Name: 蛍光活性化セルソーティングを用いたラット脳組織における細胞型特異的遺伝子発現の検討 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶラット脳組織から蛍光活性化セルソーティングを用いて神経細胞型を分離する手法。細胞型特異的な遺伝子発現やエピジェネティック修飾を解析し、脳の細胞特異的メカニズムを理解する基礎となる。

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著者は、技術支援のためにヘレン・F・グラハムがんセンターのデラウェア大学トランスレーショナルリサーチセンターのLynn Opdenaker氏に感謝し、デューク大学がん研究所フローサイトメトリー共有リソースのNancy Martin氏、そして方法とデータ収集の指導についてSusan H. Smith博士に感謝したいと思います。

1. ティッシュコレクションの準備 (15 – 30 分)
<ol>
	<li>パスツールガラス製ピペットを3セット、直径を小さくしてファイヤーポリッシュし、「1」=直径約1mm、「2」=直径約0.75mm、「3」=直径約0.50mmの番号を付けます。</li>
	<li>凍結乾燥酵素AをすべてのバッファーAとともに再懸濁します。これは、Neural Dissociation Kitに付属のプロトコルに従って行われます(材料表を参照)。渦巻きにしないでください。溶液を50μlのアリコートに分注し、後で使用するために-20°Cで保存します。</li>
	<li>滅菌用のミエリン除去バッファーと真空フィルター1Lを作製します[ミエリン除去バッファー=0.1Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)1,000ml、500mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)2ml、ウシ血清アルブミン(BSA)10g]。</li>
	<li>ナイロンメッシュシートを小さな1 x 1インチ(2.5 x 2.5 cm)の正方形にカットし、アルミホイルで覆われた小さなビーカーで細胞の破片とオートクレーブをろ過するために使用されます。</li>
	<li>1 Lの洗浄緩衝液を調製します[洗浄緩衝液= 1,000 mlの0.1 M PBS、2 mlの500 mM EDTA、および10 g BSA]。</li>
</ol>
2. ティッシュコレクション
<ol>
	<li>ウォーターバスを37°Cにオンにします。</li>
	<li>Buffer Xにβ-メルカプトエタノールを最終濃度0.067 mMまで添加し、Neural Dissociation KitからBuffer Xを調製します(4サンプルにつき、13.5 μlの50 mM β-メルカプトエタノールを10 mLのBuffer Xに加えます)。</li>
	<li>Neural Dissociation Kitのプロトコルに記載されているように、各サンプルに対して50 μlのEnzyme Pと1,900 μlのBuffer Xを混合して、Enzyme Mix 1を調製します。たとえば、4つのサンプルに対して、200 μlのEnzyme Pと7,600 μlのBuffer Xを混合します。</li>
	<li>バッファーXを37°Cのウォーターバスに入れます。</li>
	<li>2 mLの冷たいハンク緩衝塩溶液(HBSS)(Ca++およびMg++なし)を、収集して組織解剖のために氷上に保管するサンプルごとに、滅菌6ウェル培養プレートの1ウェルに入れます。</li>
</ol>
3. 組織解剖 (45分〜1時間)
<ol>
	<li>Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)のガイドラインに従って、適切な量の安楽死溶液(市販のバルビツール酸溶液、Euthasolなど)を動物に注射し、すべての血液を冷たい0.9%生理食塩水で灌流します。
	<ol>
		<li>安楽死溶液の過剰摂取でラットを投与します。.</li>
		<li>呼吸とつま先つまみによる麻酔のモニター。動物が十分に麻酔をかけられた場合(つま先をつまむ反応がなく、深くゆっくりとした呼吸)、ラットを灌流することができます。</li>
		<li>ラットを灌流するには、頑丈なハサミで胸腔を切り開きます。横隔膜をカットして、心臓までアクセスできるようにします。肋骨を両側に沿って胸の上部に向かって切り、心臓に完全にアクセスできるようにします。その時点で、一対の止血器を使用して胸郭を横に保持できます。</li>
