Name: 免疫不全マウスにおける口腔咽頭カンジダ症のTh17細胞炎症モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学ぶ免疫不全マウスにおけるTh17細胞による口腔咽頭カンジダ症炎症モデルの構築法。Candida albicans芽胞を用いた経口感染とフローサイトメトリー・免疫組織化学による解析手法を解説し、口腔免疫治療開発への応用可能性を示す。

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私たちは、彼女のフローサイトメーターへのアクセスを提供してくださったヘレン・バーンスタイン博士に感謝します。また、フローサイトメトリーサービスを提供してくださったCFARフローサイトメトリー施設にも感謝いたします。本事業の一部は、CTSCの基幹活用資金と、STERIS法人/大学病院感染症部門のPPへの助成を受けて行われました。

注：マウスを用いた実験は、制度的動物福祉委員会（IACUC）のガイドラインに基づいて実施した。 （感染に3日前に）I N体外培養のTh17細胞とマウス- / - 1 RAG-1を再構成する<ol><li>可溶性の存在下で単独でU底96ウェルプレート、または3×104 CD4 + CD25 +のFoxp3 + Tregのと一緒に共培養してにおけるTh17細胞、培養CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25-ナイーブT細胞（×10 3）を確立するためのα-CD3（1μg/ ml）を、α-CD28（2μg/ mlの）Th17分化条件下での抗体と抗原提示細胞（IL-6（25 ng / ml）を、TGF-βを用いて偏光（2 ng / ml）を、α-IFN-γ（2μg/ ml）を、α-IL-4（2μg/ ml）を）三から四日間。 注：ナイーブ細胞とT REGSは、蛍光活性化細胞選別（FACS）ANを使用して分類したD磁気細胞単離手順および培養し、以前に19-22説明したように。 </li><li> 4日目に、ピペットを用いて、Th17細胞を再懸濁した後、培養物からそれらを収集し、滅菌条件下で、それらを遠心分離する。 <ol><li>それらの生存を調べるために、これらの細胞の小アリコートを取り、表現型のために。ヨウ化プロピジウム（200 ngの/ ml）を追加し、フローサイトメトリーにより直ちにそれらの生存率を評価し、RPMI培地500μlに再懸濁します。再刺激後にIL-17Aの生産性の評価フローサイトメトリーによる表現型解析を実行します（6.3節を参照）。 </li></ol></li><li>特に指定のない限り、すべての手順で、4℃で6分間480×gで滅菌PBS中の細胞の主要な大部分を遠心分離し、および洗浄。 </li><li> 6〜8週齢CD45.2 RAG1に養子移入のためにこれらの細胞を使用してください - / - 免疫不全マウス。 <ol><li>冷滅菌PBSを用いて1×10 7細胞/ mlの細胞密度で細胞を再懸濁する。 </li><li> intrapによって細胞100μlを注入eritoneal注射、1マウスは、1×10 6個の細胞を受けるように、1ミリリットルツベルクリン注射器に25 G針を使用して。いくつかのマウスは、PBSのみまたはのTh17細胞を受け取り、他のマウスは、Treg細胞と共培養したTh17細胞を受け取ります。 注：無菌的にすべての手順を実行します。 </li></ol></li></ol> 2.成長C.感染のアルビカンス （感染前に1日） <ol><li>接種の前に、CAF2-1 Cの 5個のコロニーを分散させる滅菌PBS懸濁液100μlでアルビカンス実験室株、および無菌培養液にサスペンションを追加します。 </li><li> Cの 5個のコロニーを接種するアルビカンス酵母窒素ベース（アミノ酸を含まないYNB）を50ml /ペプトン/デキストロースのブロス培地中で130 rpmで15-18時間、30℃で振とう培養器でインキュベートする。 </li><li>それが真菌の成長のための指標であるように、曇りのための培養液を監視します。 </li></ol> 3. カンジダ収穫と（感染の日に）カウント手順<ol><li> 15ミリリットルのチューブにカンジダブロスの10ミリリットルを収集します。大きなボリュームの場合、50ミリリットルのチューブにカンジダを集める。 </li><li>特に指定のない限り、すべての手順で、室温で5分間1900×gで芽胞子を遠心。上清を除去し、遠心分離によって出芽胞子をペレット。 </li><li>複数のチューブが存在する場合、ペレットを滅菌PBSを添加すること、複数のチューブからのカンジダ出芽をプールし、計数のために10mlのPBSで再懸濁します。 </li><li> 1.5 mlマイクロチューブに芽胞子20μlのを取る2Xパラホルムアルデヒドの20μlを添加し、15〜20分間、室温でインキュベートする。顕微鏡下で血球計数器を用いて固定芽胞子を数える。 注：パラホルムアルデヒドは発がん性がある。唯一のヒュームフードで原液を開きます。 </li><li>一方で、tは遠心分離することによって、少なくとも二回出芽胞子を洗浄することを繰り返すPBSで裾、および芽胞子をペレット。感染の準備ができて、ABSL1フード中で、室温で15 mlチューブ中のペレットにしてください。 </li><li>感染芽胞子を再懸濁するために、RTでいくつかの滅菌PBSのままにしておきます。 </li><li>カウントした後、酵母細胞/ mlの2×10 8、酵母blastospore細胞数を調整するblastosporeペレットを滅菌PBSを加える。これは、マウスを感染させるために使用されるblastosporeの懸濁液である。 注：無菌的にすべての手順を実行します。 </li></ol> 4.マウスの感染（セル転送後の3-5日） 注：以前に19,23-25 ​​説明したように、基本的な感染手順が実行される。 <ol><li> - / - 3日前にPBSまたは細胞を投与されたマウスRAG-1を計量。 </li><li>自分の体重を使用して麻酔薬の投与量を計算します。のintrにより1mlのツベルクリン注射器に25 G針を使用して、ケタミン/キシラジン混合物（16.1 mg / mlの1.6 mg / mlで）を投与することによってマウスを麻酔aperitoneal注入。 <ol><li>体重10グラムあたり50μlを管理します。 （ すなわち、ケタミン0.8mgの体重のキシラジン/ 10gを0.08 mgまたはケタミン80mgの体重kg当たりキシラジン8mgのそれぞれ）。 15分毎に麻酔後つま先のピンチの応答を観察します。 注：この投与量は、感染の手続きのために十分である麻酔の60〜90分を誘導します。 </li><li>乾燥から角膜を防ぐために、マウスの眼に眼科潤滑軟膏を適用します。目の潤滑剤が完全に乾くこととして、眼科潤滑ごとに45分を繰り返します。 </li></ol></li><li>麻酔中のマウスの水分補給を助けるために、前肢に隣接した背中に皮下に生理食塩水の1ミリリットル（0.9％のNaCl）を注入します。 </li><li>新しい、きれいなケージを取得します。一度感染した新しいケージに各マウスを置く、一度感染手順1マウスに従ってください。最初のPBS /偽感染を実行してから、 カンジダ感染GROに進むups。 </li><li>麻酔をかけたマウスをピックアップし、舌根を明らかにするために広い口を開きます。 <ol><li>舌下で90分間口腔内に、PBSまたはblastospore懸濁液50μlで飽和3ミリメートルの直径のコットンボールを置きます。コットンボールが移動しないようにすること、肺の混雑を防ぐために、マウスを15分毎にフロントとバックフリップ。 </li></ol></li><li>口腔内のシャムまたはカンジダ接種の90分を確保するために、すべてのマウスのためのタイマーを設定します。 </li><li>加熱ランプ（4フィート離れて）下のケージ、および熱ゲルパッド上各マウスに保管してください。 </li><li>舌が舌をlacerating歯を避けるために、歯から内側と離れて引き出されていることを確認してください。 </li><li> 90分の終わりに、マウスの口からコットンボールを削除します。 75分よりも早く麻酔から回復することができる任意のマウスを監視します。