比色金ナノ粒子アッセイに適用される構造スイッチングアプタマーを選択するための方法
2015年2月28日
Aプロトコルは、調整可能なストリンジェンシー磁気ビーズ選択法に基づいて、低分子ターゲットの構造スイッチングアプタマーを選択するために提供されています。構造スイッチング特性で選択されたアプタマーは、前述の金ナノ粒子アッセイなど、ターゲットの存在を知らせるためにコンフォメーションの変更が必要なアッセイに有益です。
次の実験の全体的な目標は、ターゲット結合時にアプタマー確認の変化をシグナルとして送ることによって機能する検出プラットフォーム上の認識要素として、統合のための構造スイッチングアプティを生成することです。これは、ビオチン化キャプチャプローブと相補型DNAライブラリーを連鎖球菌タビン被覆磁気ビーズに添加し、DNAライブラリーをビーズ表面に固定することで実現されます。次に、溶液に磁石を印加して、ビーズに残っている非結合配列から結合配列を分離します。
その後、保持された配列は精製され、次の選択ラウンドのために増幅されます。数回の選択ラウンドの後、否定的な選択ステップがプロセスに追加されます。数回の選択ラウンドの後、選択されたaprは、金ナノ粒子ターゲット検出アッセイに基づくターゲット結合時に構造変化を示します。
この技術が溶液ベースのセルXのような既存の技術よりも優れている点は、ターゲットを強固な支持体に固定する必要がないことです。つまり、この手法の意味するところは、個人の生理学的状態のリスク評価にあり、コルチゾールがストレスの指標であり、それが健康問題の評価につながる可能性があるという事実によるものです。このプロトコールでは、特にターゲットとコントロールに対して、常に調製したばかりのDNA溶液を使用してください。
DNAの調製には特別な注意が必要です。DNAライブラリーの100マイクロリットルアリコートをサーモサイクラーチューブに移し、サーモミキサーで摂氏95度で5分間加熱します。次に、このDNAを使用する前に、このDNAを使用する前に、チューブを氷に移し、分光光度計で正確な濃度を決定します。
次に、磁気ビーズ、ボルテックスストレプトエンコードされた磁気ビーズを準備し、そのうちの400マイクロリットルを新しいマイクロ遠心分離管に移します。このチューブを磁石に2分間置き、上清を取り除いてからビーズを洗います。400マイクロリットルの結合バッファーを追加し、それらをボルテックスして洗浄を完了します。
磁石を使用してビーズを分離し、上澄みを捨てます。この洗浄プロセスを3回繰り返します。次に、キャプチャプローブを磁気ビーズに固定します。
まず、Resusがビーズと400マイクロリットルの結合バッファーを50マイクロモルのキャプチャプローブで懸濁します。その後、ビーズを室温で穏やかに攪拌しながら10分間インキュベートします。遊離捕捉プローブを取り外すには、前回と同様に、1回の洗浄で400マイクロリットルの結合緩衝液を使用してビーズをさらに3回洗浄します。
3回の洗浄後、さらに400マイクロリットルの緩衝液を追加し、残りのステップで100マイクロリットルのビーズ溶液を回収し、残りを摂氏4度で保存します。残りは、最大3週間の後続の選考に使用できます。より多くのビーズが必要な場合は、この選択スキームで厳密性を高めるために、より長いプローブでビーズを調製できます。
例えば、ラウンド13の後にはより長いプローブが使用され、その時点で他のストリンジェンシーを使用して有意な濃縮が達成されました。保管庫から取り出したビーズを使用する場合は、まず作業用アリコートを2回洗浄し、1回の洗浄につき200マイクロリットルの結合緩衝液を使用します。そうでなければ、作りたてのビーズはすでにきれいです。
次に、100マイクロリットルのスナップクールDNAをビーズに加え、室温で30分間穏やかに攪拌しながらインキュベートします。インキュベーション後、上清を捨てる前にビーズを分離します。ビーズに結合したDNAの量を決定するために、含まれるDNAの濃度を計算します。
次に、ビーズを200マイクロリットルの結合緩衝液で3回洗浄します。結合緩衝液を毎回5分間、穏やかに攪拌しながらビーズを洗浄します。次いで、100マイクロモルの結合緩衝液中に標的分子を調製し、この調製物の200マイクロリットルにビーズを再懸濁し、標的分子とする。