		<li>電動ポンプに取り付けた18Gの針(成体ラット用)を心臓の左心室に挿入して心臓灌流を行います。ポンプは冷たい0.9%生理食塩水を汲み上げています。</li>
		<li>次に、小さなハサミで右心房を切り開き、血液と液体の灌流液が体から排出</li>されるようにします。
		<li>ラットに約10ml(成体ラット用)の0.9%生理食塩水を投与して、すべての末梢免疫細胞と因子を除去します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滅菌のかみそりの刃と適切な解剖を使用して脳領域の目的の部分を解剖し、組織片をCa2+およびMg2+. を含まない冷たいHBSSに入れます
	注:プロトコルでは、これらのイオンが神経解離に必要な酵素に干渉する可能性があるため、プロトコルの初期段階でCa2+およびMg2+を含まないHBSSが必要です。</li>
	<li>すべての組織サンプルが収集されたら、クリーンベンチまたは滅菌培養フードに戻り、組織処理を行います。</li>
</ol>
4. 神経解離 (1 時間)
<ol>
	<li>各組織サンプルを、6ウェル培養プレートの蓋にある滅菌済みのカミソリの刃を使用して、細かく刻みます。このプロトコルは、約30〜100 mgの組織サンプルに使用されていますが、最大400 mgの組織サンプルには承認されています。400 mgを超える組織サンプルの場合、試薬の量を適切にスケールアップする必要があります。</li>
	<li>Ca2+およびMg2+を含まない新鮮なHBSS1 mLを使用して、さいの目に切った組織片をピペットで滅菌済みの2 mL遠心分離チューブに移します。すべてのサンプルが2mlの遠心分離チューブに移されるまで、すべてのサンプルに対して手順4.1と4.2を繰り返します。</li>
	<li>サンプルを300 x gでRTで2分間遠心分離し、上清を吸引します。</li>
	<li>ステップ2.2および2.3で調製した温かいEnzyme Mix 11 1,900 μlを各サンプルに加え、チューブを閉じます。</li>
	<li>サンプルを37°Cのウォーターバスで15分間インキュベートし、5分ごとに数回チューブを反転させて、沈殿した組織片を再懸濁します。</li>
	<li>その間に、20 μlのBuffer Yと10 μlの解凍したEnzyme Aを混合してEnzyme Mix 2を調製します(4つのサンプルに対して、80 μlのBuffer Yと40 μlの解凍したEnzyme Aを混合します)。</li>
	<li>各サンプルに30 μlのEnzyme Mix 2を加え、穏やかに反転させます。渦巻きにしないでください。</li>
	<li>各組織サンプルをパスツールピペット「1」で解離し、30回上下に粉砕します。</li>
	<li>サンプルを37°Cのウォーターバスで15分間インキュベートし、5分ごとに数回チューブを反転させて、沈殿した組織片を再懸濁します。</li>
	<li>各組織サンプルをパスツールピペット「2」で解離し、30回上下に粉砕します。気泡の発生を避けてください。</li>
	<li>各組織サンプルをパスツールピペット「3」で解離し、30回上下に粉砕します。気泡の発生を避けてください。</li>
	<li>サンプルを37°Cのウォーターバスで10分間インキュベートし、5分ごとに数回チューブを反転させて、沈殿した細胞を再懸濁します。</li>
	<li>15 mLのファルコンチューブの上に置いた80ミクロンの細胞株にシングルセル懸濁液を塗布して大きな破片を取り除き、フィルターと細胞を10 mLのHBSS(Ca2+およびMg2+を含む)で洗浄して酵素反応を停止します。各サンプルがきれいな15 mlのファルコンチューブに移されるまで繰り返します。</li>
	<li>サンプルを300 x gでRTで10分間遠心分離し、上清を吸引します。</li>
</ol>
5. ミエリンの枯渇 (45分)
<ol>
	<li>細胞のペレットを400 μlのミエリン除去バッファーで完全に再懸濁します。</li>
	<li>指定量のミエリン除去ビーズとピペットを上下に添加して完全に混合します. 
	注:使用されるミエリン除去ビーズの量は、組織のサイズ、動物の年齢、およびその特定の脳領域で予想されるミエリンの量によって異なります。例えば、成体ラットの海馬サンプル(約300 mg)の場合、サンプルを100 μLのミエリン除去ビーズとインキュベートします。
	
