Name: 造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶ造血細胞の自動定量化法。マウス大腿骨の脱灰骨組織切片を免疫蛍光染色し、共焦点顕微鏡で撮影した画像をデジタル解析することで、骨髄微小環境における免疫細胞間の接触頻度を定量的に評価する技術です。

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私たちは貴重な議論アンドレアスRadbruchに感謝。私たちは、優れた技術支援のための動物のケアとロバート·ギュンターの支援のためのザビーネGruczek、パトリックThiemannとマヌエラOhdeに感謝しています。私たちは、原稿の校正のための組織学サンプルの評価とランディリンドクイストのために私たちの訓練を受けた評価者ローラ·Oehme、Jannikeバヤット-Sarmadi、Karolinポロック、カトリン·ロス、フィレンツェPacheとカタリーナ·ホーンに感謝。私たちは、MBP特異的抗体のためのJ.とN·リー、メイヨークリニック、スコッツデール、アリゾナ州、米国に感謝します。 この作品は、生体顕微鏡用JIMI-DFG中核施設ネットワークグラントによって及びTRR130 / TP17により、DFG HA5354 / 4-1によってサポートされていました、そしてAEHSZに2165 FOR DFG（HA5354 / 6-1）は、国際マックス·プランクによってサポートされていました感染症や免疫（IMPRS-IDI）、ベルリンのための学校。

<ol><li>Kunisaki, Y., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secrets+of+the+bone+marrow+niche%3A+Enigmatic+niche+brings+challenge+for+HSC+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion.</a> Nat Med. 18, 864-865 (2012).</li>
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<li>Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+niches+controlling+B+lymphocyte+behavior+within+bone+marrow+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development.</a> Immunity. 20, 707-718 (2004).</li>
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<li>Sapoznikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+clusters+of+dendritic+cells+provide+critical+survival+signals+to+B+cells+in+bone+marrow+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches.</a> Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).</li>
<li>Tokoyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Professional+memory+CD4%2B+T+lymphocytes+preferentially+reside+and+rest+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow.</a> Immunity. 30, 721-730 (2009).</li>
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<li>Lin, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+4-1BBL+on+radioresistant+cells+in+providing+survival+signals+through+4-1BB+expressed+on+CD8%28%2B%29+memory+T+cells+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow.</a> Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).</li>
<li>Zehentmeier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+and+dynamic+components+synergize+to+form+a+stable+survival+niche+for+bone+marrow+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells.</a> Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).</li>
<li>Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+niches+in+the+bone+marrow+required+for+B-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development.</a> Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).</li>
<li>Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faithful+activation+of+an+extra-bright+red+fluorescent+protein+in+%27knock-in%27+Cre-reporter+mice+ideally+suited+for+lineage+tracing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in 'knock-in' Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies.</a> Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).</li>
<li>Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cre-transgenic+mouse+strain+for+the+ubiquitous+deletion+of+loxP-flanked+gene+segments+including+deletion+in+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells.</a> Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).</li>
<li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot%27s+film+method%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).</li>
<li>Smith, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience+%2F+editorial+board%2C+Jacqueline+N.+Crawley+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Basic confocal microscopy.</a> Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).</li>
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<li>Kohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-CSF-mediated+thrombopoietin+release+triggers+neutrophil+motility+and+mobilization+from+bone+marrow+via+induction+of+Cxcr2+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands.</a> Blood. 117, 4349-4357 (2011).</li>
</ol>

Juan Escribano Navarroは、ドイツのミュンヘンにあるWimasis GmbHと提携しています。他の著者には、宣言すべき利益相反はありません。

現代の光学イメージング法の進歩にもかかわらず、組織学的データの分析は、依然として多くの場合、適切な定量化ツールおよび方法の欠如によって、または関心対象の小領域に集中偏った分析によって妨げられる。ここに提示相乗的なアプローチは、全体の骨髄領域を覆う画像解析を組み合わせた自動セグメンテーションおよび様々な造血細胞および間質細胞型、共局在化分析、新しいお客が提供する非ランダムに発生コンタクトの最後に検証ツールの物体認識設計されたシミュレーションソフトウェア。 骨髄を含む全体の骨の組織学に起因つのセクションに存在する様々な組織の密度に実行することが困難であった - 一方では非常に難しい、石灰化した骨、一方で簡単にカット中断されます非常に壊れやすい骨髄、一緒に骨と。代替的に、骨切片のプリアンプを切断するためのテープ法として取得済みのは、ここ14,15は 、それによって無傷（ 図1）内膜領域を残して、組織を安定化させるという利点を有する。骨芽細胞が豊富であることに加えて、これらの領域は、幹細胞の維持20において役割を...