この場合、コルチゾールは通常、最初の選択ラウンドで非常に濃縮されます。ビーズをターゲットと30分間インキュベートし、周囲条件で穏やかに攪拌します。インキュベーション後、ターゲットの言及された配列を含むスナットを保存します。
濃縮を隔てるごとに、最終上清からサンプルを採取し、モニタリングのためのプロセスをモニタリングします。透析により上清からコルチゾールを取り除きます。.これは、標的分子が各ラウンド後260ナノメートルでDNA吸光度の測定を妨げない場合はスキップでき、ポジティブセレクションステップから収集された上清をテンプレートとしてPCRによりターゲット結合DNAを増幅します。
事前に常に小さなテストPCRを実行して、最適な増幅数を決定します。各サイクルの後に10マイクロリットルのサンプルを採取し、サンプルを25ベースペアのラダーと比較します。ここでは、ライブラリは85塩基対で実行する必要があり、増幅された生成物は10サイクル目以降に見られるため、使用するサイクルの数を減らす必要があります。
この結果はラウンドごとに異なる可能性があるため、常にテスト実行が必要です。次に、8本のストリップチューブを使用して、選択したサイクル数で大規模なPCRを行います。反応混合物を6〜8ミリリットル増幅して、次の選択ラウンドに必要な量のアンプリコン(DNAの1〜2.5ナノモル)を取得します。
PCR産物のサンプルをゲルで再確認します。次に、非磁性ストレプトコーティングビーズを使用して、製品の大部分を一本鎖DNAに変換します。300マイクロリットルのビーズをフリッツでブロックされた小さなカラムにロードします。
次に、ルアーロックシリンジを使用して、ビーズを5ミリリットルの結合緩衝液で優しく洗浄します。カラムを洗浄するために溶液を変更する場合は、シリンジをカラムから取り外し、プランジャーをシリンジから取り外します。これにより、ビーズの不必要な乱れを防ぎます。
1カラムあたり1ミリリットルのPCR産物に十分なビーズカラムを作成し、洗浄します。穏やかな圧力でPCR産物をカラムに通します。DNA産物は、アンチセンス鎖によって結合されたビーズによって保持されます。
次に、DNA結合カラムを5ミリリットルの結合バッファーで洗浄してすべてのPCR成分を除去し、結合プールDNAのみを残してカラムからDNAを脱ハイブリダイズし、0.5ミリリットルの0.2モル水酸化ナトリウムを添加します。次に、ヌクレアーゼフリー水で調製した脱塩カラムを使用して、eit中の一本鎖DNAを脱塩します。最初の0.5ミリリットルのフロースルーを破棄します。
次に、1ミリリットルのヌクレアーゼフリー水をカラムに通して、脱塩したDNAを収集します。収集したDNAの吸光度を測定し、次の選択ラウンドに備えます。テキストプロトコールに記載されているように、収集された一本鎖DNAは、キャプチャプローブで調製した新たに調製されたビーズのアリコートに戻されます。
2回目の選択は、1回目の選択と似ていますが、コルチゾール濃度が低くなっています。ただし、3 ラウンド目から開始して、正の選択の前に否定的な選択ステップを組み込みます。ネガティブセレクションの最初のラウンドでは、ビーズに結合バッファーに200マイクロリットルの1マイクロモルプロゲステロンを追加します。
構造的には似ていますが、コルチゾールとは異なります。その後のラウンドでは、室温で30分間混合物を静かに振とうした後、プロゲステロンの濃度を上げます。仰臥臥位を廃棄し、200マイクロリットルの結合緩衝液を使用してビーズを2回洗浄します。
次に、ポジ選択に進みます。ラウンドが進行するにつれて前述したように、基質の濃度は、選択プロセスの厳密性に影響を与えるために変化しました。詳細については、テキストプロトコルで説明します。
次に、テキストプロトコルに従って、コルチゾール検出のための金ナノ粒子アッセイを実行します。この迅速でわかりやすいカラーメトリクスの読み出しは、ターゲット結合時のアプタマーの構造変化に依存しています。したがって、構造スイッチング特性を持つエーバーを選択する方法の能力を評価するための指標を提供します。
金ナノ粒子アッセイのもう一つの利点は、シグナルを増幅して、低分子に共通するマイクロモル親和性アプタマーを解離定数よりも桁違いに低いレベルで検出できることです。以下の選択プロトコルを使用して、コルチゾールに特異的なエイバーを分離しました。透析と濃縮モニタリングを使用して、後の選択ステップ後に標的分子の溶出が増加したことを示しました。
