転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

この実験では、転写産物の3つの主要な非翻訳領域を介して転写後制御メカニズムを調節する化合物の化学ライブラリをスクリーニングします。まず、標的遺伝子の3つの主要な非翻訳関心領域を特定します。この3プライムUTRをEl luciferase control reporterプラスミドにクローニングして、El luciferase three prime UTRキメラ転写産物を作製します。

その後、安定して。2つのプラスミドを疾患に関連する細胞株に統合し、96でキメラ転写産物を運ぶ細胞に播種します。ウェルプレートは、それらを化合物のライブラリーで24時間処理し、その後、ルシフェラーゼ活性に影響を与える分子を特定します。

選択した分子をチェリーピックしてさらなるバリデーションスクリーニングを行い、次に、コントロール細胞とルシフェラーゼ3プライムUTRキメラ転写産物を保有する細胞の両方をチェリーピックライブラリーサブセットで処理します。化合物の効果が3つの主要な非翻訳領域を介して媒介されるのか、それとも他のベクター配列を介して媒介されるのか、結果は区別されます。ほとんどのレポーターベースのスクリーニングエッセイとは異なります。

転写制御に焦点を当てたアッセイは、細胞ベースのアッセイで、3つのプライムおよび翻訳領域を介してmRNA転写レベルを調節する化合物の同定に焦点を当てています。安定してトランスフェクションされた神経芽細胞腫細胞をトリプシンアジアンで採取します。細胞をミリリットルあたり5番目の細胞の10の2倍の濃度に希釈します。

27枚のプレートに10%FBSと1%L-グルタミンを含むRPMIで。少なくとも250ミリリットルの細胞懸濁液を調製し、リキッドハンドリング、トラフデッドボリューム、および繰り返しのピペッティングステップを考慮に入れます。次に、細胞懸濁液を滅菌リザーバーに注ぎ、ロボットの机の上に置きます。

バーコード付きの白いフラットを9つロードします。ロボットデスクの上の底部96ウェルプレートと200マイクロリットルの滅菌ピペットチップの箱。細胞懸濁液を混合し、75マイクロリットルの細胞を9つのプレートの各ウェルに分注します。

プレートを覆い、エッジの影響を最小限に抑えるために、細胞をウェルの底に30分間沈殿させます。次に、9つのプレートすべてを摂氏37度と二酸化炭素5%に置き、24時間インキュベートします。同様に、残りのプレートを一度に9枚ずつ進めます。

化合物ライブラリープレートを室温で解凍します。1つのトラフに滅菌PBSを充填し、もう1つのトラフに0.5%DMSOのPBS溶液を充填し、ロボットデスクに置きます。ライブラリプレートごと。

それに応じて準備し、ラベルを付けます。希釈プレート1枚。次に、カラムの各ウェル、希釈プレートの2〜11に398マイクロリットルの滅菌PBSを充填します。

次に、カラム1と12に、滅菌PBS中の0.5%DMSOの50マイクロリットルを充填します。次に、2つの希釈プレートをセットします。ロボットデスクには、ライブラリープレート2枚、50マイクロリットルの滅菌チップが入ったボックス2個、セルプレート6枚が置かれています。

次に、細胞プレートを取り出し、対応する希釈プレート内の2つのライブラリープレートのうちの1つから10ミリモルストック溶液の2マイクロリットルをピペットで取り出し、よく混合します。同じヒントセットを使用します。50マイクロモル希釈液の3マイクロリットルを、細胞を含む3つのバーコード付き白色96ウェルプレートに移します。

チップの全セットを交換し、2 番目のライブラリプレートに対してセル誘導を繰り返します。培養物を覆い、24時間インキュベートします。次に、残りのライブラリープレートに対して化合物の希釈と細胞誘導プロセスを繰り返します。

選択した再構成ルシフェラーゼ試薬を室温で平衡化します。ルシフェラーゼリザーバーをロボットの机の上に置き、試薬を注ぎます。インキュベーターから9枚のプレートを誘導培養物から取り出します。

