比色金ナノ粒子アッセイに適用される構造スイッチングアプタマーを選択するための方法
February 28th, 2015
Aプロトコルは、調整可能なストリンジェンシー磁気ビーズ選択法に基づいて、低分子ターゲットの構造スイッチングアプタマーを選択するために提供されています。構造スイッチング特性で選択されたアプタマーは、前述の金ナノ粒子アッセイなど、ターゲットの存在を知らせるためにコンフォメーションの変更が必要なアッセイに有益です。
次の実験の全体的な目標は、ターゲット結合時にアプタマー確認の変化をシグナルとして送ることによって機能する検出プラットフォーム上の認識要素として、統合のための構造スイッチングアプティを生成することです。これは、ビオチン化キャプチャプローブと相補型DNAライブラリーを連鎖球菌タビン被覆磁気ビーズに添加し、DNAライブラリーをビーズ表面に固定することで実現されます。次に、溶液に磁石を印加して、ビーズに残っている非結合配列から結合配列を分離します。
その後、保持された配列は精製され、次の選択ラウンドのために増幅されます。数回の選択ラウンドの後、否定的な選択ステップがプロセスに追加されます。数回の選択ラウンドの後、選択されたaprは、金ナノ粒子ターゲット検出アッセイに基づくターゲット結合時に構造変化を示します。
この技術が溶液ベースのセルXのような既存の技術よりも優れている点は、ターゲットを強固な支持体に固定する必要がないことです。つまり、この手法の意味するところは、個人の生理学的状態のリスク評価にあり、コルチゾールがストレスの指標であり、それが健康問題の評価につながる可能性があるという事実によるものです。このプロトコールでは、特にターゲットとコントロールに対して、常に調製したばかりのDNA溶液を使用してください。
DNAの調製には特別な注意が必要です。DNAライブラリーの100マイクロリットルアリコートをサーモサイクラーチューブに移し、サーモミキサーで摂氏95度で5分間加熱します。次に、このDNAを使用する前に、このDNAを使用する前に、チューブを氷に移し、分光光度計で正確な濃度を決定します。
次に、磁気ビーズ、ボルテックスストレプトエンコードされた磁気ビーズを準備し、そのうちの400マイクロリットルを新しいマイクロ遠心分離管に移します。このチューブを磁石に2分間置き、上清を取り除いてからビーズを洗います。400マイクロリットルの結合バッファーを追加し、それらをボルテックスして洗浄を完了します。
磁石を使用してビーズを分離し、上澄みを捨てます。この洗浄プロセスを3回繰り返します。次に、キャプチャプローブを磁気ビーズに固定します。
まず、Resusがビーズと400マイクロリットルの結合バッファーを50マイクロモルのキャプチャプローブで懸濁します。その後、ビーズを室温で穏やかに攪拌しながら10分間インキュベートします。遊離捕捉プローブを取り外すには、前回と同様に、1回の洗浄で400マイクロリットルの結合緩衝液を使用してビーズをさらに3回洗浄します。
3回の洗浄後、さらに400マイクロリットルの緩衝液を追加し、残りのステップで100マイクロリットルのビーズ溶液を回収し、残りを摂氏4度で保存します。残りは、最大3週間の後続の選考に使用できます。より多くのビーズが必要な場合は、この選択スキームで厳密性を高めるために、より長いプローブでビーズを調製できます。
例えば、ラウンド13の後にはより長いプローブが使用され、その時点で他のストリンジェンシーを使用して有意な濃縮が達成されました。保管庫から取り出したビーズを使用する場合は、まず作業用アリコートを2回洗浄し、1回の洗浄につき200マイクロリットルの結合緩衝液を使用します。そうでなければ、作りたてのビーズはすでにきれいです。
次に、100マイクロリットルのスナップクールDNAをビーズに加え、室温で30分間穏やかに攪拌しながらインキュベートします。インキュベーション後、上清を捨てる前にビーズを分離します。ビーズに結合したDNAの量を決定するために、含まれるDNAの濃度を計算します。
次に、ビーズを200マイクロリットルの結合緩衝液で3回洗浄します。結合緩衝液を毎回5分間、穏やかに攪拌しながらビーズを洗浄します。次いで、100マイクロモルの結合緩衝液中に標的分子を調製し、この調製物の200マイクロリットルにビーズを再懸濁し、標的分子とする。
この場合、コルチゾールは通常、最初の選択ラウンドで非常に濃縮されます。ビーズをターゲットと30分間インキュベートし、周囲条件で穏やかに攪拌します。インキュベーション後、ターゲットの言及された配列を含むスナットを保存します。
濃縮を隔てるごとに、最終上清からサンプルを採取し、モニタリングのためのプロセスをモニタリングします。透析により上清からコルチゾールを取り除きます。.これは、標的分子が各ラウンド後260ナノメートルでDNA吸光度の測定を妨げない場合はスキップでき、ポジティブセレクションステップから収集された上清をテンプレートとしてPCRによりターゲット結合DNAを増幅します。
事前に常に小さなテストPCRを実行して、最適な増幅数を決定します。各サイクルの後に10マイクロリットルのサンプルを採取し、サンプルを25ベースペアのラダーと比較します。ここでは、ライブラリは85塩基対で実行する必要があり、増幅された生成物は10サイクル目以降に見られるため、使用するサイクルの数を減らす必要があります。
この結果はラウンドごとに異なる可能性があるため、常にテスト実行が必要です。次に、8本のストリップチューブを使用して、選択したサイクル数で大規模なPCRを行います。反応混合物を6〜8ミリリットル増幅して、次の選択ラウンドに必要な量のアンプリコン(DNAの1〜2.5ナノモル)を取得します。
PCR産物のサンプルをゲルで再確認します。次に、非磁性ストレプトコーティングビーズを使用して、製品の大部分を一本鎖DNAに変換します。300マイクロリットルのビーズをフリッツでブロックされた小さなカラムにロードします。
次に、ルアーロックシリンジを使用して、ビーズを5ミリリットルの結合緩衝液で優しく洗浄します。カラムを洗浄するために溶液を変更する場合は、シリンジをカラムから取り外し、プランジャーをシリンジから取り外します。これにより、ビーズの不必要な乱れを防ぎます。
1カラムあたり1ミリリットルのPCR産物に十分なビーズカラムを作成し、洗浄します。穏やかな圧力でPCR産物をカラムに通します。DNA産物は、アンチセンス鎖によって結合されたビーズによって保持されます。
次に、DNA結合カラムを5ミリリットルの結合バッファーで洗浄してすべてのPCR成分を除去し、結合プールDNAのみを残してカラムからDNAを脱ハイブリダイズし、0.5ミリリットルの0.2モル水酸化ナトリウムを添加します。次に、ヌクレアーゼフリー水で調製した脱塩カラムを使用して、eit中の一本鎖DNAを脱塩します。最初の0.5ミリリットルのフロースルーを破棄します。
次に、1ミリリットルのヌクレアーゼフリー水をカラムに通して、脱塩したDNAを収集します。収集したDNAの吸光度を測定し、次の選択ラウンドに備えます。テキストプロトコールに記載されているように、収集された一本鎖DNAは、キャプチャプローブで調製した新たに調製されたビーズのアリコートに戻されます。