</li>
	<li>4°Cの冷蔵庫で15分間インキュベートします。</li>
	<li>各サンプルを5 mLのミエリン除去バッファーで洗浄します。</li>
	<li>サンプルを300 x gでRTで10分間遠心分離します。</li>
	<li>サンプルを遠心分離しながら、各サンプルにつき1カラムを磁気ソーターの磁場に置き、各カラムの上部にきれいな80ミクロンフィルターを置きます。</li>
	<li>カラムを調製し、各カラムを1 mLのミエリン除去バッファーで3回(合計3 mL)すすいでろ過します。すべてのフロースルーを、空のチップボックスの底などの廃棄物容器に集めます。</li>
	<li>サンプル収集の準備のために、5 mlのポリスチレン丸底チューブを各カラムの真下に配置します。</li>
	<li>細胞の遠心分離が終了したら、上清を吸引し、500 μlのミエリン除去バッファーに完全に再懸濁します。直ちに細胞懸濁液をカラムに塗布し、下のチューブに細胞を回収します。</li>
	<li>フィルターとカラムを1 mLのミエリン除去バッファーで4回(合計4 mL)洗浄します。</li>
	<li>セルコレクションを300 x gでRTで10分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引すると、細胞を染色する準備が整います。</li>
</ol>
6. FACS用生細胞の染色(染色に1時間)
<ol>
	<li>細胞を短時間ボルテックス(2秒)してペレットを分離し、直ちに5μlのFcブロック(分化防止クラスター32、CD32)を加え、再度ボルテックスし、冷蔵庫で4°Cで5分間インキュベー</li>トします。
	<li>一方、洗浄バッファー100 μlごとに、アロフィコシアニン(APC)標識CD11b抗体(1:800)、抗GLT1抗体(1:100)1 μl、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-標識Thy1抗体(1:250)0.4 μlの3つの一次抗体を洗浄バッファーに添加して、一次抗体混合物を調製します。各サンプルには、インキュベーション用の一次抗体混合物100 μlが入られます。ただし、サンプルが400 mgの組織よりもはるかに大きい場合は、それに応じて一次抗体混合物の量を増やすことを検討することをお勧めします</li>
	<li>各サンプルチューブからわずか2 μlの細胞を取り出し、各シングル染色コントロールチューブに添加して、シングル染色コントロール用のチューブを調製します。「シングルステイン」コントロールには、APC-CD11bのみ、GLT1のみ、FITC-Thy1のみ、PE二次抗体のみ、および「ブランク」または未染色のコントロールが含まれます 
	注:すべてのサンプルはすべての染色コントロールで表されるべきであり、したがって、各サンプルから2μlの細胞を各染色コントロールチューブに添加する必要があります。</li>
	<li>チューブを短時間ボルテックスし (2 秒)、各サンプルチューブに 100 μl の一次抗体混合物を、各染色コントロールチューブに 100 μl の適切な一次抗体を加え、再度チューブをボルテックスし、チューブをアルミホイルで覆って蛍光抗体を光から保護し、チューブを 4 °C の冷蔵庫で 20 分間インキュベートします。サンプルと抗体の完全性を維持するために、残りの手順ではサンプルを冷却(4ºC)に保つ必要があります。</li>
	<li>チューブを短時間ボルテックスし、各チューブに2mlの洗浄バッファーを追加します。</li>
	<li>チューブを350 x gで4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>その間、洗浄バッファー100 μlごとに0.2 μlのPE標識抗ウサギ二次抗体を添加して、二次抗体混合物を調製します。各サンプルには、100 μlの二次抗体混合物が入っています。ただし、サンプルが400 mgの組織よりもはるかに大きい場合は、それに応じて一次抗体混合物の量を増やすことを検討することをお勧めします。</li>
	<li>遠心分離が完了したら、各サンプルの上清をシンクに捨て、チューブを逆さまにしてペーパータオルで拭き取ります。</li>
	<li>チューブを短時間ボルテックスし、各サンプルチューブに100 μlの二次抗体混合物を、各染色コントロールに適切な二次抗体を加え、再度チューブをボルテックスし、チューブをアルミホイルで覆い、チューブを4°Cで15分間インキュベートします 
	注:GLT1のみの染色コントロールチューブは、二次抗体混合物を採取する必要があります。
	