このような場合には、唯一のケタミン（40mg / kg）で再度麻酔。 </li></ol> 5.ポスト​​ProcedurE（90分麻酔中）の監視<ol><li> 90分麻酔時の熱ゲルパッドを使用してください。 <ol><li>体温を維持し、窒息を防ぐために、マウスは、通常のトウモロコシの穂軸、マウスの寝具に回復することはできません。 </li></ol></li><li>麻酔から回復した後、背面の2箇所に滅菌0.9％のNaCl皮下の追加の1ミリリットルを管理する。 </li><li> 5 PBS（偽）ケージ当たり接種したマウスに追いつく。ハウスケージあたりわずか1〜2感染したマウス。 </li><li>習慣と全体的な健康をグルーミング、体重の変化を下に注意することは手順の後に毎日のイニシャルと手順カードを記入します。 </li></ol> 6.炎症を評価 6.1）減量<ol><li>感染手順の前の日に開始し、感染時に毎日、マウスを計量。 注：一般的に、Th17細胞となしのT REGSを注射された免疫不全マウスを20に屈するによる-30％の重量損失は、真菌負荷19が増加し、炎症を悪化させた。 </li></ol>舌の6.2）組織学スコアリング<ol><li>頸椎脱臼に続いてCO 2窒息によりマウスを生け贄に捧げる。 </li><li>顎を開いて、ハサミやピンセットで舌を解剖する。舌を保持するために鈍い鉗子を使用し、ハサミを使用すると、舌のバックエンドを切開する口の奥に手を差し伸べる。 </li><li>免疫細胞化学的ヘマトキシリン​​と舌組織のエオシン（H＆E）染色のために、氷冷PBSで舌組織をすすぐ。 2-3舌のための10％ホルマリンの5ミリリットルを加え、O / N 15ミリリットルチューブ内でそれらを修正。 <ol><li>翌日、ホルマリンを除去し、超固着を防止するために、70％エタノール5mlの組織を浸す。パラフィン包埋、切片とパラフィン切片の染色を続行するには商用サービスにそれらを送信します。 注：商業組織学サービスは、これらのステップを実行するために使用される。 </LI&gt; </ol></li><li>スライドをバック商業組織学サービスからたら、グレード、光学顕微鏡下で組織切片を観察することにより炎症。 <ol><li> 0は炎症いるないと、0〜5のスコア、および5は最も重度の炎症である。表1を使用して炎症をスコア。 </li></ol></li></ol> 6.3）Th17細胞によるサイトカイン産生を注：過剰なTNF-α産生が過剰な免疫病理のための読み出しの一つです。マウスに養子Th17細胞で転写される場合にのみ、それは、Th17細胞の過剰なTNF-αの産生と関連している免疫病理を引き起こす。 <ol><li>以前に記載された方法19,26を用いて、脾臓からの単一細胞懸濁液を、頸部リンパ節、腋窩リンパ節、および舌を集める。 </li><li>ブレフェルジンA（10μg/ ml）で4時間、ホルボールミリステートアセテート（PMA）（50ng / ml）およびイオノマイシン（500 ng / ml）を有する細胞を再刺激がlで添加AST 2時間。 PBSで細胞を洗浄し、製造業者の説明書に従って商業固定/透過処理キットを使用してそれらを修正する。 </li><li>以前に19説明したように、蛍光色素結合抗TNF-α、抗IL-17AおよびROR-γtと抗体を用いて、イントラセルラーサイトカイン染色を行います。 </li><li> 3 / mlの最終濃度 - 簡単に言えば、2の抗IL-17AおよびROR-γT抗体、各抗体、抗TNF-αのカクテルで1Xの透過化バッファーで細胞を懸濁します。 </li><li>室温で1時間、細胞をインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、1Xの透過化緩衝液で細胞を洗浄。 </li><li>フローサイトメトリー分析のために0.5％ウシ血清アルブミンを含む500μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁する。 </li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

