蛍光活性化セルソーティングを用いたラット脳組織における細胞型特異的遺伝子発現の検討

この手順の全体的な目標は、その後の解析のために、脳組織から個々の神経細胞タイプを分離することです。これは、最初に神経組織を単一細胞懸濁液に解離することによって達成されます。第2ステップでは、ミエリンを懸濁液から除去し、細胞を染色して細胞型特異的抗体を探します。

最終ステップでは、個々の細胞集団をフローサイトメトリーでソートします。最終的に、この細胞タイプ特異的な単離方法により、ユーザーは遺伝子またはタンパク質の発現の変化またはエピジェネティックな修飾を細胞タイプ特異的な方法でアッセイできるようになります。この方法は、どの細胞タイプが特定の受容体を発現するか、どの細胞タイプが特定のタンパク質を発現するか、どの細胞が特定のエピジェネティック修飾を発現するかなど、神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ち、脳内の細胞タイプ特異的メカニズムをよりよく理解することができます。

滅菌済みのカミソリの刃を使用して、成体脳組織から採取した各サンプルを6ウェル培養プレートの蓋の上の小さな30〜400ミリグラムの小片にダイス化することにより、神経解離を開始します。次に、組織を1ミリリットルのカルシウムおよびマグネシウムを含まないHBSSに浸し、すべての組織が収集されたら、ピペットを使用してサンプルを滅菌2ミリリットルの遠心分離チューブに移します。サンプルを遠心分離し、上清を吸引します。

1, 900マイクロリットルの温かい酵素を加えます。1つを混合し、サンプルを15分間インキュベートします。摂氏37度の水浴で、5分ごとに数回チューブを反転させて、沈殿した組織片を再懸濁します。

インキュベーションの終わりに、新たに調製した酵素30マイクロリットルを追加します。各サンプルに2つを混ぜ、チューブを静かに反転させます。次に、1つとラベル付けされた害虫ピペットを使用して、各サンプルを30回の上下反復で解離します。

気泡が発生しないように注意してください。サンプルを摂氏37度でさらに15分間インキュベートし、5分ごとに反転させ、続いてサンプルを害虫ピペットで解離します。2つ目は、先ほど示した通りです。

次に、3番のピペットに切り替えて、解離を繰り返し、サンプルをさらに10分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに5分ごとに反転するウォーターバスでは、単一細胞懸濁液を80ミクロンの細胞ストレーナーを介して15ミリリットルのファルコンチューブにろ過します。各ストレーナーを10ミリリットルのカルシウムとマグネシウムを含まないHBSSで洗浄して酵素反応を停止し、最後のサンプルがろ過されたときに、チューブをスピンダウンして上清を吸引し、細胞からミエリンを枯渇させます。

懸濁液は、ペレットを400マイクロリットルのミエリン除去バッファーに完全に再懸濁し、各チューブに適切な量のミエリン除去ビーズを添加します。細胞とビーズが完全に混合されるまで、溶液を上下にピペットで動かします。次に、サンプルを摂氏4度で15分間インキュベートします。

インキュベーション後、細胞が回転している間に各サンプルを5ミリリットルのミエリン除去バッファーで洗浄し、各サンプルごとに1つのカラムを磁気選別機の磁場に置き、各カラムの上にきれいな80ミクロンフィルターを置きます。各フィルターとカラムを1ミリリットルのミエリン除去バッファーで3回すすぎ、すべての流れを廃棄物容器に集めます。最終すすぎ後、5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブを各カラムの真下に置き、溶出液を回収します。

次に、サンプルからスーパーを吸引し、ペレットを500マイクロリットルのミエリン除去バッファーに再懸濁します。すぐに細胞懸濁液をカラムに塗布し、下のチューブに細胞を回収します。次に、各フィルターとカラムを1ミリリットルのミエリン除去で4回すすぎます(洗浄ごとに緩衝液)。

最後の洗浄後、細胞をスピンダウンし、上清を吸引して細胞を染色し、フローサイトメトリーによる選別を行います。各サンプルを約2秒間ボルテックスしてペレットを解離し、各チューブから1マイクロリットルの細胞を個々のチューブに移します。染色コントロールについては、染色コントロールを含め、すぐに5マイクロリットルのFCブロックを各チューブに追加します。

次に、サンプルを再度ボルテックスし、摂氏4度でインキュベートします。5分後、適切な一次抗体カクテルを100マイクロリットル追加します。抗体を光から保護するためにチューブを覆い、細胞を摂氏4度で20分間インキュベートします。

インキュベーションの終了時に、サンプルを2ミリリットルの洗浄バッファーで洗浄し、次に上清を吸引し、各サンプルを100マイクロリットルの適切な二次抗体で標識します。チューブに蓋をして、摂氏4度に15分間置きます。次に、サンプルを2ミリリットルの洗浄バッファーで洗浄し、サンプルを遠心分離してから吸引します。

上清Resusは、無菌PBSの250マイクロリットルでペレットを懸濁し、ここで細胞を選別し、単一の男性の海馬からの神経細胞の代表的なフロー選別集団は、細胞がそれらの前方および側方散乱特性に基づいてすべての可能なイベントから最初にゲートされたことが示されています。次に、単一細胞またはシングレットを、個々の細胞型の正確な選別を可能にするために、それらのサイズに基づいて任意のダブレットまたはより大きな細胞塊からゲート化し、次いで、単一細胞をCD11、B陽性、およびCD11B陰性細胞集団に選別し、さらにCD11B陰性細胞をGT1およびTH1陽性細胞に選別した。次に、分析プログラムを使用して、各集団のイベントの総数と親集団の割合を決定し、選別された細胞の純度を確認しました。

この特定の例では、代替細胞型特異的遺伝子の相対的な遺伝子発現をリアルタイムPCRによって分析しました。予想通り、これらのデータにより、選別された細胞の純度が確認されただけでなく、調査した脳領域全体でいくつかの興味深い違いが特定されました。その種の純度を確認した後、他の目的遺伝子の発現を測定して、それらが発現する特定の細胞タイプ、またはそれらの発現が処理後に細胞タイプ特異的な方法で変化するかどうかを決定することができます。

例えば、ここでは、海馬および小脳のニューロンを同定するためによく使用されるカルシウム結合タンパク質であるウシ結合の発現が調査された。このビデオを見れば、適切な細胞表面抗体を使用して、ここに示されている神経細胞など、特定の種類の神経細胞を単離する方法を十分に理解できるはずです。