</li>
	<li>インキュベーション後、チューブを短時間ボルテックスし、各チューブに2 mLの洗浄バッファーを加えます。</li>
	<li>チューブを350 x gで4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>遠心分離が完了したら、各サンプルの上清をシンクに捨て、チューブを逆さまにしてペーパータオルで拭き取ります。</li>
	<li>チューブをボルテックスし、各チューブに0.25mlの滅菌PBSを追加します。サンプルは選別する準備ができています. 
	注:より多くの細胞が0.5mlの滅菌PBSを必要とする場合があります。ただし、サンプルが細胞で濃縮されすぎると、サンプルは常に希釈されるため、少量から始めるのが最善です. 
	注:オプションでDNaseをチューブに追加して、細胞の凝集を防ぎ、ソーターの目詰まりを防ぎます。サンプルは、ソーターの詰まりを避けるために、ソーティングの直前に滅菌済みの80ミクロンフィルターを使用してろ過することもできます。
	
</li>
	<li>氷上の選別機に細胞を運びます。細胞集団を2 mLのヌクレアーゼフリー遠心チューブに集め、各チューブに0.5 mLの滅菌PBSを入れます。</li>
	<li>ソート後、細胞を300 x gで2分間4°Cでスピンダウンします。PBSの大部分を吸引し、-80°C冷凍庫で細胞を急速凍結し、RNA抽出(1のプロトコルの詳細を参照)、DNA抽出(2のプロトコルの詳細を参照)、またはタンパク質分析の細胞溶解のいずれかのさらなる処理を行います。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

他の多くの組織やシステムと同様に、脳は不均一な細胞集団で構成されており、一緒に機能して行動に影響を与えます。その不均一な集団内の個々の細胞からの遺伝子発現、タンパク質発現、またはエピジェネティック修飾の分析は、システム全体の機能に関する情報を明らかにし、正常な行動と疾患プロセスの両方を調節する細胞プロセスを同定し、潜在的な治療のための細胞型特異的標的を提供する可能性があります。将来的には、脳内の単一細胞型の機能を変更することで、神経変性疾患や精神神経疾患をより特異的な方法で治療し、複数の細胞型に影響を与えることによって引き起こされる非特異的な副作用を軽減する鍵が解き放たれる可能性があります。したがって、将来の神経科学研究の重要な焦点は、脳内のさまざまな細胞型の相互作用と、それらが行動や病状にどのように影響するかを理解することを目指す必要があります。ここで説明するFACS技術の目的は、その後の分析のために個々の細胞集団を迅速に単離することです。また、関心のある研究に応じて、より特定の細胞タイプを分析するように変更することもできます。
プロトコル内には、この技術を使用して単離された神経...