2回目の選択は、1回目の選択と似ていますが、コルチゾール濃度が低くなっています。ただし、3 ラウンド目から開始して、正の選択の前に否定的な選択ステップを組み込みます。ネガティブセレクションの最初のラウンドでは、ビーズに結合バッファーに200マイクロリットルの1マイクロモルプロゲステロンを追加します。
構造的には似ていますが、コルチゾールとは異なります。その後のラウンドでは、室温で30分間混合物を静かに振とうした後、プロゲステロンの濃度を上げます。仰臥臥位を廃棄し、200マイクロリットルの結合緩衝液を使用してビーズを2回洗浄します。
次に、ポジ選択に進みます。ラウンドが進行するにつれて前述したように、基質の濃度は、選択プロセスの厳密性に影響を与えるために変化しました。詳細については、テキストプロトコルで説明します。
次に、テキストプロトコルに従って、コルチゾール検出のための金ナノ粒子アッセイを実行します。この迅速でわかりやすいカラーメトリクスの読み出しは、ターゲット結合時のアプタマーの構造変化に依存しています。したがって、構造スイッチング特性を持つエーバーを選択する方法の能力を評価するための指標を提供します。
金ナノ粒子アッセイのもう一つの利点は、シグナルを増幅して、低分子に共通するマイクロモル親和性アプタマーを解離定数よりも桁違いに低いレベルで検出できることです。以下の選択プロトコルを使用して、コルチゾールに特異的なエイバーを分離しました。透析と濃縮モニタリングを使用して、後の選択ステップ後に標的分子の溶出が増加したことを示しました。
最終ステップで標的分子を少なくし、より長い捕捉プローブを使用した場合、溶出の減少が観察されました。次世代シーケンシングを使用して、数回の異なるラウンド後に逃れたDNAを分析しました。6回目の選択後、早い段階では、コピー数が増加した割合が低いため、13ラウンド後には20ビンにランク付けされました。
エイバーのはるかに大きな割合が高コピー数でした。次に、選択プロセスをより厳しくします。第14ラウンドと第15ラウンドでは、選ばれたエイバーのほぼ半数がコピー数頻度の1位にいました。
この時点で、30, 000の実行で約3000のユニークなシーケンスがありました。選択したAPを金ナノ粒子とインキュベートした後、ターゲットを添加するか、または比較制御基質のためにインキュベートしました。このアッセイは、APが疝痛酸またはこの手順を試みている間よりもコルチゾールに対してより特異性があることを示しました。
各ラウンドでの選択の厳しさを制御し、PCRサイクル数を最適化することが重要です。このビデオを見れば、構造スイッチングAPの選び方と金ナノ粒子検出アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。
概要
この記事では、磁気ビーズ選択法を用いて小分子標的に対する構造転換アプタマーを選択するプロトコルを提示します。選択されたアプタマーは、標的結合時に構造変化を示し、検出アッセイに有利です。
主要な研究構成要素
科学分野
- 生化学
- 分子生物学
- 分析化学
背景
- アプタマーは特定の標的と結合できる短い単鎖DNAまたはRNA分子です。
- 構造転換アプタマーは、標的結合時に構造を変化させ、検出能力を高めます。
- 金ナノ粒子アッセイは、これらの構造変化をシグナリングに利用します。
- この方法により、標的を不活性化することなく小分子の検出が可能です。
研究目的
- 構造転換アプタマーを選択するプロトコルを開発すること。
- コルチゾールのような小分子の検出方法を改善すること。
- ストレス指標に基づいて生理状態を評価すること。
使用した方法
- ビオチン化された捕捉プローブと補完的なDNAライブラリーを磁気ビーズと併用します。
- 磁気分離を用いて、結合配列と非結合配列を分離します。
- 望ましいアプタマーを濃縮するために、複数回の選択と増幅を行います。
- 金ナノ粒子アッセイを用いて、アプタマーの機能を実証します。
主要な結果
- 標的結合時に構造変化を示すアプタマーの選択に成功しました。
- ストレス指標としてのコルチゾールの検出に有効性を実証しました。
- プロトコルは、最適な結果を得るために新たに調製したDNA溶液の使用を可能にします。
- プローブを長くし、厳密さを高めることで、アプタマーの濃縮が改善します。
結論
- このプロトコルは、構造転換アプタマーを選択するための信頼できる方法を提供します。
- これらのアプタマーは、小分子検出アッセイの感度を向上させることができます。
- このアプローチは、ストレスに関連する健康評価に潜在的な応用があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables the selection of structure-switching aptamers for small molecule targets without target immobilization, supporting biosensor development for physiological biomarkers. The approach enhances predictive confidence in target validation by enriching aptamers that undergo conformational change upon binding, reducing false positives from non-specific bead interactions. It provides a reusable discovery workflow for assay development in early-stage drug discovery, particularly for targets like cortisol where rapid, colorimetric readout is valuable for decentralized testing. The protocol’s emphasis on negative selection and probe length extension improves stringency, aiding in lead identification by minimizing background sequences and enriching high-affinity binders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selecting aptamers that undergo target-induced conformational change, providing functional validation of binding specificity.
- Operational Value: Eliminates need for target immobilization, simplifying workflow and reducing artifacts from surface-based interactions.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by enriching sequences with demonstrable structural switching, increasing confidence in target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates aptamers compatible with gold nanoparticle assays, enabling quantitative, colorimetric readout for high-throughput screening.