このモデルは、経口での誘導に基づいているアルビカンス感染依存性Th17炎症。なぜならT regsはが存在しない、のTh17細胞の誘導された炎症は無拘束であり、不十分な解決免疫病理をもたらす。Th17細胞として偏光のインビトロ由来のナイーブCD4細胞を養子移入のために使用した。 40 - 培養CD4 +細胞の50％が3日目の周りに検出可能なIL-17Aの発現（Th17細胞）を示し、したがって、マウスにおける注射のために使用した。モデルの主な利点は、Th17細胞を効率的にT regの注射で改善することができる感染症の特定の免疫病理を引き起こすことです。したがって、モデルは、陽性対照としての Treg注射で免疫調節戦略をテストするために使用することができる。炎症は、容易に感染したマウスのTh17細胞による体重減少、組織病理学的スコアおよび炎症誘発性サイトカイン産生に基づいて評価される。 Tの後彼は、それらが二次リンパ器官及び舌、感染の原発部位を含む様々な組織に移行し...

口腔感染症と炎症は、癌と心血管疾患に関連しており、全体的な人間の健康に劇的な影響を与えています2,3。C. albicansによって引き起こされる日和見感染と炎症は、原発性免疫不全症(PID)4,5、歯周炎6,7などの炎症性疾患、シェーグレン症候群、唾液腺疾患8,9、口腔扁平上皮がん10-12と関連しています。C. albicansは、健康なヒトの60%の口に無漸近的にコロニーを形成する二形性共生菌であるが、宿主の防御が弱まると感染を引き起こす最も一般的な真菌病原体である13-15。これは、エイズやPIDの患者、および他の免疫不全の個人に再発性および慢性の感染症と炎症を引き起こします。共通して、そのコロニー形成負荷は、全体的な口腔マイクロバイオームの多様性の変化と関連している16。病原体として、急性偽膜性、急性萎縮性、慢性萎縮性、慢性肥大性/過形成性、口角炎など、いくつかの形態の中咽頭カンジダ症を引き起こします。
 C. albicansに対する防御は、宿主の免疫抵抗性だけでなく、カンジダが誘発する免疫病理を適切に制御する能力によっても決定されます。C. albicansのような共生生物は、他の口腔炎症状態の調節と悪化に寄与しているが、日和見感染中に嚥下障害が起こるメカニズムは不明である。C. albicansに対する記憶応答における適応Th17細胞の役割が知られているほか、慢性感染時の炎症病理の開始と永続化におけるそれらの役割は不明のままである。さらに、シェーグレン症候群や歯周炎などの口腔炎症性疾患は、Th17を介した病状に関連しています。興味深いことに、これらの疾患は頻繁なOPCとも強く関連しています。しかし、Th17細胞間の相互作用、OPCの口腔免疫病理学、およびその他の口腔炎症性疾患は研究されていません。
口腔カンジダ症の一次感染および二次感染のマウスモデルは利用可能ですが、特に免疫不全の文脈で、Th17炎症に関連するカンジダ感染を研究するためのマウスモデルは利用できません。この研究は、マウスの経口カンジダ感染に関連する経口Th17炎症を確立する方法を提示します。マウスのカンジダ感染は、真菌性病変、舌の炎症、食物摂取量の減少、体重減少、そして最終的には瀕死の状態を特徴としています。口腔病理は、慢性カンジダ感染病変、およびマウス口腔癌モデル12,18の上皮異形成に似ています。