、光学イメージングを含む顕微鏡における近年の急速な技術開発、に、全組織のコンテキスト内の細胞の解析は、免疫学者のためにますますアクセス可能となっています。懸濁液中の単一細胞の特徴は、細胞および分子の機能を理解するための貴重な不可欠な方法を表す。しかし、それらの（マイクロ）-anatomical環境内の細胞の解析は、免疫応答の発生のような複雑なプロセスに協力種々の細胞型の間の相互作用を理解するために不可欠である。 顕微鏡研究は、画像から定性的な情報を取得することが比較的容易であるが、それは部分的にはこの分野での分析方法は、画像取得が可能であるものと比較して遅れているという事実のために、これらのデータを定量化するための課題である。多くの研究者は、まだ、時間がかかり、その組織学的画像におけるマニュアル細胞計数を頼るしたがって、異なる評価者の間でバイアスを導入し、他のグループによって複製を妨げる。多くの場合、1代表画像は、それがハード読者はこのようなイベントの統計的関連性を判断できるようにすること、出版物における細胞の位置や共局在に関する声明を下線に選択される。 一緒にされた画像データの完全な情報内容はほとんど利用されないという事実と、この組織学的画像を分析するためのより公平な、迅速かつ包括的アプローチの必要性を強調している。 骨髄は、大人の脊椎動物の造血器官として重要な生体機能にかかる複雑な組織である。造血細胞1,2-ための出生地であるとBリンパ球の発達3に重要な役割を果たしている他に、免疫反応は4を開始し、成熟した、循環B細胞5をサポートしているサイトとして作用する。私の維持に加えて、その役割免疫記憶を構成する細胞のいくつかの種類が存在6-9存在することが判明しているようにmmunologicalメモリは、ますます10年間で明らかになり、理解されている。 骨髄およびその機能の複雑な組織構造との関係は依然としてとらえどころのないままである。そのようなTおよびB細胞のゾーンとしてマクロ区画に編成されて二次リンパ器官とは異なり、骨髄をクリアマクロ区画を欠いている。これまでのところ、骨髄中の個別のコンパートメントは、骨皮質に、または血管系への近接によって定義されています。そのような幹細胞を支持するようなプロセスの数の骨髄中の様々な常駐間質細胞集団の重要性は、そのような長命形質細胞（パソコン）などの免疫記憶細胞集団（CD4 +のB細胞またはメンテナンスの開発およびCD8 +メモリーT細胞）は、明らかに、骨髄中の微小区画のある程度があることを示している。 <pクラスは= &quot;jove_content&quot;&gt;これらの観​​察は、骨髄中の（様々な段階での細胞の維持、B細胞の発達の幹、および免疫記憶の維持）特定の機能に特化して別個の微細解剖ニッチの概念をもたらした。異なる機能を果たすニッチ間の異質性のある程度があるように思われるが、そのようなCXCケモカインリガンド12（CXCL12）またはインターロイキン7（IL-7）、などの間質細胞によって産生される因子のいくつかはのための決定的な要素であるこれらのニッチ10のいくつか。骨髄間質細胞の可視化および特徴付けにより、細長い樹状骨髄全体ネットワークを形成する拡張機能、および間質亜集団を区別するための適切なマーカーの欠如との形態学的特徴のために困難である。 これらのニッチは、それらの細胞および分子は複合に対する共通の特徴を共有してどの程度としてはまだ明らかではないn、および要素は、特定のニッチが一意レンダリング。間質細胞に加えて、造血細胞型は、ニッチのいくつかについて、少なくとも特定の信号を提供することによって、重要な役割を果たすことが示されている。明らかに、ニッチ組成の複雑さは、 その場でそれらの分析を必要とし、免疫学者や血液学者がその細胞成分間の空間的関係を分析することによって、例えば 、骨髄マイクロアーキテクチャにズームインすることがますます重要になってきた。 ここでは、自動化された公平な方法で、骨髄における細胞の共局在及び近隣関係を定量化するための戦略が提示されている。蛍光性の間質細胞及び非蛍光造血細胞を保有するキメラマウスの生成を含むワークフローの詳細、脱灰骨からの組織切片の調製、骨全体を覆って共焦点画像の取得、並びに携帯cは自動画像解析O-ローカライズおよびシミュレーションツールによってランダムポジショニングからの検証/差別が（ 図8）が設けられている。

