魚にIonocytesを研究するために完全な二国間ギル脱神経と相まって時差染色技術

この手順の全体的な目標は、外因性神経支配を欠いている金魚の鰓における上腕球の増殖を調査することです。これは、最初に魚をミトコンドリア特異的色素浴に入れて、既存のミトコンドリア、豊富な上腕球を染色することによって達成されます。2番目のステップは、鰓の完全な両側除神経を行うことです。

次に、魚は安楽死させます。えらは収穫されます。細胞は、TPAでカリウムナトリウムに対する抗体を使用して標識されます。

次に、最後のステップは、既存の細胞と新たに分化した細胞を画像化してカウントすることです。最終的に、今回は両側ギルド除神経法による鑑別染色技術を使用して、中枢神経系からの神経入力なしに金魚のギルサイトの増殖と分布を示します。したがって、この手法の主な利点は、イオンの動的な取り込みを理解し、魚のGI上皮における細胞の再分布を調べるために使用できることです。

まず、50マイクログラムを94マイクロリットルのジメチルスルホキシドに溶解して、1ミリモル僧帽弁トラッカーレッドストック溶液を調製し、光から保護します。次に、最大容量600ミリリットルのダークボックスを3〜6個準備します。各ボックスに400ミリリットルのシステム水を入れ、それぞれにエアストーンを置いて酸素源を提供します。

30〜40グラムの金魚を箱に入れます。30分後、Mitre トラッカー溶液を添加して、0.1 マイクロモル色素と 0.01%DMSO の全濃度を得ます。魚を4時間浸します。

4時間後、ボックスへの水の流れをオンにし、染料が洗い流されるのを待ちます。これらが対照動物である場合は、魚を3〜5日間回収してから免疫組織化学に進み、そうでない場合は完全な両側除神経手順に進みます。まず、魚を曝気されたベンゾカイン水浴に入れて魚に麻酔をかけます。

呼吸が止まったら、魚を手術台に置き、頬腔にチューブを挿入します 曝気された麻酔薬で鰓を洗浄するには、頭がわずかに下に傾くように魚を配置して、4番目の鰓弓の後ろの領域へのアクセスを容易にします。まっすぐな標準パターンの鉗子で蓋をそっと持ち上げます。 次に、組織開創器を眼蓋と頭の内側の間に配置します。組織開創器を慎重に開いて、蓋を頭から遠ざけ、えらを露出させます。

リトラクターのハンドルをヘッドの横に置き、4つのギルアーチすべてにアクセスできるようにします。麻酔液が鰓を洗浄していることを確認し、第4鰓弓と後頭部の間に湾曲したまたはまっすぐな標準パターンの鉗子を配置します。鉗子をそっと開いて、靭帯に張力をかけます。

4番目の鰓弓を5番の鉗子のペアで頭に取り付けます。上皮を穿孔し、鰓弓の背側端を耳介腔に接続して、2〜3ミリメートルの開口部を作ります。深入りしすぎると、主要な血管を損傷するリスクがあるため、注意が必要です。

次に、5番の鉗子が入った小さな綿棒を持ち、それを使用して切開部を慎重に拡大し、9番目と10番目の神経を露出させます。5番の鉗子を使用して、結合組織から神経を解放します。繰り返しになりますが、血管を傷つけないように注意してください。

神経が露出して特定されたら、湾曲したスプリングハサミを使用して、切開部を保持しながら神経を慎重に切断します。ストレートの標準形状の鉗子で開きます。神経を切断した後、湾曲した鉗子をそっと引っ込めて組織を切除します。

リトラクター縫合糸は、切開部が24〜48時間以内に自然に閉じる必要があるため、必要ありません。頭の反対側で手順を繰り返した後、えらの灌漑を麻酔薬から新鮮な曝気水に切り替え、魚が麻酔から回復するのを待ちます。耳介の動きが再開したら、魚を実験水槽に移して、少なくとも24時間回復します。

