オートファジーの解析で

本手順の目的は、糸状菌においてオートファジーを誘導し、観察することです。まず、少量の栄養培地に胞子または少量の菌糸片を接種します。次に、ガラス製顕微鏡スライドのキャビティ内で飢餓パッドを作製し、そこに接種物を移します。

最終ステップでは、オートファジーを誘導するために、飢餓パッドを湿潤チャンバー内でインキュベートします。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて目的の蛍光マーカータンパク質の液胞への移行をモニタリングすることで、オートファジーを追跡できます。この手法は、オートファジープロセスを調節する新規化合物の同定など、細胞生物学分野における重要な課題の研究に役立ちます。

飢餓実験の準備として、目的のP cresa菌株を緑米で保持している場合は、まず、菌糸に覆われた米粒2〜3粒を1.5 µL遠心チューブに入れ、500 µLの酵母エキスグルコース増殖培地（GG培地）をチューブに満たします。次に、チューブを30秒間ボルテックスし、米から胞子を分離させ、室温で1日間インキュベートします。翌日、胞子懸濁液を滅菌した水道水で1:50に希釈し、十分に混合します。P cryogenが寒天培地で保持されている場合は、この手順を省略してください。

ピペットチップを用いて、菌糸の小さな断片を、400 µLの滅菌した水道水と約100 mgのガラスビーズが入った1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。次に、菌糸が断片化されるまで、チューブを2分間ボルテックスします。飢餓パッド（starvation pad）でPCE遺伝子を培養するには、まずホットプレートを約60 °Cに加熱します。

次に、2 gのarosを100 mLの水道水に加え、得られた溶液が完全に透明になるまで電子レンジで加熱し、その後arosが約60 °Cまで冷却されるまで待ちます。サンプルごとに1.5 mLマイクロ遠心チューブを用意し、400 µLの滅菌水道水または化合物溶液を分注します。その後、加熱プレートを用いて、チューブと顕微鏡スライドを少なくとも60秒間温めます。

60 °Cに加温したaros 400 µLをすべてのチューブに分注し、各チューブの全量を800 µLにします。チューブを短時間ボルテックスした後、早期の凝固を防ぐため、チューブを再びホットプレートに戻します。次に、適切なaros溶液140 µLを各顕微鏡スライドのキャビティにピペッティングします。気泡が入らないように注意しながら、すぐにカバーガラスでarosを平坦にし、スライドを約4分間静置します。

室温でアガロースパッドが凝固したら、親指または人差し指を使用してカバーガラスを慎重にスライドさせ、顕微鏡スライドとパッドをウェットチャンバーに入れます。次に、あらかじめ調製したP er genum 5 µLを飢餓パッドの中央にピペットで滴下し、乾燥をさらに防ぐためウェットチャンバーをプラスチック袋で包みます。この際、ボックスを動かしすぎたり、培養物を乱したりしないよう注意してください。その後、サンプルを分析するまで、接種物を室温で少なくとも20時間保存します。

翌日、スライドを乾いたティッシュペーパーに移し、各飢餓パッドに50 µLの水を与えます。カバーガラスを用いて余分な水を押し出し、新しいティッシュペーパーで除去してください。その後、各スライドについて20倍の対物レンズを使用し、菌糸成長の概観を撮影します。

Hy-FiにおけるGFPの局在を評価します。63倍または100倍の対物レンズで画像を開いてください。最後に、次回の実験時間まで、観察ごとにスライドをウェットチャンバーに戻してください。

これらの画像に示されているように、培養20時間におけるペルオキシソームの分解を評価するために、G-F-P-S-K-L-P Creo Genum株を使用しました。液胞内にGFPは観察されず、それらのオルガネラの肥大も見られませんでした。しかし、増殖40時間後には、一部の菌糸にGFPで標識された液胞が視認でき、オートファジーの活性化が示唆されました。さらに、60時間後にはGFP蛍光の観察と液胞の肥大が認められました。

本実験では、p caressa Genumのdelta 80 G one変異体を陰性コントロールとして使用しました。未処理のG-F-P-S-K-L株で観察されたように、陽性コントロールとしてオートファジー刺激剤であるラパマイシンを使用しても、培養60時間後であっても液胞の拡大およびGFPは見られなかったことに注意してください。GFP標識された液胞は培養40時間後に視認できるようになり、60時間までにはHy-Fiが巨大なGFP含有液胞で完全に満たされました。

このビデオを視聴することで、メンティス真菌におけるオートファジーの解析方法について十分に理解できるはずです。