以下に記載されたプロトコルの目的は、細胞型特異的遺伝子発現、タンパク質発現、あるいはエピジェネティックマーカーのその後の分析のために、神経組織の不均質な集団から個々の細胞型を単離することです。脳は、異なる前駆細胞に由来する多くの細胞型で構成され、それは、細胞型特異的な特性及び機能を有します。これらの違いにもかかわらず、これらの異なる神経細胞型は、測定または従来の方法を使用して、細胞型特異的に解釈することは困難で、これらの複数のユビキタスタンパク質の分析を行う類似の受容体および細胞内シグナル伝達分子を発現することができます。神経科学者は、脳内のこれらの異なる細胞型の機能および活性化を識別する必要があり、これは最終的には神経学的および神経精神疾患のためのより具体的な薬剤および治療標的を同定するための最初のステップになるように、彼らは個別に動作に影響を与えることができる方法。 Tにもかかわらず、神経科学研究の彼の包括的な目的は、遺伝子またはタンパク質発現、シグナル伝達分子の活性化、またはDNAにエピジェネティックマーカーの修飾を分析するための脳からの個々の神経細胞型を単離することは困難であっできます。細胞型特異的マーカーの追加の染色と組み合わせた場合、これは適切にタンパク質を染色することができる特異的な抗体に依存しているが、現在使用されている技術のうち、免疫組織化学は、細胞型特異的な様式でタンパク質の発現を同定することができます興味のある、それはin situハイブリダイゼーションでは 、脳内の個々の細胞内メッセンジャーリボ核酸（mRNA）の特定の局在を同定することができる。定量化することは困難であるが、これは、特定の細胞型の同時分析を制限する骨の折れるプロセスであり、のみ関心のある1または多分少数の遺伝子の分析を可能にします。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、視覚化される細胞の亜集団を単離するためにレーザーを使用して顕微鏡を介して、しかし、このプロセスの時間がかかり、自然と比較的低い収率が著しく、これらの分子の発現はそもそも低い場合は特に、タンパク質またはmRNAレベルのその後の分析を制限することができます。蛍光活性化細胞選別（FACS）は、神経科学の分野では比較的新しい技術は、遺伝子発現1および/ ​​またはエピジェネティックなターゲット2のその後の分析のために脳からの個々の細胞型を単離することです。このプロセスは、細胞型特異的遺伝子発現、タンパク質発現、またはエピジェネティックマーカーのその後の分析のために神経細胞の特定のタイプを分類するために使用することができます。 FACSは、物理的または生化学的特徴3のいずれかに基づいて異なる細胞をカウントし、ソートするために、このような数十年のための癌および免疫学などの医学研究のフィールドの数で使用されています。また、フローサイトメトリー古典特異的な抗体を用いて、セルごとにタンパク質の発現を分析するために使用されているフロー。以下の手順は、分子生物学のエンドポイントの、その後の分析のために個々の細胞型を単離するために、古典的なフローサイトメトリー技術を利用します。フローサイトメーターは、上述した技術への迅速かつ効率的な代替手段になります第二に、数千の細胞を分析することができます。さらに、細胞は、特定のタンパク質（例えば、神経伝達物質受容体）、または2つ以上のタンパク質（特定の細胞型における複数のタンパク質の共局在化）の組み合わせの細胞の発現に基づいて単離することができます。これにより、ユーザは、脳内でそれらの機能を識別するために、それらの分子の特性に基づいて、非常に選択的な神経細胞タイプを単離することができます。 FACSを実施するために、神経細胞は、それらが光ビームと分析のためのレーザを通して単一ファイルを通過するように細胞を搬送し、整列フローセルを通過する単一の細胞懸濁液中に調製されます。コンピュータは、各セルとpからデータを取得します。指定されたパラメータ（サイズ、粒度、および蛍光）の分析のためのヒストグラム上たくさんそれを。これらのパラメータに基づいて、細胞はすぐに記憶し、所望の任意のエンドポイントの、その後の分析のために別々のチューブに選別することができます。