それらをロボットの机の上に置き、蓋を開けて室温まで平衡化します。次に、プレート間のウェルごとに50マイクロリットルのルシフェラーゼ試薬を追加します。1枚のプレートの発光読み取り時間に等しい遅延を導入します。

30分間のインキュベーション後。まず、プレートのバーコードを記録して、対応するデータファイルに関連付ける必要があります。次に、最初のプレートをルミノメーターに置き、ルミネセンスを測定します。

短い振とうステップの後、誘導のすべてのプレートの発光測定値を繰り返します。その後、残ったルシファーレース試薬を回収し、マイナス20°Cで保存します。一次スクリーニングの実験データが処理されたら、ヒットを選択して、カウンタースクリーニングチェリーによる化合物特異性を確認します。

選択したヒットを選択し、新しいスクリーニングプレートのレイアウト(コントロールの位置を含む)を作成します。次に、単一の2Dバーコードチューブに保存されたアリコートから、新しいHIITプレートを作成します。スクリーニングについても同じプロトコルに従います。

各安定細胞株の96ウェルプレートを3枚調製します。翌日、細胞をライブラリー化合物で処理します。各hiプレートを使用して、CHP 1 34 mickenの3つのプレート、3つのプライムUTR、および24時間で2マイクロモルの作業濃度でコントロールセルを備えた3つのプレートを治療します。

すべてのCHP 1 34プレート、3つのプライム非翻訳およびコントロールセットのルシフェラーゼ活性を測定します。一次スクリーニングのデータ解析と同様に、処理済みウェルからの実験データを、プレートビヒクルで処理したコントロールの平均に正規化します。次に、テストされた各コンパウンド計算の反復の平均と標準偏差を計算します。

CHP 1 34 McIn 3 prime UTRとCHP 1 34におけるルシフェラーゼ活性の倍率変化。制御セルは、1.5より大きい任意のフルチェンジカットオフと0.01未満の有意性のP値を選択します。この実験では、マイクとがん遺伝子の3つの主要なUTRを介して発揮される転写後制御メカニズムの潜在的なモジュレーターのための2000化合物ライブラリをスクリーニングし、25の代表的なライブラリプレートのうちの1つのルシフェラーゼシグナルの結果を処理したビヒクルの割合として表示しました。

コントロールは、大部分の化合物が3つの主要なUTRに明らかな影響を誘発しなかったことを示しています。ヒットは、ルシフェラーゼ活性を20%未満に低下させる化合物が、化合物の顕著な細胞毒性を示す可能性が最も高いすべてのアッセイ値について平均値と標準偏差が計算された場合に選択されました。このグラフは、WX、Y、およびZと命名された4つの選択された化合物のカウンタースクリーニングの代表的な結果を示しています。両方の化合物WおよびXは、倍率変化差およびT検定で示されるように、癌遺伝子の3プライムUTRレポーターからのルシフェラーゼ発現の増加

化合物Xは、CHP 1 34対照細胞の正規化されたルシフェラーゼシグナルによって示されるように、ある程度の細胞傷害活性を示しますが、化合物Yも化合物Zも2マイクロモル濃度では、ルシフェラーゼレベルに対する3つの主要なUTR依存性効果を示しません。化合物Yによる治療後の一次スクリーニングで検出されたルシフェラーゼ活性の低下は、むしろ細胞毒性の結果です。.化合物Zの場合、ルシフェラーゼ活性の増加は、ウイルスプロモーターの3つの主要なUTR活性化に関して非特異的であることによるものです。

このハイスループットアッセイでは、コントロールセットと非翻訳セットの両方で同等のアップレギュレーションが観察されるため、コントロール細胞の一次熱を検証することは、プロモーターを介して動作する化合物と、3つの主要な非翻訳領域を通じて真に作用する化合物を区別するために重要であることを忘れないでください。