<table><tbody><tr><td>CAF-2</td>ピ<td>ッツバーグ大学(サラ・ガッフェン)</td><td>-</td><td>カンジダ培養</td></tr><tr><td>U底96ウェルプレート&nbsp;</td><td>フィッシャー</td><td>055588</td> a-CD3の<td>細胞培養に使用</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>細胞のTh17条件</td></tr><tr><td>a-CD28への分極&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>Th17条件への細胞の分極</td></tr><tr><td>m-IL-6</td><td>Bio Basic</td><td>RC232</td><td>Th17条件への細胞の分極</td></tr><tr><td>h-TGF-b&nbsp;</td><td>R&D</td><td>240-B</td><td>細胞のTh17条件への分極</td></tr><tr><td>a-IFN-g&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7311-85</td><td>Th17条件</td></tr><tr><td>a-IL-4への</td>細胞の分極 &nbsp;<td>eBiosciences</td><td>16-7041-85</td><td>Th17条件への細胞の分極</td></tr><tr><td>&α;-IL17A ef660</td><td>eBiosciences</td><td>50-7177-82</td><td>細胞培養に使用 - 1:50</td></tr><tr><td>&-TNFa-PE-Cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-7423-41</td><td>細胞培養に使用 - 1:100</td></tr><tr><td>&-RORgt PE&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>12-6981-82</td>細胞<td>培養に使用-1:50</td></tr><tr><td>YNB w /アミノ酸なし)/ペプトン/デキストロースブロス培地&nbsp;</td><td>バイオベーシック</td><td>S507。カン</td><td>ジダ成長のためのSIZE Mediium</td></tr><tr><td>シェーカーインキュベーター&nbsp;</td><td>ニューブランズウィックサイエンティフィック</td><td>イノーバ 4300</td><td>カンジダのインキュベーション成長</td></tr><tr><td>15 ml チューブ</td><td>バイオベーシック</td><td>BT888-SY</td><td>細胞培養とカンジダの成長に使用</td></tr><tr><td>50 ml チューブ</td><td>バイオベーシック</td><td>CT 788-YS</td><td>細胞培養とカンジダの成長に使用</td></tr><tr><td>テーブルトップ 遠心分離</td>機 <td>VWR インターナショナル</td><td>LLC 82017-654</td><td>ペレット化用カンジダ -900 g</td></tr><tr><td>アレグラ遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>392302</td><td>細胞培養 - 480 g</td></tr><tr><td>1.5 ml エッペンドルフチューブ</td><td>バイオベーシック</td><td>BT620-NS</td><td>カンジダの最終濃度の調製</td></tr><tr><td>2x パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>15710</td><td>カウント用カンジダの固定</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>VWR International LLC</td><td>15170-172</td><td>細胞数カウント</td></tr><tr><td>PBS - リン酸緩衝生理食塩水</td><td>バイオベーシック</td><td>PD8117</td><td>緩衝液の調製</td></tr><tr><td>ケタミン/キシラジン&nbsp;</td><td>ケースウェスタンリザーブ大学-動物リソースセンター</td><td>-</td>麻酔眼科用潤滑剤軟膏<td>のARC承認プロトコルから取得</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>乾燥を防ぐための動物のための</td><td>アラガン</td><td>眼</td>軟膏</tr>生理<tr><td>食塩水(0.9%NaCl)</td><td>G Biosciences</td><td>786-561</td>脱<td>水症を防ぐために動物に投与</td></tr>-<tr><td>直径3mmの脱脂綿ボール&nbsp;</td><td>VWRインターナショナルLLC</td><td>BP7603</td><td>カンジダ感染用3 mmボール</td></tr><tr><td>ヒートゲルパッドケース</td><td>ウエスタンリザーブ大学 - 動物資源センター</td><td>-</td><td>体温を維持し、迅速な回復</td></tr><tr><td>ヘマトキシリンとエオシン染色</td><td>Histoserv - MD</td><td>-</td><td>組織学</td></tr><tr><td>10% ホルマリン&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>JC1111/MC</td><td>組織組織学</td></tr><tr><td>70%エタノール&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>97064-490</td><td>滅菌目的</td></tr><tr><td>PMA - ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>細胞の再刺激</td></tr><tr><td>イオノマイシン</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>124222 1mg</td><td>細胞の再刺激</td></tr><tr><td>固定透過化キット</td><td>eBiosciences</td><td>E16913-106</td><td>フローサイトメトリー用細胞の固定</td></tr><tr><td>ツベルクリンシリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td>マウス注射</td></tr><tr><td>25 G x 3/8 針</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>マウス注射</td></tr><tr><td>Rag1 -/- マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>在庫番号: 002216</td><td>レシピエントマウス</td></tr><tr><td>CD45.1 コンジェニックマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>在庫番号: 002014&nbsp;</td><td>ドナーTh17細胞</td></tr><tr><td>CB17-SCIDマウス</td><td>Jackson laboratories</td><td>在庫番号:001303</td><td>レシピエントマウス</td></tr><tr><td>Balb/cマウス</td><td>Jackson laboratories</td><td>在庫番号:000651</td><td>ドナーTh17細胞</td></tr></tbody></table>