最終ステップで標的分子を少なくし、より長い捕捉プローブを使用した場合、溶出の減少が観察されました。次世代シーケンシングを使用して、数回の異なるラウンド後に逃れたDNAを分析しました。6回目の選択後、早い段階では、コピー数が増加した割合が低いため、13ラウンド後には20ビンにランク付けされました。
エイバーのはるかに大きな割合が高コピー数でした。次に、選択プロセスをより厳しくします。第14ラウンドと第15ラウンドでは、選ばれたエイバーのほぼ半数がコピー数頻度の1位にいました。
この時点で、30, 000の実行で約3000のユニークなシーケンスがありました。選択したAPを金ナノ粒子とインキュベートした後、ターゲットを添加するか、または比較制御基質のためにインキュベートしました。このアッセイは、APが疝痛酸またはこの手順を試みている間よりもコルチゾールに対してより特異性があることを示しました。
各ラウンドでの選択の厳しさを制御し、PCRサイクル数を最適化することが重要です。このビデオを見れば、構造スイッチングAPの選び方と金ナノ粒子検出アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。
概要
本記事では、磁気ビーズ選択法を用いた小分子標的向けの構造スイッチ型アプタマーの選別プロトコルを紹介します。選別されたアプタマーは、標的結合時に構造変化を示すため、検出アッセイにおいて有利に働きます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生物化学
- 分子生物学
- 分析化学
背景
- アプトマーとは、特定の標的に結合できる短鎖の一本鎖DNAまたはRNA分子のことである。
- ストラクチャー・スイッチング・アプトマーは、標的に結合すると構造が変化し、これにより検出能が向上する。
- 金ナノ粒子アッセイでは、これらの構造変化を利用してシグナルを発生させる。
- この手法により、標的を固定化することなく低分子化合物の検出が可能となる。
研究目的
- 構造変化アプタマーを選別するためのプロトコルを開発すること。
- コルチゾールなどの低分子化合物の検出方法を改善すること。
- ストレス指標に基づいた生理学的状態を評価すること。
使用した手法
- ビオチン化したキャプチャープローブと相補的DNAライブラリーを、磁性ビーズと共に使用します。
- 磁気分離を用いて、結合配列を非結合配列から分離します。
- 目的のアプタマーを濃縮するため、選抜と増幅を複数回繰り返します。
- 金ナノ粒子アッセイを利用して、アプタマーの機能性を実証します。
主な結果
- ターゲット結合時に構造変化を示すアプタマーの選択に成功したこと。
- ストレス指標としてコルチゾールを検出する有効性を実証したこと。
- 最適な結果を得るために、調製直後のDNA溶液を使用できるプロトコルであること。
- プローブを長くし、ストリンジェンシーを高めることで、アプタマーの濃縮効率が向上すること。
結論
- 本プロトコルは、構造転移型アプタマーを選別するための信頼性の高い手法を提供します。
- これらのアプタマーにより、低分子検出アッセイの感度を向上させることができます。
- 本アプローチは、ストレスに関連する健康評価への応用が期待されます。
よくある質問
業界における実用的意義
本手法により、ターゲットを固定化することなく、低分子ターゲットに対する構造変化型アプタマーの選別が可能となり、生理学的バイオマーカー用バイオセンサーの開発を支援します。このアプローチでは、結合に伴い構造変化を起こすアプタマーを濃縮することで、ターゲット検証における予測信頼性を向上させ、非特異的なビーズ相互作用による偽陽性を減少させます。また、本手法は初期段階の創薬におけるアッセイ開発のための再利用可能な探索ワークフローを提供し、特にコルチゾールのようないわゆる分散型検査において迅速な比色読み取りが有用なターゲットに有効です。本プロトコルでは、ネガティブセレクションとプローブ長の延長を重視することでストリンジェンシーを向上させており、バックグラウンド配列を最小限に抑え、高親和性結合体を濃縮することでリード化合物の同定を容易にします。
バイオファーマ研究開発における戦略的活用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：ターゲット誘導性の構造変化を起こすアプタマーを選別することで、治療仮説の検証を可能にし、結合特異性の機能的妥当性を的に提供する。