以下に記載されているプロトコルは、（分化分子11B、のCD11b抗体のクラスタを使用して）（胸腺細胞抗原1、はThy1抗体を使用して）、ニューロン、アストロサイト（グリアグルタミン酸トランスポーター、GLT1抗体を使用して）、およびミクログリアをソートする3つの抗体を利用しています。以下に説明する、または1つが自分の実験のために隔離したい細胞のタイプに応じて異なる抗体で修飾されたように、このプロトコルを使用することができます。 このプロトコルは、特定の実験のために適切であるかどうかを判断する際に考慮すべきいくつかの注意事項があります。一つの大きな注意点は1つが隔離したい特定の細胞型に関係することができます。このプロトコルでは、使用される3つの抗体は、その細胞外の抗体であります実験者は、このように内部のRNA、DNAおよびタンパク質の完全性を維持し、染色手順の間、無傷の細胞型を維持することを可能にします。それは一つだけで、特定の細胞内で発現されるタンパク質を同定する抗体を使用して、特定の神経細胞型を単離することを望む可能性があります。例えば、1はヒドロキシラーゼをチロシンまたはコリンアセチルトランスフェラーゼに対する抗体を用いたアセチルコリン神経細胞を単離するために抗体を用いてドーパミン作動性ニューロンを分離することができます。これらのタンパク質は、細胞内であり、従って、適切な抗体を用いたその後の染色のために細胞膜の固定および透過処理を必要とします。これは、4,5の前に行われてきたが、このプロセスはかなりこれらの透過性細胞からのRNAまたはDNAの収量を減少させることができます。もう一つの注意点は、すべての抗体は、FACSに適していることであってもよいです。例えば、1は現在、ウェスタンブロットのために非常にうまく機能する抗体、Dを必要と技術を使用してもよいですタンパク質のenaturation。この抗体は、必ずしもタンパク質がこのプロトコルのいずれかの時点で変性されていないので、抗体は、その固有の抗原に結合する方法がないことが指定されたFACSを使用してこれらの細胞型の同定に適していないかもしれません。企業は、抗体が承認されたアプリケーションを特定仕様書を提供しています。抗体は、フローサイトメトリーのために承認されていない場合には、特定の抗体を用いて、このプロトコルを試みてから1を妨げるべきではありません。しかし、人はそれをFACSのために動作することが保証されていないことに注意する必要があります。このプロトコルの第三の注意点は1つが隔離しようとしている細胞の数に関係しています。 FACSは、組織の小さな作品から可能なほとんどの細胞を得るための優れた手法であるが、それは1つが比較的小さな脳の領域から細胞の比較的まばらな集団を単離する場合は、一匹の動物からの収量がすることも可能であり、本質的に低いこと。この場合には、とすることができますその後の分析のために必要な細胞数を得るために同一の治療群の数匹の動物からの脳組織をプールすることが必要。しかしながら、最近の刊行物は、遺伝子発現を分析することが可能であることを示す、より大きなセットソートニューロンから起動ニューロン（5〜6％）の少数の遺伝子発現のその後の分析のためのcDNAの遺伝子標的プレ増幅を使用してい動物6この技術の最後の警告を大量にプールすることなく、神経細胞の小さなサブセットから一つが離れすぎていないセルソーターへのアクセス権を持つべきであるということです。セルソーターは、それを適切に使用するにはかなりの訓練を必要とする複雑な機械です。したがって、これらのマシンは、多くの場合、中核施設で資格のある技術者によって運営されています。また、この手順の目標は、おそらく（、神経組織を解離特異的抗体のためにそれを染色し、直ちに短時間でソータにこれらのサンプルを取ることです半日）。この時間枠は、単離された細胞の生存率および収率を増加させ、後続の処理および分析のための細胞の完全性を維持するのに役立ちます。上述のこれらのパラメータの全てが満たされている場合、FACSは、神経組織からの遺伝子およびタンパク質の細胞型特異的発現を分析するための優れた方法です。 全ての実験は、実験動物の管理と使用に関するデラウェア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）と健康ガイドの国立研究所に従って行いました。