- Operational Value: Produces standardized binding pools through repeated selection and amplification, improving assay reproducibility across runs.
- Scalability: Extended capture probe length after enrichment increases stringency, supporting reuse of the selection platform for multiple targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Selected aptamers demonstrate detection capability in buffer, providing a foundation for extension to physiological fluids like saliva or sweat.
- Biomarker Alignment: Cortisol detection aligns with stress-related biomarker monitoring, relevant for assessing physiological state in preclinical safety studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Enrichment monitoring via elution and sequencing allows go/no-go decisions based on aptamer specificity and copy number frequency.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling progression from aptamer selection to functional assay development for small molecule detection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating aptamers that reflect target-induced structural changes, clarifying binding mechanism and specificity.
- Screening: Delivers assay-ready aptamers with demonstrated performance in colorimetric formats, enabling reliable compound or ligand evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs via gold nanoparticle signal shift, allowing comparison of binding conditions and enrichment progress.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows through buffer-based proof-of-principle data, informing future adaptation to complex matrices.
- Enterprise Reuse: Magnetic bead selection with modifiable probe length creates a reusable platform for multiple small molecule targets, reducing redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by selecting aptamers with verifiable conformational switching, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through negative selection steps and defined washing protocols, minimizing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by enabling early assessment of aptamer functionality, reducing investment in non-viable candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through enrichment tracking and sequencing data, informing advancement based on copy number dominance and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling, magnetic bead separation, and PCR optimization to avoid amplification bias.
- Dependent on magnetic separation equipment, thermocyclers, and spectrophotometry for DNA quantification and quality control.
- Necessitates cross-team standardization of binding buffer conditions and negative selection compounds (e.g., progesterone) to ensure reproducibility.
- Adaptation to physiological fluids may require optimization of salt concentration and temperature to maintain aptamer stability and target binding.
- Practical limitation: Partitioning efficiency is constrained by keeping melting temperature near room temperature, necessitating multiple selection rounds to reduce background.
