神経細胞の金ナノロッド補助光刺激

このプロトコルは、金ナノロッドの光吸収に伴う一時的な加熱を使用して、ニューロン細胞の分化と細胞内カルシウム活性を刺激する方法を概説しています。これらの結果は、神経補綴物や神経科学の基礎研究における新たな応用の可能性を秘

この手順の全体的な目標は、近赤外レーザーダイオードを使用して金ナノロッドで培養したニューロン細胞を刺激することです。これは、最初に金ナノ粒子を適切な光学密度で調製することによって達成されます。2番目のステップは、ニューロン細胞を培養し、それらにナノ粒子を追加することです。

次のステップはレーザー照射です。最後のステップは、ベータ3からチューブリン発現への細胞分化を確認することです。最終的に、共焦点顕微鏡法を使用して細胞内カルシウムの過渡性を示します。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、細胞集団内の単一ニューロンの活動電位を刺激する方法を探していたときでした。手順を実演するのは、Jamie Mayと私たちの研究室の学部生です。この手順を開始するには、UV可視分光光度計に金ナノロッド溶液の獣医を置きます。

300ナノメートルから1000ナノメートルまでの吸収値を0.5〜2ナノメートルの分解能で記録することにより、初期光学密度を測定します。最初の金アノロサンプルを遠心分離機1台の光学密度に希釈することにより、1ミリリットルのストック溶液を調製します。金ナノロッド溶液1ミリリットルを2回使用して、余分な化学物質を取り除きます。

次に、上清を取り除き、金ナノロッドを脱イオン水に再懸濁します。細胞培養で使用するための準備として、金のアノロ溶液を5分間超音波処理し、次にUV光で30分間滅菌します。この手順では、細胞培養培地用に500ミリリットルの滅菌dmemを調製します。

次に、NG 1 0 8 15ニューロン細胞をT 75フラスコ内の10ミリリットルの細胞培養培地で増殖させ、続いて摂氏37度でインキュベートし、加湿雰囲気でインキュベートします。細胞が70〜80%コンフルエントになったら、培地を温かい新鮮な培地と交換します。その後、コンフルエントフラスコの底を軽くたたくことで細胞を機械的に剥離します。

細胞懸濁液を600Gで5分間遠心分離し、細胞パレットを2ミリリットルの温かい細胞分化培地に再懸濁します。次に、200マイクロリットルの細胞分化培地を入れた96ウェルプレートで細胞を観察します。サンプルを摂氏37度で1日間インキュベートします。

翌日、金ナノロッド溶液を加え、さらに24時間インキュベートします。この手順では、レーザーをシングルモード光ファイバーで結合し、FCコネクタで終端します。ナノロッドインキュベーションの3日目に、標準パワーメーターで出力レーザー出力を測定します。

FCコネクタをウェルに固定し、サンプルとコントロールに室温で1分間、異なるレーザー出力で連続波で5日目に照射し、サンプルから細胞分化培地を取り出し、1体積あたり3.7%のホルムアルデヒド溶液で10分間固定します。次に、Triton X 100 1体積あたり0.1%の体積で細胞を20分間透過させます。その後、1体積あたり3%の重量BSAをサンプルに60分間加えます。

反応性でないタンパク質結合部位をブロックするには、抗β 3チューブリンでサンプルを摂氏4度で一晩標識します。翌日、適切な二次抗体を用いて、暗所で細胞を90分間インキュベートします。その後、細胞核をDAP Eで10分間標識します。

次に、少なくとも20倍対物レンズを使用して、落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡でサンプルをイメージングします。二次抗体に応じて顕微鏡フィルターを選択し、細胞核を視覚化するためのDAPIフィルターを選択します。このステップでは、2グラムの溶質を10ミリリットルのDMSOに溶解することにより、onic F1 27の体積あたりの重量20%の原液を調製します。

onic F1 27の溶液を摂氏40度で20分間加熱して、溶解度を高めます。アナロインキュベーションの3日目に、バランスの取れた塩溶液を準備します。次に、細胞分化培地を取り出し、BSS溶液と交換します。

5マイクロモルのインフルエンザ、DMSO中の午前4:00、オンF1 27ストック溶液の体積あたり0.1%の重量で補充されます。その後、レーザーをシングルモード光ファイバーで結合し、先端を切断します。標準的な手法を使用します。

得られたチップを光学顕微鏡で観察し、チップが平らでファイバー軸に対して垂直であることを確認します。次に、標準のパワーメーターで出力レーザーパワーを測定します。次に、光伝送ファイバを光ファイバホルダに挿入し、マイクロポジショナーに貼り付けます。

その後、オシロスコープを信号発生器に接続します。光変調を監視するため。可変周波数とパルス長のバイナリ信号を使用します。

次に、レーザーを接続し、変調信号を顕微鏡のTTL入力として使用します。アルゴンイオンレーザーを使用して、内部化されたインフルエンザoh 4:00 AM色素と同期レーザーddeを励起します。エンドサイトースナノロッドを励起するには、細胞を倒立共焦点顕微鏡の下に置き、透過照明モードで光送達ファイバーを標的細胞から離して配置します。

次に、ターゲットのビーム半径を計算します。40 x 対物レンズを使用して室温でサンプルのイメージングと制御を実行し、ラウンドトリップモードでフレーム解像度 256 x 256 ピクセルで時系列スキャンを収集します。次に、レーザーDIO励起なしで記録を行い、ベースラインのアルゴンイオンレーザー干渉を特定するために、ここに示されているのは、分化したNG1 0 8 15ロアル細胞のエピ蛍光画像であり、単独で培養し、7.5ワットの平方センチメートルのレーザー出力を照射したものです。

そして、これは金ナノロッドで培養した細胞に1.25ワット四方センチメートルのレーザーパワーを照射した画像です。これは、インフルエンザoh 4:00 AMカルシウムインジケーターをロードした分化したNG1 0 8 15ニューロン細胞の例です。画像は、40 x 油浸対物レンズを備えた倒立共焦点顕微鏡を使用して撮影されました。

この図は、レーザー誘起カルシウム変動の代表的なサンプルを時間の関数として示しています。NG 1 0 8 15では、神経細胞を無血清条件で3日間、ポリスチレンスルホン酸金ナノロッド、金ナノロッド、およびナノロッドなしで培養しました。F maxがF zeroを超えると、NG 1 0 8 15ニューロン細胞で検出される最大蛍光の増加を示します。

この技術は、ニューロン細胞の光学シミュレーションにおける将来の応用への道を開きました。