<table><tbody><tr><td>神経解離キット (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>ミエリン除去ビーズ II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-733</td><td></td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュシート</td><td>Amazon</td><td>CMN-0074-10YD</td><td>40インチ幅、80ミクロンサイズメッシュ</td></tr><tr><td>FCブロック/抗CD32</td><td>BD Biosciences BDB550270</td><td></td><td>反応</td></tr>性 <tr><td>ラットAPC標識CD11b抗体</td><td>Biolegend</td><td>201809</td><td>反応性</td></tr><tr><td>ラット ウサギ 抗GLT1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-20136</td><td>反応性 ラットまたはヒト</td></tr><tr><td>PE標識抗ウサギ二次抗体</td><td>eBioscience</td><td>1037259</td><td>抗GLT1に対する二次抗体</td></tr><tr><td>FITC標識抗ラットCD90(Thy1)マウス抗体</td><td>Biolegend</td><td>202504</td><td>reactivity for rat</td></tr></tbody></table>

蛍光活性化セルソーティングを用いたラット脳組織における細胞型特異的遺伝子発現の検討

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

脳は、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドロサイトの4つの主要な細胞タイプで構成されています。ニューロンは脳内で最も豊富な細胞タイプではありませんが、行動に影響を与える直接的な役割を考えると、これらの細胞タイプの中で最も広く研究されています。脳内の他の細胞タイプも、それらが産生するシグナル伝達分子を介してニューロンの機能と行動に影響を与えます。神経科学者は、脳内の細胞タイプ間の相互作用を理解して、これらの相互作用が神経機能や疾患にどのように影響するかをよりよく理解する必要があります。今日まで、タンパク質または遺伝子発現を分析する最も一般的な方法は、細胞の種類に関係なく、通常は血液を含む全組織サンプルの均質化を利用しています。このアプローチは、神経機能や行動に影響を与える可能性のある遺伝子やタンパク質の発現の一般的な変化を調べるための有益なアプローチです。しかし、この解析方法は、細胞型特異的な遺伝子発現や、細胞間コミュニケーションが神経機能に及ぼす影響について、より深く理解するのには役立ちません。行動エピジェネティクスの解析は、デオキシリボ核酸(DNA)構造の修飾が長期的な遺伝子発現と挙動にどのように影響するかを調べることで、ますます注目されている分野です。しかし、この情報は、個々の神経細胞タイプの特定の遺伝子に存在する可能性のある異なる系統、したがってエピジェネティックなマーカーを考慮すると、細胞タイプ特異的な方法で分析された場合にのみ関連性を持つ可能性があります。以下で説明する蛍光活性化セルソーティング(FACS)技術は、遺伝子発現、タンパク質発現、またはDNAのエピジェネティックな修飾のその後の解析のために、個々の神経細胞を単離するためのシンプルで効果的な方法を提供します。この手法は、脳内のより特異的な神経細胞タイプを分離するように変更して、その後の細胞タイプ特異的な解析に用いることもできます。

髄鞘除去と組織灌流の重要性
図1は、髄鞘除去の重要性を示しています。髄鞘除去（前述のプロトコルのステップ5.1から5.12）は、単一細胞懸濁液を髄鞘除去ビーズ中でインキュベートし、洗浄した後、磁気ソーターのコラムに通すことで行われます。これらのステップの目的は、各サンプルに含まれる細胞残骸の量を減らすことです。ニューロンを解離およびトリチュレーション（pipettingによる分散）させると、通常は髄鞘に覆われている突起がせん断され、その結果、Thy1抗体で陽性に染まる可能性があります。これにより髄鞘化した残骸が生じ、最終的に抗体染色や細胞ソートを妨げる可能性があります。さらに、各サンプルから回収される細胞の相対的な数を減少させる可能性もあります。図1において、各パネルに描かれたポリゴンは、その後のソートに向けてゲート設定および解析される生存細胞を示しています。この生存細胞用のゲートは、粒子の通過光の大きさの尺度である前方散乱光（FSC）と、顆粒性の尺度である側方散乱光（SSC）に基づいて設定されており、これにより死...

このプロトコルの目標は、蛍光活性化細胞選別(FACS)技術を使用して、細胞型特異的な遺伝子発現、エピジェネティックマーカー、およびまたはタンパク質発現のその後の解析のために、特定のタイプの神経細胞を選別することです。