免疫不全マウスにおける口腔咽頭カンジダ症のth17細胞炎症モデル

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

中咽頭カンジダ症(OPC)疾患は、宿主の免疫抵抗性の欠如だけでなく、感染による免疫病理の適切な調節の欠如によっても引き起こされます。Th17細胞は抗真菌防御に関与していますが、免疫病理学におけるその役割は不明です。この研究は、免疫不全マウスの経口カンジダ感染に関連する経口Th17免疫病理を確立する方法を提示します。この方法は、リンパ球減少性マウスをin vitro培養Th17細胞で再構成し、続いてカンジダ・アルビカンス(C. albicans)を経口感染させることに基づいています。 結果は、拘束されていないTh17細胞が炎症と病理を引き起こし、体重減少、炎症誘発性サイトカイン産生、舌組織病理学、死亡率などのいくつかの測定可能な読み出しに関連していることを示しており、このモデルがOPC免疫病理学の研究に価値があることを示しています。Adoptive transfer of regulatory cells (Tregs) は炎症反応を制御および軽減し、このモデルを使用して口腔炎症を打ち消す新しい戦略を試験できることを示しています。このモデルは、他の口腔疾患の文脈で一般的に経口Th17免疫病理学を研究する際にも適用できる可能性があります。

このモデルでは、RAG-1におけるカンジダ感染したマウスと非感染マウスの両方- / -免疫不全背景が養子感染に3-5日前に、Th17細胞を移した。 10-12匹のマウスの合計は2それぞれ偽感染させた群のマウス、およびカンジダ感染群の各々 4-5で、実験に使用した。注入されたTh17細胞は、それぞれ、Thy1.1陽性またはCD45.1染色（ 図1A）を用いてインビボで追跡したように、ナイーブ細胞は、コンジェニックThy1.1陽性またはCD45.1マウスに由来した。共移入されたT regsは CD45.1 は Th17細胞と区別するCD45.2マウスに由来した。いくつかの実験のために、CB-17 Thy1.2 のscidレシピエントマウスに、Thy1.1陽性のBalb / Cマウスから得られたTh17ドナー細胞およびThy1.2コンジェニックマウスから得られたT regsは使用した。唯一のカンジダは、マウスを感染したが、非感染マウス...

カンジダ感染モデルは宿主の免疫抵抗性を研究するために利用可能ですが、カンジダ感染の文脈でT細胞媒介免疫病理を研究するモデルは存在しません。ここでは、免疫不全マウスにおける口腔カンジダ感染に関連するTh17免疫病理を確立する方法について述べる。

免疫不全マウスにおける口腔咽頭カンジダ症のTh17細胞炎症モデル

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

本手順の全体的な目的は、病理学的TH17細胞によって媒介される、感染依存性の口腔炎症モデルを構築することです。まず、免疫不全マウスにTH17細胞を注入します。次に、Candida albicans菌を培養して芽胞を回収し、PBSで調製します。最終ステップでは、注入した Th17 細胞の増殖を促進し、口腔内炎症を誘導するために、マウスにブラストスポアを経口投与します。フローサイトメトリーおよび舌の免疫組織化学分析の結果、Th17 細胞を注入したマウスでは体重減少と舌の炎症が認められました。したがって、本マウスモデルを用いたこの手法の意義は、口腔免疫療法への応用にまで及びます。TH17炎症モデルは、他の口腔疾患におけるTH17炎症の研究にも利用可能です。本手順のデモンストレーションは、私の研究室のメンバーであるnitrogen vascularおよびpost-structural fellowが行います。本手順では、TH17細胞培養を確立するために、ソート済みのナイーブT細胞、およびオプションでTreg細胞が必要です。CD4陽性、CD44低発現、CD62L高発現、CD25陰性のナイーブT細胞を、U底96ウェルプレートに1ウェルあたり30,000個の密度で播種し、TH17誘導条件下で3〜4日間培養します。対照として、同じ培養条件下で30,000個のCD4陽性、CD25陽性、FOXP3陽性のTreg細胞をナイーブT細胞と共に培養し、TH17細胞を生成させることができます。4日間の培養後、ピペットを用いてTH17細胞を回収します。生存率を確認するため、少量のアリコートを分けておきます。これらの細胞を0.5 mLのRPMIに懸濁し、100 ngのプロピジウムヨードを添加します。フローサイトメトリー解析の間、大部分の細胞を回収し、細胞注入の準備を行います。細胞の大部分をPBSで洗浄し、遠心分離した後、マウスへの注入の準備を行います。冷PBSを用いて細胞濃度を10 million cells/mLに調整し、25ゲージの針を用いて細胞懸濁液100 µLをマウスに腹腔内投与します。他のマウスには、PBSまたは対照群のTH17/treg共培養細胞を注入します。注入の3〜5日前の日に、マウスにC. albicansを感染させる計画を立ててください。マウスにC. albicansを感染させるため、CAF2-1研究株のコロニー5個を100 µLの滅菌PBSに分散させ、この懸濁液を20 mLの滅菌ブロスに加えます。接種した培地を30 °C、130 RPMの振盪条件下で一晩培養します。翌日、培養液10 mLを15 mLチューブに回収し、1900 ×gで5分間遠心分離します。室温にて、ペレットには分生子が含まれており、上清は廃棄してください。回収したすべての分生子を10 milliliter

