の種特異的検出のためのLAMP法（LAMP）アッセイ

この手順の全体的な目標は、ニワトリまたはニワトリの群れにおけるI myea種の寄生虫の発生を診断することです。これは、まずループ媒介等温増幅またはランプ反応用の試薬を調製することによって達成されます。次に、死後に1つ以上の腸内部位から全ゲノムDNAを調製します。

次に、ゲノムDNAをランプマスターミックスに添加し、インキュベートします。最後に、ランプテストの結果が評価されます。最終的に、LAMPは、特定のIミリア種の発生を特定し、在庫管理を改善し、病気の診断のためのツールとして使用されます。

したがって、この手法は、形態顕微鏡やPCRなどの従来の方法よりも主観的ではなく、高価な実験施設を必要としないという主な利点があります。このアプローチを使用すると、アリウス菌感染症の診断を改善することにより、鶏の健康と福祉を改善できます。Erea lamp aseのテンプレートを準備するには、テストする腸のセクションを選択します。

この表は、サンプルサイトの選択と、存在する可能性が最も高いエリア種のガイドとして使用してください。ニワトリに感染する各種は、滅菌ハサミまたはメスを使用して標的とする腸領域によって定義されるため、これは非常に重要です。エリアをテストするために選択した腸切片の5センチメートル以上の長さを切除します。

サンプルを縦方向に切り開きます。ほとんどの腸内容物を取り除き、滅菌ガラス顕微鏡の端を使用します。はさみの刃をスライドまたは滅菌して、粘膜層から細胞をこすり落とします。

掻き集めた材料を、重量10%の滅菌TE100マイクロリットルが入った滅菌1.5ミリリットルのスクリュートップマイクロ遠心チューブに入れ、上部にしっかりとねじ込みます。サンプルを1分間激しく振とうした後、沸騰水浴中で10分間インキュベートします。沸騰後、各サンプルを周囲温度で1〜2分間冷却します。

100のassaysのための適当なI miriaランプのプライマーのストックを準備するための鋳型として使用するためにランプの試金ごとの上清の2マイクロリットルを集める前に1分間10、000倍Gでサンプルを遠心分離する。100マイクロモルピペットの濃度に分子グレードの水、分子グレードの水60マイクロリットルをアッセイする各iria種のための別々の0.5ミリリットルフリップトップマイクロ遠心チューブに分子グレードの水を追加することにより、各凍結乾燥Iミリランププライマーを再構成します。この表に示されているボリュームを使用します。

プライマー、F-I-P-B-I-P-F three B、three LF、LBを水に加えます。7種特異的なプライマーミックスのシリーズを作成します。プライマー溶液を短時間反転させて混合し、マイクロフュージをパルスし、必要になるまで凍結します。

この表に記載されているボリュームとテキストプロトコルのガイドラインを使用して、IEA種特異的B-S-G-D-N-Aポリメラーゼランプマスターミックスのランプアッセイピペット23マイクロリットルを0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに実施するためのアッセイとなる各iria種用のランプ反応マスターミックスを調製します。予め調製したDNAテンプレートを2マイクロリットル加え、ポジティブコントロールとして最終反応量を25マイクロリットルにします。1つの反応に2マイクロリットルのエリア種特異的ゲノムDNAを添加します。

ネガティブコントロールとして反応に2マイクロリットルの分子グレードの水を加え、摂氏62度のウォーターバスまたはヒートブロックを30分間インキュベートします。オプションで、B-S-T-D-N-Aポリメラーゼを80°Cに10分間加熱して不活性化します。室内光の下でのインキュベーションの終了時に反応がすぐに読み取られない場合は、各反応の色を目視で評価してください。

陰性の結果はピンクから紫の色で表示され、陽性の結果が表示されます。オプションでスカイブルー。ランプアッセイの結果を確認するために、5マイクロリットルのランプ反応生成物と1マイクロリットルのDNAゲルローディングバッファーを混合し、プレステン2%AROゲル上で動作します。

1キラーベースの分子サイズDNAラダーを使用して、3つのテストでフラグメントサイズを決定します。監視プログラムの一環として米国のブロイラー農場から収集された鳥は、ここに示すように3セットの腸サンプルをもたらしました。種特異的なランプアッセイの的を絞った適用と、各Iミリアムの好ましい腸部位の優先順位付け。

種により、ヒドロキシナタールブルーを指標として使用してテストされたすべての鳥で、線人感染を視覚的に識別することができました。ヒドロキシを使用した場合のランプの負の反応で得られる色は、紫色からピンク色までさまざまですが、常に正の結果によって得られる青とは異なります。aoseゲル電気泳動による確認では、ここに示すような同等の結果が得られました。

特定の腸部位のそれぞれから採取され、7つのランプアッセイ全てで試験された物質を表す1羽につき1つの採取サンプルからDNAを調製すると、各腸部位が別々に処理された場合と同じ結果が得られました。一度習得すると、この手順に従って適切に行われれば、この技術は45分で実行できます。病変スコアリングなどの他の手法も、腸全体の健康状態を評価するために実行できます。