを開始するには、まず、サンプルと同じ流速で標準溶液を測定します。液滴生成用のPDMSチップを使用し、PFH用の5 mLシリンジ2本と、標準溶液用の1 mLシリンジ1本を準備します。次に、ペトリ皿を顕微鏡の試料ホルダーとして使用し、PDMSチップをペトリ皿に配置して、前のプロトコルの手順と同様に低倍率でチップに焦点を合わせます。高速カメラを用いて、PDMSマイクロチャネル内での液滴生成を3〜5分間安定させます。チップ上の二次接合点において水滴の画像記録を開始し、記録映像から平均液滴径を算出します。液滴の形態測定、光度測定、および速度対称性に特化した画像解析ソフトウェアを使用してください。各液滴を球体としてモデル化できると仮定し、ソフトウェアで得られた平均液滴径を用いて平均液滴体積を推定します。次に、試料の既知の分析物濃度を平均液滴体積で除し、液滴1つあたりに含まれる分析物の質量を求めます。続いて、得られた質量を原子数に換算します。最後に、液滴あたりの測定イオン数を前述の結果で除することで、全体の検出効率を算出します。この検出効率を校正量として用いることで、未知の試料中の原子数を確定させることができます。マイクロ流体液滴発生装置を用いることで、単一細胞を平均直径50ミクロン未満の単分散水相液滴内に封入し、I-C-P-M-Sで分析することが可能です。水相液滴を包む有機PFHシースは、試料がI-C-P-M-S検出器に到達する前に容易に除去できます。溶液を測定する際、液滴の高い単分散性は、特定の滞在時間内における単一、二重、または三重の液滴数から得られる信号群の分散が低くなることで観察されます。適切な校正を行うことで、単一の液滴に懸濁させた個々のウシ赤血球からの鉄含有量を測定することが可能です。このビデオを視聴することで、微量サンプルや単一粒子および単一細胞の定量的な元素分析に向けて、これらのマイクロ流体チップをどのように準備し使用するかについて、十分な理解を得ることができます。適切に実施すれば、これらのチップの作製に必要な実作業時間は1枚あたり15分未満です。さらに、チップの変更が容易であるため、高度な試料前処理のためのマイクロ流体モジュールをさらに統合したり、試料と標準物質を同時に導入して効率と試料スループットを向上させたりすることが可能です。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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ICPMSサンプル導入のためのマイクロ流体チップ

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