<table><tbody><tr><td>ネオマイシン</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>N6386 SIGMA</td><td>ネオマイシン三硫酸塩水和物、EU危険物分類：GHS08</td></tr><tr><td>ウルソビットAD3EC</td><td>セラムヴェルケ・ベルンブルク</td><td></td><td>1 ml中に含まれるもの：50,000 I.E. レチニルパルミテート、5,000 I.E. コレカルシフェロール、30 mg トコフェリルアセテート、100 mg アスコルビン酸、1 mg ソルビン酸、200 mg ポリオキシル35カスチールオイル、0.5 mg プロピルガレート</td></tr><tr><td>トランスファーバッファー（100 ml PBS、1 ml 1 M HEPES、50 U/ml ペニシリン/ストレプトマイシン）</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>P4333, H3375</td><td></td></tr><tr><td>ニトロフェノールアセチルハプテン（4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニルアセチル）と結合したニワトリガンマグロブリン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニワトリガンマグロブリン（CGG）100 mg</td><td><a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Rockland</a></td><td>D602-0100</td><td></td></tr><tr><td>20% パラホルムアルデヒド溶液（EMグレード）</td><td>サイエンスサービス</td><td>15713</td><td>EU危険物分類：GHS02、GHS05、GHS07、GHS08</td></tr><tr><td>D(+)-スクロース</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>179124 SIGMA-ALDRICH</td><td>EU危険物分類：GHS02、GHS07</td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>208752 SIGMA-ALDRICH</td><td>EU危険物分類：GHS02、GHS07、GHS08、GHS09</td></tr><tr><td>ティッシュテック・クライオモールド（標準）</td><td><a href="http://www.sakuraus.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sakura</a></td><td>4557</td><td>25 x 20 x 5 mm</td></tr><tr><td>ティッシュテックO.C.T.</td><td><a href="http://www.sakuraus.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sakura</a></td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>川本式SCEM包埋剤</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Section-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>川本式クライオセクション調製キット&amp;nbsp;</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Section-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>川本式クライオフィルムtype 2C(9)</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Section-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロトームブレードMX35プレミアプラス、ロープロファイル</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>3052835</td><td>L × W：80 × 8 mm（31.5 × 3.13インチ）、厚さ：0.25 mm（0.01インチ）</td></tr><tr><td>ポリクローナルウサギ抗RFP抗体、ビオチン化</td><td><a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Rockland</a></td><td>600-406-379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 ストレプトアビジン</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>S-32355</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗MBP</td><td>J.およびN. Lee</td><td></td><td>入手可能先：J.およびN. Lee、メイヨー・クリニック、スコッツデール、アリゾナ州、米国、クローンMT-14.7</td></tr><tr><td>ヤギ抗ラット-Alexa Fluor 647</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗B220 - Alexa Fluor 594</td><td></td><td></td><td>自社内で作製および結合（DRFZ）、クローンRA3.6B2、Alexa Fluor 594はLife Technologies製</td></tr><tr><td>マウス抗l1軽鎖 - FITC</td><td></td><td></td><td>自社内で作製および結合（DRFZ）、クローンLS136</td></tr><tr><td>ラット抗k軽鎖 - FITC</td><td></td><td></td><td>自社内で作製および結合（DRFZ）、クローン187.1</td></tr><tr><td>DAPI（4&amp;prime;,6-ジアミジノ-2-フェニルインダール二塩酸塩）</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>D9542 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>蛍光封入剤</td><td><a href="http://www.dako.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> DAKO</a></td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ（24 × 24 × 0.13-0.16 mm）</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>H875.2</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロストスライドガラス（75 × 25 mm）</td><td><a href="http://www.vwr.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VWR</a></td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査共焦点顕微鏡</td><td></td><td></td><td>405、488、561、594、633 nmのレーザー線と20倍/0.8 NA空気対物レンズを装備。当研究ではZeiss LSM710およびZen 2010バージョン6.0ソフトウェアを使用。</td></tr><tr><td>骨髄用自動画像解析ツール</td><td><a href="http://www.wimasis.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Wimasis, ミュンヘン</a></td><td></td><td>セルコンタクトツールおよびセルビシニティツールは、要望に応じてWimasisより提供される。</td></tr><tr><td>VC2012ランタイム</td><td>Microsoft</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679" target="_blank"&gt;無料ダウンロード&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>細胞の無作為配置シミュレーションツール</td><td></td><td></td><td>要望に応じて当方より提供可能</td></tr><tr><td>画像セグメンテーション機能付き画像解析ソフトウェア</td><td></td><td></td><td>骨髄中の造血細胞タイプの細胞サイズ分布を測定するためにVolocity（Perkin Elmer）を使用した（&lt;strong&gt;図5&lt;/strong&gt;）。代替ソフトウェアとしてDefiniens Image Analysis（Definiens）またはCell Profiler（&lt;a href="http://www.cellprofiler.org" target="_blank"&gt;無料ダウンロード&lt;/a&gt;）がある。</td></tr><tr><td>Fiji画像解析ソフトウェア&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank"&gt;無料ダウンロード&lt;/a&gt;。Fijiは訓練を受けた評価者が手動細胞計数に使用した（&lt;strong&gt;図3&lt;/strong&gt;）。</td></tr></tbody></table>

