造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

この手順の全体的な目的は、骨髄における特定の細胞サブセット間の関連性を定量化することです。まず、マウス大腿骨腫瘍から組織学的凍結切片を採取します。次に、これらの切片を免疫蛍光解析のために染色し、共焦点画像を撮影します。

次に、これらの画像をデジタル解析します。最終的に、異なる細胞種の配置をシミュレーションすることで、目的の特定の免疫細胞とその微小環境との間の接触率および頻度を算出できます。私たちがこの手法を考案したのは、骨髄における長寿命プラズマ細胞の微小環境ニッチを解析していた際で、骨髄組織内の細胞間関連性を曖昧さなく定量化する手法を必要としていたためでした。

RA Mayaが、成マウスから大腿骨をクライオサクション（凍結吸引）して採取する手順を実演します。まず、硬組織用ブレードを備えた標準的なミクロトームの試料およびブレードの温度を-24°Cに設定します。15分間の順応時間を置いた後に行います。

クライオ埋め込み剤を用いてサンプルブロックを金属製サンプルホルダーに固定し、必要に応じてブロックの向きを調整します。骨が完全に開き、髄が見えるまでサンプルをトリミングします。その後、切片の厚さを7 µmに調整します。

次に、カワモト粘着テープを、粘着面が上になるようにサンプルブロックの上に固定します。革張りの木製スパチュラを使用してサンプルを切り出し、ピンセットで取り出します。テープを反転させて、切片が上側に来るようにします。その後、テープをガラス製顕微鏡スライドに転写します。

最後の切片を回収後、スコッチテープを用いてテープをガラススライドに固定します。サンプルを30分以上乾燥させ、スライドを-80°Cで保存します。解凍した凍結切片を、一般的な免疫蛍光染色プロトコルに従って染色し、サンプルの画像を撮影します。

組織の完全性を視覚化するため、核染色を必ず含めてください。切片の染色後、各サンプルに封入剤を1滴滴下し、1号カバーガラスを被せてレーザー走査型共焦点顕微鏡に設置します。20xの対物レンズを選択し、視野を708.15 × 708.15 µmに設定します。

その後、結果を比較可能にするため、1枚あたり2048×2048ピクセルの解像度でサンプルを1つずつイメージングします。ストローマ構造を可視化するための1チャンネル、核のための1チャンネル、および必要に応じて目的の造血細胞のための追加チャンネルで画像を記録します。ライン平均化（line averaging）を用いて画像を記録してください。

理想的には、大腿骨切片全体をカバーするように単一の隣接画像をキャプチャします。その後、画像を顕微鏡画像ファイル形式で保存します。次に、撮影した各領域についてチャンネルごとに1つのJPEGファイルをエクスポートし、画像解析ツールを用いて、ランダムセルのシミュレーションを実行する前に、共局在の画像セグメンテーション定量化および近接解析を行います。

シミュレーションを行う各骨髄解析画像のポジショニングについて説明します。セルコンタクトツールによって提供された個別のCSVファイルを1つのフォルダーにまとめます。単一の大腿骨サンプルからの連続画像に対してバッチシミュレーションを実行するために、元のDPIチャンネルJPEGファイルと元のストローマチャンネルJPEGファイルを準備してください。あわせて、すべての元のJPEGファイルと、それに対応する個別のCSVファイルを別のフォルダーに転送しておいてください。

すべてのファイルが揃ったら、シミュレーションツールを起動します。次に、「auto load image data」のチェックボックスをオンにします。このオプションを有効にすると、解析画像に対応するCSVファイルが自動的に開かれます。

次に、CSVファイルの共通タグと、バッチモードシミュレーションに使用する画像セット数を入力します。続いて、DPIチャネルのマスクを作成するため、末尾が3のファイル名でSストロマチャネルから生成されたJPEGファイルを読み込みます。「apply mask」チェックボックスをオンにし、DPI画像をバイナリマスクに変換するためのしきい値を10に設定します。

「eight bit」および「dilate」のボックスにチェックを入れ、dilationのグレードを5ピクセルに設定します。次に、「width erosion」のボックスにチェックを入れます。続いて、シミュレーション画像の解析に使用する近傍半径（vicinity radius）の希望値を入力し、「use OSU」のボックスにチェックを入れて、造血細胞のストローマ構造を自動検出するためのOSUアルゴリズムを使用します。

円形としてシミュレートします。適切なオブジェクトセグメンテーション機能を備えた任意の画像解析ソフトウェアを用いて、解析対象の細胞種の細胞サイズ分布を測定し、これらの測定値からすべての造血系細胞種のシグマを決定します。画像解析ツールによって完全な細胞として認識される最小オブジェクトの直径（ピクセル単位）である、細胞サイズのカットオフ値を決定できます。

次に、赤、緑、および青の細胞の細胞サイズ分布シミュレーションのための、細胞サイズのカットオフ値とシグマ（ピクセル単位）を入力します。続いて、「cells and mask」タブで、「delete」ボックスにチェックを入れます。これにより、細胞がマスクの進入禁止領域内で少なくとも1ピクセルと重なった場合に、プログラムが細胞の新しい位置を選択できるようになります。「cell exclusion」タブでは、「avoid cell overlap」ボックスにもチェックを入れてください。

次に、2つの細胞の中心間における許容最小距離をピクセル単位で入力します。重なりが1つの細胞の中心から別の細胞の中心までの最小距離によって定義される場合は、最大重複面積を100%に設定してください。その後、シミュレーションツールの反復回数を1000回に設定します。次に、「auto save sales」ボックスにチェックを入れ、バッチ内の各画像のすべての反復におけるシミュレーションオブジェクトの座標を、テキスト形式のwreckedファイルとして保存します。

保存ファイルに使用する共通のタグも入力してください。最後に、「run simulation」をクリックし、記録された各画像に対応する1,000枚のシミュレーション画像セットにおける平均接触回数および近接回数を算出します。この際、平均接触数と近接数を1画像あたりの記録細胞数で除し、得られた頻度を記録画像の自動共局在解析の結果と比較します。

この図では、蛍光キメラ骨髄を用いた、好酸球、プラズマ細胞、およびB細胞とストローマ細胞微小環境の局在解析を示しています。細胞接触（cell contact）および近接（vicinity）ツールによって生成されたCSVファイルには、各細胞集団の細胞数とピクセル単位の総面積、ならびに接触または近接の回数が含まれています。細胞のランダム配置シミュレーションを行う前に、細胞サイズの分布をガウス分布として記述するパラメータをこのシミュレーションで決定する必要があり、3つの細胞集団で測定されたσの相対値が維持されました。

細胞が配置される領域を定義するため、記録された細胞の視覚的な外観に合わせてピクセル単位でSigma値を設定し、DAPIチャンネルからマスクを生成しました。次に、バイナリ画像を生成するための最適な密度しきい値として10という値が決定されました。その後、プラズマ細胞、好酸球、またはB細胞と間質細胞との接触の関連性を、期待通りに検証しました。

これらの解析により、記録された画像では、プラズマ細胞およびB細胞において、シミュレーションと比較して有意に高い接触率が示されました。対照的に、好酸球とストローマ細胞の接触については、明確な差は見られませんでした。この手法は、免疫学、血液学、病理学、幹細胞生物学など、骨髄の複雑な組織構造の解析を必要とするあらゆる分野において、重要な疑問を解決するのに役立ちます。