最後に、魚を安楽死させる前に神経を切断せずに、4番目の鰓弓の後ろの上皮を突き刺すことにより、別の魚のセットで偽の手順を実行します。3〜4ミリリットルの4%PFAをシンチレーションバイアルに入れます。鰓弓ごとに1つのバイアルを使用してください。

さらに、小さなホエイボートに乗って、XPBSを1つ詰めます。これは、ティッシュを切除した後に洗浄するために使用されます。すべての溶液を氷の上に保ちます。

ベンゾカインの過剰摂取で魚を安楽死させた後、鈍い鉗子を使用して頭の片側のパーマを持ち上げ、湾曲したハサミを使用して上腕鰓バスケットの両端を切断します。次に、鈍い鉗子を使用して、ラッカーズで鰓を慎重に持ち上げ、耳介腔から持ち上げます。すぐに氷冷した1つのXPBSで鰓を洗い、余分なベンゼンと血液を取り除き、切除した鰓を4%PFAで満たされたバイアルに入れ、固定後、すべての切除された鰓を摂氏4度で一晩固定します。

1つのXPBSでX-S-P-F-Aを洗い流し、1.5ミリリットルの1%Tritton x.で満たされた2ミリリットルの弾丸チューブに組織を置きます。組織を透過するために、NKAおよびZN 12一次抗体の4マイクロリットルを1つのXPBSの992マイクロリットルに添加することにより、各一次抗体の1〜250希釈液を調製します。

両方の一次抗体が同じ宿主で産生されていることを確認してください。Triton X溶液を吸引し、最初に組織と一次抗体溶液を洗浄せずに、シェーカーで室温で6時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、一次抗体溶液を吸引し、一次抗体を3回ずつ3分間洗浄します。

1つのXPBSを使用します。5マイクロリットルのストック二次抗体を995マイクロリットルのXPBS1個に混合することにより、二次抗体を1〜200希釈で調製します。前回の洗浄でPBSを吸引した後、二次抗体を塗布し、室温で6時間、またはシェーカーで摂氏4度で一晩インキュベー

最後に、前回と同様に組織を5分間ずつ3回洗浄し、洗浄後、まず平らな顕微鏡スライド上に1つのXPBSの200マイクロリットル滴にギルを配置して、余分な二次抗体を除去します。組織が乾燥しないようにするため。ギルヘミブリンクスを湾曲したマイクロハサミで分離します。

次に、XPBSを1滴と封入剤を1滴、凹型スライドのくぼみに置きます。分離したヘミブランクをフィラメントの前端を上に向けて凹型スライドに置き、カバースリップで覆い、カバースリップの端をマニキュアで軽くたたきます。カバースリップが動き回って組織をずらすのを防ぐために、組織が凹スライドの底に10〜15分間沈殿してからイメージングします。

各鰓弓について、6つの鰓フィラメントをランダムに選択し、イメージングを行い、鰓弓ごとに6枚の画像を生成しました。従来の共焦点顕微鏡を使用して、1〜3マイクロメートルの光学スライスを撮影することにより、組織をイメージングします。次の画像では、矢印で示された細胞をα 5抗体で染色し、矢印で示された神経をZN 12抗体で染色しました。対照魚の鰓フィラメントのこの共焦点画像は、挿入画像に見られるように、おそらく第9および第10の神経に由来する、中枢神経束の広範なラメラ分岐を伴う外因性神経支配を示しています。

示されている細胞の一部も神経支配されています。この画像は、完全な両側除神経の2日後の鰓フィラメントを示しています。中枢神経束の縮小が見られましたが、層状神経支配はほぼ無傷で見えました。

ここでは、完全な両側除神経の5日後に示された鰓フィラメントは、外因性神経支配がほとんど存在しないことを示しています。定性的分析では、完全な両側除神経は、鰓フィラメント内の細胞体と神経を維持しながら外因性の鰓神経支配の劣化を引き起こし、フィラメントを介して跛行に神経のネットワークを作成することが示唆されています。この手順は、追加の研究課題に答えるために、ナトリウム22のような放射性イオンを使用してイオンフラックスを測定するなどの他の方法と組み合わせることができます。