造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

共焦点顕微鏡は、骨髄のような複雑な組織内の複数の細胞型の局在の分析のために選択される方法である。多くの場合、それは、このように評価者に依存するバイアスを導入し者間信頼性を低下させる危険性を有する、手動カウントに依存しているしかし、細胞局在の分析及び定量化は困難である。また、細胞型は、それらの出現頻度に強く異なる場合は特に、ランダムな位置からの二つのセルの結果の間の共局在するかどうかを判断することはしばしば困難である。ここでは、骨髄中の細胞の共局在の公平な定量化するための方法が導入される。プロトコルは、骨髄を​​含む全マウスの長骨の組織学的切片を得るために使用される試料調製、ならびに染色プロトコルと高解像度画像の取得を記載している。造血細胞および非ヘマトの認識及ぶ分析のワークフローこれらの細胞間の直接的なコンタクトの定量に2次元（2D）骨髄画像におけるopoietic細胞型が提示される。これはまた、特定の細胞型を、周囲の細胞微小環境に関する情報を取得するために、近傍分析を含む。 2つの細胞型の共局在は、ランダムセル測位の単なる結果であるか、または細胞間の優先的な関連性を反映しているかどうかを評価するために、造血ならびに間質細胞の場合には、この仮説をテストするのに適したシミュレーションツールは、ある使用。このアプローチは、骨髄に限定されず、組織学的データの再現性のある、定量的な分析を可能にする他の組織にも拡張することができる。

カワモトテープ法で脱灰骨の凍結切片を切断し骨幹ならびにそれらと骨端領域の両方で、まだ石灰化した骨に取り付けられた内膜領域の骨髄を、骨全体が完全な部分として切断することができ骨梁の高密度（ 図1）。切片の核染色は、調製物中の小さな亀裂を完全に回避することはできないが、正弦波と動脈の構造ならびに実質の網状ネットワークがそのままとどまることがわかる。 赤色蛍光キメラ骨髄およびその後の分析の免疫蛍光染色の例としては、好酸球（主要塩基性タンパク質、MBP）、パソコン（κおよびλ軽鎖）およびB細胞（B220）の染色が示されている。マウスは、ミョウバンIPでチキンγグロブリン（NP-CGG）に結合された100μgの4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニルハプテン、4週間後で免疫化した再構成は、21日後に、PBS IVにNP-CGG50μgのでブーストとブーストの後30日目に分析した。自動画像解析には、網状のプロセスの非常に小さな断片を含む、間質構造の非常に正確な認識をもたらした。間質細胞の細胞数は、ここで提示システムを用いて決定することができないので、画像中のすべての...

骨髄の組織学的データを定量的に分析する戦略が提示されます。組織切片中の蛍光標識細胞の共焦点顕微鏡検査により、2次元画像が得られ、自動的に解析されます。異なる細胞タイプの共局在解析をシミュレーション画像からのデータと比較し、細胞相互作用に関する定量的な情報を提供します。