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

本手順の全般的な目的は、その後の解析のために脳組織から個々の神経細胞型を単離することです。これは、まず神経組織を単一細胞懸濁液に解離させることで達成されます。第2ステップでは、懸濁液から髄鞘を除去し、その後、細胞型特異的な抗体を用いて細胞を染色します。最終ステップでは、個々の細胞集団をフローサイトメトリーにより分取します。最終的に、この細胞型特異的な単離法を用いることで、特定の細胞型における遺伝子またはタンパク質発現の変化、あるいはエピジェネティックな修飾を解析することが可能になります。本手法は、どの細胞型が特定の受容体やタンパク質、あるいは特定のエピジェネティックな修飾を発現しているかといった神経科学分野における重要な問いに答えるのに役立ち、脳における細胞型特異的なメカニズムのより深い理解につながります。滅菌済みのカミソリを用いて、成体脳組織から採取した各サンプルを6ウェル培養プレートの蓋の上で30〜400 mgの小さな断片に細切し、神経解離を開始します。次に、組織を1 mLのカルシウムおよびマグネシウム不含HBSSに浸し、すべての組織を回収した後、ピペットを使用してサンプルを滅菌済みの2 mL遠心チューブに移します。サンプルを遠心分離し、上清を吸引します。温めた酵素を1,900 µL加えます。これを混ぜ合わせ、サンプルを15分間インキュベートします。37 °Cのウォーターバスを用い、沈殿した組織片を再懸濁させるため、5分ごとにチューブを数回反転させてください。インキュベーション終了後、調製したばかりの酵素を30 µL加えます。各サンプルを2回混ぜ、チューブを静かに転倒混和します。次に、「1」と表示されたペストピペットを用い、各サンプルを30回ピペッティングして解離させます。気泡が発生しないように注意します。サンプルを37 °Cでさらに15分間インキュベートし、5分ごとに転倒混和させた後、先ほど実演したようにペストピペット（2番）を用いてサンプルを分散させます。次に、3番目のピペットに切り替え、解離を繰り返し、サンプルをさらに10分間インキュベートします。5分ごとに転倒混和しながら恒温水槽で処理し、インキュベーション終了後、単一細胞懸濁液を80 µmのセルストレーナーでろ過し、15 mLのFalconチューブに回収します。各ストレーナーを10 mLのカルシウムおよびマグネシウムフリーHBSSで洗浄して酵素反応を停止させます。最後のサンプルのろ過が完了したら、チューブを遠心分離し、上清を吸引して細胞からミエリンを除去します。ペレットを400 µLの髄鞘除去バッファーで十分に再懸濁し、各チューブに適切な量の髄鞘除去ビーズを加えます。細胞とビーズが十分に混ざるまで、ピペッティングを行います。その後、サンプルを4 °Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を回転させながら、各サンプルを5 mLの髄鞘除去バッファーで洗浄します。磁気ソーターの磁場内にサンプルごとのカラムを1本ずつ配置し、各カラムの上に清潔な80 µmフィルターを設置します。各フィルターとカラムを1 mLの髄鞘除去バッファーで3回リンスし、すべてのろ液を廃液容器に回収します。最後のリンスの後、溶出液を回収するために、各カラムの直下に5 mLポリスチレン製ラウンドボトムチューブを配置します。次に、サンプルから上清を吸引し、ペレットを500 µLの髄鞘除去バッファーで再懸濁します。細胞懸濁液をすぐにカラムに適用し、下のチューブに細胞を回収します。その後、各フィルターとカラムを、1回の洗浄につき1 mLの髄鞘除去バッファーを用いて4回洗浄します。最後の洗浄後、細胞を遠心分離し、上清を吸引して、フローサイトメトリーによるソーティングのための細胞染色を行います。各サンプルを約2秒間ボルテックスしてペレットを分散させ、各チューブから1 µLの細胞を個別のチューブに分取します。染色コントロールを含む各チューブに、直ちに5 µLのFC blockを添加します。その後、サンプルを再度ボルテックスし、4°Cでインキュベートします。5分後、適切な一次抗体カクテルを100 µL添加します。抗体を遮光するためチューブに蓋をし、細胞を4°Cで20分間インキュベートします。インキュベーション終了後、サンプルを2 mLの洗浄バッファーで洗浄し、上清を吸引除去した後、各サンプルに適切な二次抗体100 µLを添加します。チューブに蓋をし、4 °Cで15分間静置します。その後、サンプルを2 mLの洗浄バッファーで洗浄し、遠心分離を行い、上清を吸引除去します。上清を除去し、ペレットを250 µLの滅菌PBSで再懸濁して細胞を分取します。ここでは、単一の雄の海馬からフローソートされた神経細胞の代表的な集団を示します。まず、前方散乱光および側方散乱光の特性に基づいて、すべてのイベントから細胞をゲートしました。次に、個々の細胞型を正確に分取するため、サイズに基づいてシングルセル（シングレット）をダブレットやより大きな細胞塊からゲートしました。続いて、シングルセルをCD 11B陽性およびCD 11B陰性の細胞集団に分取し、さらにCD 11B陰性細胞をGFAP陽性およびTH陽性細胞に分取しました。その後、解析プログラムを用いて、各集団の総イベント数および親集団に対する割合を算出し、分取した細胞の純度を確認しました。今回の例では、別の細胞型に特異的な遺伝子の相対的な遺伝子発現をリアルタイムPCRで解析しました。予想通り、これらのデータによりソートされた細胞の純度が確認されたほか、調査した脳領域間でいくつかの興味深い違いが特定されました。ソートの純度を確認した後、他の目的遺伝子の発現を測定することで、それらがどの特定の細胞型で発現しているか、あるいは処理後に細胞型特異的に発現が変化しているかを判断することが可能です。例えばここでは、海馬や小脳のニューロンの同定によく用いられるカルシウム結合タンパク質である cow binding の発現を調査しました。このビデオを視聴することで、適切な細胞表面抗体を用いて、ここに示されているような目的の特定の神経細胞型を分離する方法について十分に理解できるはずです。

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神経科学

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