th17-inflammation-model-oropharyngeal-candidiasis-immunodeficient

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

の実験的マウスモデルにおけるプッシー接種とサンプル採取のためのプロトコルカンジダ膣炎

他のT細胞サブセットとは異なるエフェクター機能を持つ、Th17細胞は、中央炎症性自己免疫に関与している。このインビトロのTh17分化プロトコルは、ナイーブCD4 + Tリンパ球は、Th17細胞に分化することができ、さらに自己免疫および宿主応答におけるそれらの役割を検討するかどうかを決定するための手段を提供する。...

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

病原体感染に対する宿主の免疫応答が厳密に調節されたプロセスである。マウスにおけるリポ多糖肺露光モデルを利用し、それは疾患の病因に関連付けられている複雑な機構の高解像度の評価を実施することができる。...

マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

ハチミツガは播種性カンジダ症の無脊椎動物モデルとして機能します。ここで、感染は詳細プロトコルし、モデルの有効性のサポート...

播種性カンジダ症のハチミツガWaxworm 感染症モデル

ここでは、独自に設計された加温/抑制装置を用いたげっ歯類の尾静脈注射に対する効果的かつ効率的な方法を提示します。血管拡張の開始を合理化し、プロセスを抑制することによって、このプロトコルは、最小限の苦痛を伴う動物の大規模なグループの正確かつタイムリーな静脈注射を可能にする。...

マウス真菌敗血症モデルにおける効率的な尾静脈注射のための現代的な温暖化/抑制装置

危険な病原体によって引き起こされる人工関節周囲感染症(PJI)は、臨床整形外科で一般的です。既存の動物モデルでは、PJIの実態を正確に再現することはできません。本研究では、 カンジダ・アルビカンス...

マウスにおける人工関節周囲カン ジダ・アルビカンス 感染モデル

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マウスにおけるカテーテル関連 カンジダ・アルビカンス 感染モデル

このプロトコルは口頭カンジダ症のマウスモデルに抗菌光線力学療法(aPDT)の適用を記述する。aPDTは、クルクミノイドと青色LED光の水溶性混合物を用いて実施した。...

口腔カンジダ症のマウスモデルに対するクルクミノイド媒介抗菌光線力学療法

このプロトコルは、ナイーブCD4+ T細胞の in vitroでの病原性Th17細胞への分化について説明しています。具体的には、マルチパラメータフローサイトメトリーベースのアプローチと組み合わせると、この分化法を用いてナイーブなCD4+...

マウスにおけるナイーブCD4+ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

In Vitroでの宿主-病原体相互作用の研究のための器官型組織モデルシステム

学ぶ免疫不全マウスにおけるTh17細胞による口腔咽頭カンジダ症炎症モデルの構築法。Candida albicans芽胞を用いた経口感染とフローサイトメトリー・免疫組織化学による解析手法を解説し、口腔免疫治療開発への応用可能性を示す。

免疫不全マウスにおける口腔咽頭カンジダ症のTh17細胞炎症モデル

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