- 運用の価値：ターゲットの固定化が不要となるため、ワークフローが簡素化され、表面相互作用によるアーティファクトが低減される。
- 予測的価値：実証可能な構造スイッチングを有する配列を濃縮することで、メカニズム上のリスク低減をサポートし、ターゲットエンゲージメントへの信頼性を高める。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：金ナノ粒子アッセイに適合するアプタマーを生成し、ハイスループットスクリーニングのための定量的かつ比色的な読み取りを可能にします。
- 運用的価値：選択と増幅を繰り返すことで標準化された結合プールを生成し、ランをまたいだアッセイの再現性を向上させます。
- 拡張性：濃縮後のキャプチャプローブの長さを延長することでストリンジェンシーが高まり、複数のターゲットに対する選択プラットフォームの再利用をサポートします。
翻訳および前臨床研究
- 翻訳の連続性： 選択されたアプタマーは緩衝液中での検出能を示しており、唾液や汗などの生理学的液体への展開に向けた基礎となる。
- バイオマーカーとの整合性： コルチゾールの検出はストレス関連バイオマーカーのモニタリングと整合しており、前臨床安全性試験における生理的状態の評価に有用である。
- リスク調整後の進展： エルアーションおよびシーケンシングによる濃縮モニタリングにより、アプタマーの特異性とコピー数の頻度に基づいたGo/No-go判断が可能となる。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットのバリデーションからリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに適合しており、アプタマーの選別から低分子検出のための機能的アッセイの開発までを推進することを可能にします。
- 発見生物学：標的によって誘起される構造変化を反映するアプタマーを単離することで、結合メカニズムと特異性を明らかにし、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：比色形式で性能が実証された、アッセイにそのまま使用可能なアプタマーを提供し、化合物やリガンドの信頼性の高い評価を可能にします。
- 分析：金ナノ粒子のシグナルシフトを介して定量的な出力を提供し、結合条件や濃縮プロセスの比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：バッファーベースの原理証明データを介して前臨床ワークフローへと繋げ、将来的な複雑なマトリックスへの適応に情報を供します。
- 企業的な再利用：プローブ長を変更可能な磁性ビーズ選択により、複数の低分子標的に対して再利用可能なプラットフォームを構築し、再開発の手間を削減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 検証可能なコンフォメーション変化を示すアプタマーを選別することで、ターゲット検証における予測精度を高め、メカニズム上の曖昧さを低減します。
- 運用的価値： ネガティブセレクション工程と規定の洗浄プロトコルの導入により、再現性と標準化を向上させ、バッチ間のばらつきを最小限に抑えます。
- 戦略的価値： アプタマーの機能性を早期に評価することを可能にし、go/no-go判断の効率を高め、生存不能な候補への投資を削減します。
- ポートフォリオへの影響： 濃縮度の追跡およびシーケンシングデータを通じて、リスク調整後の優先順位付けをサポートし、コピー数の支配性と特異性に基づいた推進判断に寄与します。
実施上の留意点
- 増幅バイアスを回避するため、核酸の取り扱い、磁気ビーズ分離、およびPCRの最適化に関する専門知識が必要である。
- DNAの定量および品質管理のため、磁気分離装置、サーモサイクラー、および分光光度計に依存する。
- 再現性を確保するため、結合バッファーの条件およびネガティブ選択化合物（例：プロゲステロン）について、チーム間での標準化が必要である。
- 生理学的液体への適応には、アプタマーの安定性と標的結合を維持するために、塩濃度および温度の最適化が必要となる場合がある。
- 実用的制限：分画効率は融解温度を室温付近に維持することによって制約を受けるため、バックグラウンドを低減するために複数回の選択ラウンドが必要となる。