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

この手順の全体的な目的は、骨髄における特定の細胞サブセット間の関連性を定量化することです。まず、マウス大腿骨腫瘍から組織学的凍結切片を採取します。次に、これらの切片を免疫蛍光解析のために染色し、共焦点画像を撮影します。次に、これらの画像をデジタル解析します。最終的に、異なる細胞種の配置をシミュレーションすることで、目的の特定の免疫細胞とその微小環境との間の接触率および頻度を算出できます。私たちがこの手法を考案したのは、骨髄における長寿命プラズマ細胞の微小環境ニッチを解析していた際で、骨髄組織内の細胞間関連性を曖昧さなく定量化する手法を必要としていたためでした。RA Mayaが、成マウスから大腿骨をクライオサクション（凍結吸引）して採取する手順を実演します。まず、硬組織用ブレードを備えた標準的なミクロトームの試料およびブレードの温度を-24°Cに設定します。15分間の順応時間を置いた後に行います。クライオ埋め込み剤を用いてサンプルブロックを金属製サンプルホルダーに固定し、必要に応じてブロックの向きを調整します。骨が完全に開き、髄が見えるまでサンプルをトリミングします。その後、切片の厚さを7 µmに調整します。次に、カワモト粘着テープを、粘着面が上になるようにサンプルブロックの上に固定します。革張りの木製スパチュラを使用してサンプルを切り出し、ピンセットで取り出します。テープを反転させて、切片が上側に来るようにします。その後、テープをガラス製顕微鏡スライドに転写します。最後の切片を回収後、スコッチテープを用いてテープをガラススライドに固定します。サンプルを30分以上乾燥させ、スライドを-80°Cで保存します。解凍した凍結切片を、一般的な免疫蛍光染色プロトコルに従って染色し、サンプルの画像を撮影します。組織の完全性を視覚化するため、核染色を必ず含めてください。切片の染色後、各サンプルに封入剤を1滴滴下し、1号カバーガラスを被せてレーザー走査型共焦点顕微鏡に設置します。20xの対物レンズを選択し、視野を708.15 × 708.15 µmに設定します。その後、結果を比較可能にするため、1枚あたり2048×2048ピクセルの解像度でサンプルを1つずつイメージングします。ストローマ構造を可視化するための1チャンネル、核のための1チャンネル、および必要に応じて目的の造血細胞のための追加チャンネルで画像を記録します。ライン平均化（line averaging）を用いて画像を記録してください。理想的には、大腿骨切片全体をカバーするように単一の隣接画像をキャプチャします。その後、画像を顕微鏡画像ファイル形式で保存します。次に、撮影した各領域についてチャンネルごとに1つのJPEGファイルをエクスポートし、画像解析ツールを用いて、ランダムセルのシミュレーションを実行する前に、共局在

automated-quantification-hematopoietic-cell-stromal-cell-interactions

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）および骨髄ニッチの間の相互作用の性質は、ほとんど理解されている。カスタムハードウェアの修正および多段階取得プロトコルは、ex vivo画像骨髄エリア内ホーミング標識HSPCs、追跡相互作用及び運動に二光子共焦点顕微鏡の使用を可能にする。...

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

セグメント化および定量化 ImageJ プラグインを使用して骨の外側の境界に基づく 2 D と 3 D...

外側境界セグメンテーションと Imagej のプラグインで海綿骨の定量化を支援

MDS の診断は非有益な細胞遺伝学または形態学的条件の不在で難しいです。MFC では、MDS の診断プロセスを改良を助けることができます。臨床練習のために便利になる、MFC...

データベース ガイド-フローサイトメトリー評価骨髄骨髄細胞の成熟のため

骨外植の元生体培養は、骨生理学の研究や骨のリモデリングや骨疾患における薬物の潜在的な評価のための貴重なツールとなり得る。提示されたプロトコルは、新生児マウスの頭蓋骨から分離されたカルヴァリアの調製および培養、ならびにその用途を記述する。...

カルバリア共培養と組織病量を用いた骨リモデリングと腫瘍-骨微小環境の再現

我々は、細胞数を識別するために一般化可能な領域ベースの画像解析アプローチを利用する方法を提示する。異なる細胞集団の分析は、適応アルゴリズム内の異なる細胞型間の有意な細胞高さおよび構造の違いを利用した。...

マクロファージ-線維芽細胞共培養の定量化のための領域ベースの画像解析アルゴリズム

ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。...

マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

ここでは、ヒト骨髄の in vivo...

生理学的または子宮頸部の文脈における常在細胞間のダイナミクスと相互作用を調査するためのヒト骨髄3Dモデル

このプロトコルはヘマトキシリンEosin (HE)の汚損およびマイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)の技術の結合によって骨粗しょう症のマウス...

骨粗鬆症マウスモデルにおける海綿骨マイクロアーキテクチャ評価

本研究では、骨形成タンパク質-2をロードしたゼラチン足場をトリガーとする in vivo...

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

ここでは、マウスの骨、骨髄、胸腺、およびヒト胸腺組織から間質細胞を単離することを可能にするプロトコルを紹介します。...

造血器官からの間質細胞の単離

このプロトコルは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)からのヒト破骨細胞の微分を示し、破骨細胞および破骨細胞の前駆細胞の性格描写のための方法を記述する。...

ヒト人工多能性幹細胞からの破骨細胞の分化と特性評価

学ぶ造血細胞の自動定量化法。マウス大腿骨の脱灰骨組織切片を免疫蛍光染色し、共焦点顕微鏡で撮影した画像をデジタル解析することで、骨髄微小環境における免疫細胞間の接触頻度を定量的に評価する技術です。

造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

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